ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Viện công nghệ sinh học cơng nghệ thực phẩm BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC Đề tài: Xây dựng phương án tách dịng gen AmpC beta lactamase- có khả kháng kháng sinh Enterobacteriaceae Giảng viên hướng dẫn: GS Nguyễn Văn Cách Nội dung thảo luận I Gen AmpC II Quy trình phương pháp Gen AmpC Lý lựa chọn đề tài - Kháng thuốc trở thành vấn đề y tế toàn cầu đặc biệt nước phát triển Mỗi năm có hàng chục ngàn người tử vong kháng thuốc hàng chục tỷ USD cho kháng thuốc - Đáng báo động Việt Nam xuất vi khuẩn đa kháng thuốc , mức độ kháng ngày gia tăng đặc biệt nhóm gram âm WHO xếp Việt Nam vào nhóm quốc gia có tỉ lệ kháng thuốc kháng sinh cao giới - Vì vậy, đề tài em muốn tìm kiếm đoạn mồi thích hợp cho việc tách dịng khuếch đại gen kháng kháng sinh AmpC Enterobacteriaceae nhằm mục đích nghiên cứu khả kháng kháng sinh vi khuẩn gram âm Gen AmpC AmpC β-Lactamase cephalosporinase quan trọng lâm sàng mã hóa nhiễm sắc thể nhiều loại Enterobacteriaceae số sinh vật khác, chúng trung gian kháng với cephalothin, cefazolin, cefoxitin, hầu hết penicillin Ở nhiều vi khuẩn, enzyme AmpC cảm ứng biểu mức độ cao đột biến Sự biểu mức gây đề kháng với cephalosporin phổ rộng bao gồm cefotaxime, ceftazidime ceftriaxone vấn đề đặc biệt bệnh nhiễm trùng Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae, chủng phân lập ban đầu dễ bị kháng tác nhân Vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae ) - Truy cập: NCBI/taxonomy/Enterobacteriaceae - Ta phát sinh hay dịng dõi Crambe maritima https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543 Quy trình phương pháp Tìm kiếm thơng tin NCBI Bước 1: Tìm kiếm sở liệu NCBI Đường dẫn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Tìm kiếm thơng tin NCBI Tiếp theo bước 1, Truy cập: NCBI/nucleotide/AmpC gene Tìm kiếm thơng tin NCBI Sau ta lựa chọn báo để tiến hành chạy Clustal Omega Để tìm báo phù hợp ta click vào phần taxonomy hình để xem dịng dõi đề cập báo Ưu tiên thuộc họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae ) Chọn Taxonomy Sử lý tìm vùng bảo thủ clustal omega Bước 2: Tìm vùng bảo thủ Tìm báo có liên quan báo Copy đoạn gen ngơn ngữ FASTA vào chương trình Clustal omega Đường dẫn: https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ Tìm vùng bảo thủ Clustal omega Copy gene ngơn ngữ FASTA Chọn DNA Tìm vùng bảo thủ Clustal omega Sau Sau ấn “submit” kết Đã xuất vùng bảo thủ Thiết kế đoạn mồi BLAST - primer Bước 3: Thiết kế đoạn mồi Vì mẫu X08081.1 mẫu chi với đối tượng cần tách gen nên chọn mạch － làm mạch khuôn để thiết kế mồi Sau thử nhiều đoạn khác em định lựa chọn: Lựa chọn vùng để thiết kế đoạn mồi xuôi từ nu thứ 215 đến nu thứ 240 25 nu Thiết kế đoạn mồi BLAST - primer Sau thử nhiều đoạn khác em định lựa chọn: Lựa chọn vùng để thiết kế đoạn mồi xuôi từ nu thứ 465 đến nu thứ 495 30 nu Thiết kế đoạn mồi BLAST – primer Sử dụng chương trình Primer-BLAST Đường dẫn: Lựa chọn vùng để tạo https://www.ncbi.nlm.nih.gov/too mồi xuôi , ngược ls/primer-blast/ Lựa chọn độ dài sản phẩm PCR Lựa chọn nhiệt độ gắn mồi Thiết kế đoạn mồi BLAST – primer Thiết kế đoạn mồi BLAST – primer Chạy PCR ảo Sequence Manipulation Suite: PCR products Bước 4: Chạy PCR ảo Chọn khuôn ảo đoạn khuôn X07274.1 Đường dẫn: https://www.bioinformati cs.org/sms2/pcr_products html Kết chạy PCR ảo Em sử dụng đoạn mồi thứ tìm phần trước Đối với đoạn mồi cịn lại chạy kết đoạn mồi có nhiều ưu điểm như: -Có độ dài lớn đoạn mồi lại giúp bắt cặp xác -Đoạn nhân lên có dung lượng lớn cặp mồi khác, có độ bao phủ tốt -Tỉ lệ GC ngưỡng ổn -Tỉ lệ tự bắt cặp tương đồng mồi Sử dụng công cụ BLAST NCBI để kiểm tra kết Bước 5: Sử dụng BLAST để kiểm tra đặc tính sản phẩm sau PCR ảo Dán đoạn sản phẩm sau PCR ảo Kết BLAST Kết nhận có độ tương đồng khoảng 100% - 99,0% Trong tất báo có tương đồng vs gen AmpC Enterobacteriaceae Chức chủ yếu gen AmpC kháng với cephalothin, cefazolin, cefoxitin, hầu hết penicillin Kết luận Kết luận - Sản phẩm sau PCR có khả cao biểu tính trạng ta thấy có nhiều báo có độ tương đồng từ 99% - 100% Kết thí nghiệm để tham khảo mang tính ảo nên để kết luận xác ta cần phải thực thực tế để thu mẫu khảo sát xem mẫu biểu tính trạng hay khơng Cảm ơn thầy bạn lắng nghe! ... mồi thích hợp cho việc tách dòng khuếch đại gen kháng kháng sinh AmpC Enterobacteriaceae nhằm mục đích nghiên cứu khả kháng kháng sinh vi khuẩn gram âm Gen AmpC AmpC β -Lactamase cephalosporinase... USD cho kháng thuốc - Đáng báo động Việt Nam xuất vi khuẩn đa kháng thuốc , mức độ kháng ngày gia tăng đặc biệt nhóm gram âm WHO xếp Việt Nam vào nhóm quốc gia có tỉ lệ kháng thuốc kháng sinh cao... thảo luận I Gen AmpC II Quy trình phương pháp Gen AmpC Lý lựa chọn đề tài - Kháng thuốc trở thành vấn đề y tế toàn cầu đặc biệt nước phát triển Mỗi năm có hàng chục ngàn người tử vong kháng thuốc