Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết nhằm phân tích một số đặc điểm hình thái, giải trình tự gen rbcL để xác định tên khoa học của cây Đinh lăng trổ; mẫu lá Đinh lăng trổ được thu thập ở vườn Dược liệu Trường Đại học Tây Đô.
Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 08 - 2020 XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY ĐINH LĂNG TRỔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN RBCL Đỗ Văn Mãi, Thiều Văn Đường, Vũ Thị Bình, Nguyễn Phú Lộc Trần Công Luận * Khoa Dược - Điều dưỡng, Trường Đại học Tây Đô (Email: dvmai@tdu.edu.vn) Ngày nhận: 10/01/2020 Ngày phản biện: 10/3/2020 Ngày duyệt đăng: 15/4/2020 TÓM TẮT Dựa vào hình thái thực vật khó phân biệt loài chưa đủ sở khoa học để định danh loài số loài thực vật có hình thái giống Trong tài liệu thuốc, tên khoa học Đinh lăng trổ xác định dựa vào hình thái thực vật Polyscias guilfoylei (Cogn.&Marche) Bail., thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) Mục tiêu nghiên cứu đề tài nhằm phân tích số đặc điểm hình thái, giải trình tự gen rbcL để xác định tên khoa học Đinh lăng trổ Mẫu Đinh lăng trổ thu thập vườn Dược liệu Trường Đại học Tây Đô Kết giải trình tự đoạn gen rbcL Đinh lăng trổ có tương đồng trình tự gen (100%) loài Polyscias guilfoylei (Cogn.&Marche) Bail cơng bố ngân hàng liệu Do phương pháp giải trình tự ADN dựa đoạn gen rbcL xác định tên khoa học Đinh lăng Polyscias guilfoylei (Cogn.&Marche) Bail thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) Kết giúp khẳng định tên khoa học Đinh lăng trổ định danh dựa sở phân loại theo hình thái thực vật trước Từ khóa: ADN, Đinh lăng trổ, Polyscias guilfoylei, trình tự gen Trích dẫn: Đỗ Văn Mãi, Thiều Văn Đường, Vũ Thị Bình, Nguyễn Phú Lộc Trần Công Luận, 2020 Xác định tên khoa học đinh lăng trổ phương pháp giải trình tự gen RBCL Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô 08: 157-166 *TTUT.PGS.TS Trần Công Luận, Hiệu trưởng - Trưởng Khoa Dược Điều dưỡng, Trường Đại học Tây Đơ 157 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Đinh lăng thuộc chi Polyscias, giới có khoảng 159 loài, chủ yếu phân bố Châu Phi, Châu Á nhiệt đới, New Guinea, Thái Bình Dương (trừ Australia New Zealand ) Cây Đinh lăng có nguồn gốc Thái Bình Dương, lần đầu phát đảo Polynésie (Nguyễn Văn Đạt, Trần Thị Phương Anh, 2015) Theo điều tra Trung tâm Sâm Việt Nam tỉnh phía Nam, Đinh lăng có lồi: Polyscias fruticosa (L) Harm, Polyscias balfouriana Bailey, Polyscias filicifolia (Merr et Fourn ) Bailey, Polyscias guilfeylei var lacinita Bailey, Polyscias guilfeylei (Cogn et Marche) Bail., Polyscias scutellarie (N.L.Burn) Fosberg (Nguyễn Thượng Dong ctv., 2007) Cây Đinh lăng thuộc họ Nhân sâm đưa vào Dược điển Việt Nam sử dụng từ lâu y học Phương Đông với tác dụng bổ dưỡng, trị suy nhược thể, chữa ho, kiết lỵ, cảm sốt, mụn nhọt, thông tiểu tiện, tiêu hóa kém, phụ nữ sau sanh sữa … (Võ Văn Chi, 2012) Với nhiều công dụng sử dụng rộng rãi y học cổ truyền Việt Nam, Đinh lăng quan tâm phát triển qui mô công nghiệp cung cấp nguyên liệu cho công ty dược phẩm Tuy nhiên, trước chủ yếu loài Đinh lăng xẻ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) nghiên cứu nhiều tìm Số 08 - 2020 thấy thành phần hoạt chất saponin cao, có cơng dụng làm thuốc Trong năm gần môt số nghiên cứu tìm thấy số hợp chất saponin quan trọng loài Đinh lăng trổ (Nguyễn Thị Ánh Tuyết, 2007; 2009) nên hướng cho lồi Đinh lăng Vì vậy, việc xác định tên khoa học để cung cấp số liệu cho nghiên cứu cần thiết Việc xác định tên khoa học Đinh lăng, với hình thái bên ngồi có nhiều điểm tương đồng, thơng qua phân tích đặc điểm hình thái, so sánh với khóa phân loại thực vật phân tích ADN so sánh với ADN gốc ngân hàng gen Hiện nay, Đinh lăng trổ xác định dựa vào đặc điểm hình thái, chưa có sở khoa học chứng minh nguồn gốc Vì vậy, nghiên cứu nhằm xác định xác tên khoa học Đinh lăng trổ dựa kết giải trình tự gen ADN lồi này, từ bổ sung thơng tin góp phần phát triển dược liệu ĐBSCL VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Mẫu non tươi Đinh lăng trổ trồng vườn Dược liệu Trường Đại học Tây Đô thu thập để chiết phân tích ADN, giải trình tự gen 158 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đơ Số 08 - 2020 Hình Lá Đinh lăng trổ Hóa chất ly trích ADN: CTAB Buffer (2% CTAB, 100 mM Tris pH 8.0, 20 Mm EDTA pH 8.0, 1.4 M NaCl), β-mercaptoethanol, Chloroform: Isoamylalcohol (24:1), Enzyme RNase, Isopropanol, ethanol (70%) Tất hóa chất dùng thí nghiệm có nguồn gốc từ công ty Merck, Đức cải tiến, phận mơ tả bao gồm: thân, lá… Hóa chất PCR điện di: PCR Mix (NEXpro, Korea), PCR 2X MasterMix, agarose tinh khiết, thuốc nhuộm GelRed, TAE 1X, Loading dye 6x, Ladder kb plus (Thermo Scientific, USA), TE, nước tinh (nước cất lần qua trùng Cân 100 mg mẫu cho vào cối tiến hành nghiền mịn mL dung dịch CTAB 2X ủ 65 oC 15 phút Cho thêm CTAB, chuẩn lên vạch 1,5 mL vào mẫu nghiền Trộn ly tâm 13000 vòng 10 phút Sau ly tâm xong, hút tuýp 1000 µL lớp dịch bên cho vào tuýp Sau thêm vào 10 µL β-mercaptoethanol/tuýp Tiến hành ủ nhiệt độ 65 oC 60 phút (mỗi 10 phút trộn mẫu lần) Tiếp theo cho thêm vào tuýp 500 µL chloroform, trộn ly tâm 13000 vòng 10 phút Hút 750 µL phần dung dịch bên cho vào tuýp mới, sau tiếp tục thêm vào 500 µL chloroform, trộn ly tâm 13000 vòng 10 phút Chuyển 550 µL dung dịch bên cho vào tuýp mới, sau thêm 500 µL chloroform vào tuýp ly tâm 13000 vòng 10 phút Rút 350 µL lớp dịch bên cho 2.2.2 Tách chiết tổng số ADN tinh ADN toàn phần tách từ tươi theo quy trình tách chiết phương pháp CTAB cải tiến (Doyle and Doyle, 1990) o 121 C 20 phút) Thiết bị: Điện di ATTO CORPORATION AE 7344, máy điện di gel Polyacrylamide ATTA Compact PAGETwin (ATTA, Nhật), máy PCR GeneAmp PCR System 2700 (Amplied Biosystems – Malaysia), máy đọc gel tia UV (BioBlock Scientific, Pháp) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp mơ tả hình thái Quan sát mơ tả hình thái bên ngồi Đinh lăng Dựa vào phương pháp Nguyễn Nghĩa Thìn (2006) có 159 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 08 - 2020 vào tuýp mới, sau thêm µL RNase vào tuýp, lắc ủ mẫu nhiệt độ 37 oC Sau ủ mẫu, tiếp tục thêm 300 µL CTAB 2X 500 µL chloroform vào tuýp Đem mẫu ly tâm 13000 vòng 10 phút Tiếp theo rút tuýp 400 µL lớp dịch bên cho vào tuýp mới, đồng thời thêm 400 µL isopropanol (tỉ lệ 1:1), trộn ủ lạnh nhiệt độ -20 oC 30 phút Đem mẫu ly tâm 13000 vòng phút, phần kết tủa lắng tụ bên thêm 500 µL ethanol 70% vào tuýp ly tâm 13000 vòng phút để rửa mẫu, sau đổ bỏ phần cồn chừa lại kết tủa Thêm tiếp tục 500 µL ethanol 70% vào tuýp để rửa mẫu lần hai ly tâm 13000 vòng phút Sau đổ bỏ phần cồn phơi khô mẫu quạt trần Cuối thêm vào tuýp 30 µL TE (pH = 8.0) để hòa tan ADN trữ lạnh nhiệt độ -20 oC F primer, μL 10 μM RBCL R primer, 10 μL Platinum™ GC Enhancer, μL ADN, 0.4 μL Platinum™ II Taq Hot-Start ADN Polymerase, dung dịch nước lên đến 50 μL 2.2.3 Khuếch đại ADN phản ứng PCR Sản phẩm PCR làm kit Wizard SV Gel PCR Clean-up System (Promega) Sau tinh sạch, sản phẩm PCR gửi đến công ty Phù Sa Biochem để giải mã theo phương pháp Sanger (Sanger et al., 1977) Đoạn gen rbcl dài 600 bp Đoạn trình tự ADN khuếch đại sử dụng cặp mồi rbcLa-F: 5’-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3’ (Levin et al., 2003) rbcLa-R: 5’-GTAAAATCAAGTCCACCRCG-3’ (Kress and Erickson, 2007) Thành phần phản ứng: Phản ứng PCR thực theo quy trình kit Platinum II Taq Hot-Start ADN Polymerase (Invitrogen, USA), phản ứng thực 50 μL bao gồm 10 μL 5x platium buffer, μL 10 mM dNTP mix, μL 10 μM RBCL Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR: Thực 35 chu kỳ gia nhiệt, bao gồm phút 95 oC, 30 giây 95 oC, 30 giây 60 oC, 30 giây 72 oC, kéo dài chuỗi phút 72 oC sản phẩm trữ 10 oC 20 phút 2.2.4 Điện di ADN gel agarose ADN sau ly trích tinh sẽ kiểm tra cách điện di gel agarose 1% Sau điện di, gel nhuộm thuốc nhuộm redsafe (Biobasic, UK), ghi nhận kết 2.2.5 Tinh sản phẩm PCR giải trình tự 2.2.6 Phân tích số liệu so sánh trình tự ADN Trọng lượng phân tử tính tốn phần mềm Gel Analyzer Kết giải trình tự lưu trữ dạng FASTA phân tích phần mềm BioEdit phiên cập nhật 7.0.5 (Hall, 1999) Sau sử dụng phương pháp BLAST hệ thống ngân hàng gene 160 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) dùng cho việc nhận diện loài KẾT QUẢ 3.1 Đặc điểm hình thái Đinh lăng trổ Cây Đinh lăng trổ nhận diện đặc điểm hình thái cách quan sát Kết cho thấy dạng bụi cao – m Lá có mùi thơm, phân nhánh, màu lục sáng thường trổ với bìa trắng, kép Số 08 - 2020 lần lông chim đặn; phụ xoan hay hình bánh bò, có hay xẻ, phụ chót to; chét thn, có khơng đều, chét cuối thường lớn Cuống ngắn to có sọc hay có đốm, ơm thân Thân có đốm (Hình 2) Kết hình thái Đinh lăng trổ tương tự mơ tả Phạm Hồng Hộ (2003) Võ Văn Chi (2012) với mô tả sơ lược đặc điểm phụ xoan, có thưa nhọn thường trổ trắng phía bìa (a) (b) (d) (e) (c) Hình Hình thái Đinh lăng trổ (a) Cành mang lá; (b) Thân, cành, lá.; (c) Thân bẹ lá; (d) Thân; (e) Lá già; (f) Lá non 161 (f) Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 08 - 2020 (mồi xuôi mồi ngược) điện di so sánh với thang ladder chuẩn 1000 bp Kết cho thấy kích thước đoạn trình tự thu vào khoảng 600 bp (Hình 4) Vạch sản phẩm băng điện di đậm, rõ nét, nguyên vẹn không bị đứt gãy nên đủ điều kiện thực bước tinh để giải trình tự 3.2 Ly trích ADN phản ứng PCR ADN tổng số sau trích điện di gel agarose 1% cho vạch ADN rõ, băng điện di sạch, khơng lẫn ARN (Hình 3) ADN tổng số sau thực phản ứng khuếch đại với đoạn mồi rbcL Hình Điện di ADN tổng số Hình Điện di sản phẩm PCR * Trình tự đoạn gen rbcL Mẫu ADN sau giải trình tự thu 546 bp có 540 bp rõ (Hình 5), đưa vào để so sánh với trình tự cơng bố, tỷ lệ G-C 42 %, tỷ lệ A-T 58 % Công cụ NCBI/Blast sử dụng để so sánh kết trình tự mẫu nghiên cứu với trình tự cơng bố ngân hàng gen giới Kết cho thấy trình tự gen thu tương đồng với trình tự lồi Polyscias guilfoylei (Cogn.&Marche) Bail (mã hiệu ngân hàng gen: JX887627.1) công bố với số nucleotid tương đồng 540/540 (tương ứng tỷ lệ tương đồng 100%) Hình Kết giải trình tự đoạn gen RBCL mẫu đinh lăng máy ABI 3100 (Applied Biosystem, USA) đọc phần mền Bioedit 162 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đơ Số 08 - 2020 Hình So sánh trình tự đoạn gen rbcL mẫu nghiên cứu với trình tự lồi cơng bố giới Kết trình bày Hình thể trình tự đoạn gen rbcL mẫu nghiên cứu với trình tự lồi cơng bố giới Trong đó, Query trình tự mẫu nghiên cứu Sbjct trình tự lồi Polyscias guilfoylei (Cogn.&Marche) Bail cơng bố ngân hàng gen giới (mã hiệu ngân hàng gen: JX887627.1) Kết giải trình tự gen so sánh trình tự gen Đinh lăng trổ với trình tự gen loài Polyscias guilfoylei (Cogn.&Marche) Bail (taxonomy ID: txid46407) sở tin cậy để khẳng định tên khoa học Đinh lăng trổ trồng vườn Dược liệu Trường Đại học Tây Đô, Thành phố Cần Thơ là: Polyscias guilfoylei 163 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô (Cogn.&Marche) Bail thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) THẢO LUẬN Do loài thuộc chi Polyscias đặt tên khác trước không công bố rộng rãi nên lồi lại có nhiều tên khác Bên cạnh đó, vào đặc điểm thực vật để phân loại gặp số trở ngại số lồi có hình thái giống nhau, khó khăn phân biệt hai lồi khác Ngun nhân đặc điểm hình thái lồi khác không nhiều dễ nhầm lẫn quan sát Ngoài ra, trường hợp khác loài sống điều kiện mơi trường khác nhau, có thay đổi hình thái để thích ứng điều kiện mơi trường Vì vậy, để góp phần hỗ trợ xác định tên khoa học loài Đinh lăng trổ, ngồi phương pháp phân tích đặc điểm hình thái thực vật, sử dụng ADN mã vạch, phương pháp tiên tiến sử dụng thành cơng định danh lồi giới tiến hành giám định ADN mẫu Thực vậy, ứng dụng rbcL ADN mã vạch thành công định danh nhiều loại thực vật nghiên cứu định danh loài sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus K Komatsu, S Zhu & S Q Cai) (Nguyễn Thị Phương Trang ctv., 2016), hay thành công dùng để nhận diện loài hỗn hợp loại cậy mẫu Gần đây, nhóm nghiên cứu người Đức dùng rbcL ADN mã vạch để phân loại họ Dipterocarpaceae Sumatra, Indonesia (Carneiro et al., 2019) Đối với Đinh lăng trổ, lần đầu tiên, phương pháp giám định Số 08 - 2020 phân tích ADN mã vạch sử dụng để giám định tên khoa học Sau chiết xuất, phân tách ADN giải trình tự gen mẫu Đinh lăng, cho kết trình tự gen So sánh trình tự đoạn gen rbcL với trình tự gen cơng bố lồi Polyscias guilfoylei (Cogn.&Marche) Bail cho thấy có trùng khớp đến 100% Do đó, nghiên cứu xác định tên lồi Polyscias ADN, phương pháp có độ tin cậy tính chọn lọc cao KẾT LUẬN Bằng phương pháp ADN mã vạch kết hợp với đặc điểm hình thái cho thấy Đinh lăng trổ có tên khoa học Polyscias guilfoylei (Cogn.&Marche) Bail thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) Kết giúp nhận định xác tên khoa học đối tượng nghiên cứu phương pháp ADN mã vạch Kết khẳng định định danh Đinh lăng trổ Phạm Hoàng Hộ (2003) số tác giả trước TÀI LIỆU THAM KHẢO Carneiro D.M.C., Brambach, F., Jair H.B.K., Krutovsky, K V., Kreft, H., Tjitrosoedirdjo, S S., Gailing, O (2019) Integrating DNA Barcoding and Traditional Taxonomy for the Identification of Dipterocarps in Remnant Lowland Forests of Sumatra Plants, 8(11), 461 Doyle J.J and Doyle J.L., 1990 Isolation of Plant DNA from fresh tissue Focu, vol 12(6), pp 13 – 15 Hall T.A., 1999 BioEdit: a userfriendly biological sequence alignment 164 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô editor and analysis program for Windows 95/98/NT Nucl Acids Symp Ser Vol 41, pp.95-98 Kress W.J and Erickson D.L, 2007 A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding rbcLa gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region PLoS One, vol 6, pp.1-10 Levin R.A., Wagner W.L., Hoch P.C., Nepokroeff M, Pires J.C, Zimmer E.A, Sytsma K.J , 2003 Family-level relationships of Onagraceae based on chloroplast rbcLa and ndhF data American Journal of Botany, vol 90, pp.107-115 Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận Nguyễn Thị Thu Hương, 2007 Sâm Việt Nam số thuốc họ Nhân sâm NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr 293 Nguyễn Văn Đạt Trần Thị Phương Anh, 2015 Đặc điểm hình thái chi họ ngũ gia bì Việt Nam Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 6, tr 6975 Nguyễn Nghĩa Thìn, 2006 Các phương pháp nghiên cứu thực vật NXB Giáo dục Nguyễn Thị Ánh Tuyết, Nguyễn Ngọc Sương, Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007 Chemical examination of Polyscias guilfoylei Bail family Số 08 - 2020 Araliaceae, Tuyển tập cơng trình Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Hố hữu tồn quốc lần thứ tư Nhà xuất Đại học quốc gia Hà Nội Tr 561-564 10 Nguyễn Thị Ánh Tuyết,, Nguyễn Thuý Anh Thư, Nguyễn Thuý Hằng, Nguyễn Ngọc Sương, Nguyễn Kim Phi Phụng (2009) Oleanane saponins from Polyscias guilfoylei Bail (Araliaceae) Tạp chí Phát triển Khoa Học Công nghệ, ĐHQG TP HCM Tr 21-28 11 Nguyễn Thị Phương Trang, Nguyễn Thị Hồng Mai, Zhuravlev Yury N., Reunova Galina D., 2016 Giải mã trình tự gen rbcl, RPOB sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus K Komatsu, S Zhu & S Q Cai) sâm Ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) làm sở so sánh khoảng cách di truyền Tạp chí sinh học, 39(1), tr 80-85 12 Phạm Hoàng Hộ, 2003 Cây cỏ Việt Nam, tập NXB Trẻ, Hà Nội, tr 516 – 518 13 Sanger S., Nicklen S., and Coulson A.R, 1977 DNA sequencing with chain-terminating inhibitors Proc Natl Acad Sci U S A, vol 74 (12), pp 5463–5467 14 Võ Văn Chi, 2012 Từ điển thuốc Việt Nam, Tập NXB Y học Hà Nội, tr 937-938 165 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 08 - 2020 SEQUENCE-BASED CLASSIFICATION OF POLYSCIAS GUILFOYLEI (COGN.&MARCHE) BAIL BY USING RCBL GENE Do Van Mai, Thieu Van Duong, Vu Thi Binh, Nguyen Phu Loc and Tran Cong Luan Faculty of Pharmacy and Nursery, Tay Do University (Email: dvmai@tdu.edu.vn) ABSTRACT The scientific name of “Dinh lang" has been determined based on plant morphology, as Polyscias guilfoylei (Cogn.&Marche) Bail., belongs to the Araliace family However, it may be not sufficient to classify species only based on plant morphology DNA sequence is a well established technique for species classification in combination with plant morphology The objectives of this study were to analyse the morphological characteristics and using DNA sequenced rbcL to confirm the scientific name of “Dinh lang tro" Plant samples were collected from the medicinal garden of Tay Do University The results showed that the genomic sequence of "Dinh lang tro" plant was similar to the genetic sequences of Polyscias guilfoylei (Cogn.&Marche) Bail in the gene bank with identity of 100% Thus by using DNA sequencing method, the scientific name of "Dinh lang tro" was certified as Polyscias guilfoylei (Cogn.&Marche) Bail., belongs to the Araliace family Based on this result, the scientific name of this plant was confirmed as It was classified earlier by using plant morphology Keywords: DNA sequencing, Polyscias guilfoyle (Cogn.&Marche) Bail, plant morphology 166 ... hàng gen Hiện nay, Đinh lăng trổ xác định dựa vào đặc điểm hình thái, chưa có sở khoa học chứng minh nguồn gốc Vì vậy, nghiên cứu nhằm xác định xác tên khoa học Đinh lăng trổ dựa kết giải trình tự. .. loài Đinh lăng trổ (Nguyễn Thị Ánh Tuyết, 2007; 2009) nên hướng cho lồi Đinh lăng Vì vậy, việc xác định tên khoa học để cung cấp số liệu cho nghiên cứu cần thiết Việc xác định tên khoa học Đinh lăng, ... Sbjct trình tự lồi Polyscias guilfoylei (Cogn.&Marche) Bail cơng bố ngân hàng gen giới (mã hiệu ngân hàng gen: JX887627.1) Kết giải trình tự gen so sánh trình tự gen Đinh lăng trổ với trình tự gen