Ứng dụng tin sinh học tách dòng gene mã hóa enzyme natokinase đối tượng giả định vi khuẩn bacillus NỘI DUNG • Tìm thơng tin gene cần tách dòng sử dụng CSDL trực tuyến • • Xác định vùng bảo thủ sử dụng CSDL trực tuyến phần mềm Clustal Omega • ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, • Thiết kế mồi phần mềm Primer • ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, • Thực phản ứng PCR ảo chương trình, dự đốn tính chất protein • Xây dựng phương án tách dịng gene TÌM KIẾM THƠNG TIN VỀ NATTOKINASE TÌM THƠNG TIN VỀ GENE CẦN TÁCH DỊNG TRÊN CSDL TRỰC TUYẾN • Đối tượng : gene mã hóa protein nattokinase • Truy cập: https://www.ncbi.nlm.nih gov • Từ khóa: nattokinase, cloning nattokinase, expression nattokinase • Tìm hiểu thơng tin protein nattokinase, gene mã hóa, Ảnh: ví dụ kết tìm kiếm Nguồn ảnh b: He Ni Peng-Cheng et.al, 2016 Thông tin nattokinase • Nattokinase enzyme thuộc họ serine protease • Được tìm thấy Bacillus subtilis canh trường đậu tương lên men Nhật Bản • Có chức sinh học việc ngăn chặn cục máu đông sử dụng loại thuốc điều trị bệnh tim mạch có khả hịa tan sợi thrombi • Gene coding cho nattokinase gene aprN gồm khung đọc mở ORF gồm 1146 nu, mã hóa cho chuỗi preprotein( chuỗi aa tín hiệu, chuỗi aa pro peptide, 275 aa protein trưởng thành, nặng 27.7 kDa, pI 6.6) • Chuỗi tín hiệu có chức dẫn đường cho enzyme ngoại bào • Chuỗi pro-sequence có tác dụng chaperone nội bào, có chức hỗ trợ cuộn gấp xác enzyme trưởng thành • Được biểu B subtilis E.coli • Một số chủng Bacillus sử dụng B amyloliquefaciens,  B licheniformis,  B subtilis, and B amylosacchariticus Bộ gene chủng thiết kế cho protease bị chức thiếu hệ thống protease (extracellular-proteasedefcient B subtilis system ) XÁC ĐỊNH VÙNG BẢO THỦ Tìm kiếm genome mang gene mã hóa protein nattokinase Cơng cụ : CSDL NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleoti de So sánh để tìm vùng bảo thủ Công cụ: Clustal Omega https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clus talo/ XÁC ĐỊNH VÙNG BẢO THỦ-1 •Bước 1: truy cập https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide, tìm kiếm với từ khóa nattokinase •Kích vào đường dẫn để xem thông tin: ngày công bố, nơi thực hiện, nguồn gốc chủng, canh trường nuôi cấy để bước đầu xác định quan hệ gần gũi chủng vi khuẩn có chủng lấy làm khn thiết kế mồi •Kích vào FASTA để xem trình tự nu •Lựa chọn nhiều có thể, trình tự, chép vào fle word định dạng fasta Chú ý: ưu tiên lựa chọn complete cds Các đoạn gene lựa chọn >KY576911.1 Bacillus subtilis strain MX6 nattokinase (aprN) gene, complete cds >KJ174339.1 Bacillus subtilis strain MTCC 1427 nattokinase (aprN) gene, complete cds >KF734090.1 Bacillus subtilis subsp natto strain jap10 nattokinase gene, complete cds >FJ376817.1 Bacillus subtilis subsp natto strain Tangshan nattokinase gene, complete cds >FJ374767.1 Bacillus subtilis subsp natto strain MBS 04-6 nattokinase (aprN) gene, complete cds >JN392072.1 Bacillus subtilis strain LSSE-22 nattokinase (aprN) gene, complete cds … XÁC ĐỊNH VÙNG BẢO THỦ-2 Bước 2: • Truy cập https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/cl ustalo/ để vào phần mềm Clustal Omega • Đưa trình tự lựa chọn vào, set thơng số mong muốn theo hướng dẫn • Cho chương trình chạy để xem kết Kết xác định vùng bảo thủ Vùng bảo thủ Vùng phân li Vùng bảo thủ vùng có nhiều dấu bên dưới, dùng làm vùng thiết kế mồi THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR ẢO • Thực phản ứng PCR với mồi sở liệu • Cơng cụ: SMS PCR insilico PCR • https://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_products.ht ml • http://insilico.ehu.es/PCR/ CHẠY THỬ BỘ MỒI BẰNG SMS PCR truy cập: https://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_produc ts.html nhập trình tự nhập mồi xuôi mồi ngược Kết quả: Cho trình tự nên mồi đặc hiệu Kết chạy PCR ảo (sử dụng cho dự đoán protein) >>960  bp  product  from  linear  template  KY576911.1  Bacillus  subtilis strain MX6 nattokinase (aprN) gene, complete cds, base  267  to  base  1226  (T7  ­  T3).  TGCCGGAAAAAGCAGTACAGAAAAGAAATACATTGTCGGATTTAAGCAGACAATGAGTGC  CATGAGTTCCGCCAAGAAAAAGGATGTTATTTCTGAAAAAGGCGGAAAGGTTCAAAAGCA  ATTTAAGTATGTTAACGCGGCCGCAGCAACATTGGATGAAAAAGCTGTAAAAGAATTGAA  AAAAGATCCGAGCGTTGCATATGTGGAAGAAGATCATATTGCACATGAATATGCGCAATC  TGTTCCTTATGGCATTTCTCAAATTAAAGCGCCGGCTCTTCACTCTCAAGGCTACACAGG  CTCTAACGTAAAAGTAGCTGTTATCGACAGCGGAATTGACTCTTCTCATCCTGACTTAAA  CGTCAGAGGCGGAGCAAGCTTCGTTCCTTCTGAAACAAACCCATACCAGGACGGCAGTTC  TCACGGTACGCATGTCGCCGGTACGATTGCCGCTCTTAATAACTCAATCGGTGTTCTGGG  CGTAGCGCCAAGCGCATCATTATATGCAGTAAAAGTGCTTGATTCAACAGGAAGCGGCCA  ATATAGCTGGATTATTAACGGCATTGAGTGGGCCATTTCCAACAATATGGATGTTATCAA  CATGAGCCTTGGCGGACCTTCTGGTTCTACAGCGCTGAAAACAGTAGTTGATAAAGCGGT  TTCCAGCGGTATCGTCGTTGCTGCCGCAGCCGGAAACGAAGGTTCATCCGGAAGCACAAG  CACAGTCGGCTACCCTGCAAAATATCCTTCTACTATTGCAGTAGGTGCGGTAAACAGCAG  CAACCAAAGAGCTTCATTCTCCAGCGTAGGTTCTGAGCTTGATGTAATGGCTCCTGGCGT  GTCCATCCAAAGCACACTTCCTGGAGGCACTTACGGCGCTTATAACGGAACGTCCATGGC  GACTCCTCACGTTGCCGGAGCAGCAGCGCTAATTCTTTCTAAGCACCCGACTTGGACAAA CHẠY THỬ MỒI BẰNG INSILICO • Truy cập: http://insilico.ehu.es/PCR/ • Lựa chọn lồi vi khuẩn, nhập trình tự mồi, cho phép sai lệch Bước 1: chọn loài vi khuẩn Bước 2: nhập trình tự mồi chọn chi vi khuẩn Giao diện kết Kết trình bày dạng điện di kết chuỗi khuếch đại DỰ ĐỐN TÍNH CHẤT CỦA PROTEIN • Xác định protein tạo từ sản phẩm PCR • Cơng cụ: BlastX ExPASy • https://blast.ncbi.nlm.nih gov/Blast.cgi • https://web.expasy.org/tr anslate/ • Phân tích cấu trúc protein để xác định tính chất • Cơng cụ: CSDL NCBI ExPASy DỰ ĐỐN TÍNH CHẤT PROTEIN BẰNG CSDL NCBI • Truy cập: https://blast.ncbi.n lm.nih.gov/Blast.cgi (cơng cụ blast đoạn gene sang protein) • Nhập thông số mong muốn vào ô nhập liệu đầu vào Kết • Lựa chọn trình tự khớp 100 %, dựa vào cấu trúc protein để dự đốn cấu trúc protein quan tâm • Chọn vào phần gạch chân mục Accession để xem số thông tin protein Thông tin protein Chọn GRAPHIC CDD search result để xem rõ thông tin chức vùng gene Kết cho thấy: Protein có cấu trúc tương tự nhưu ezyme nattokinase, có hai vùng: - Vùng inhibitor I9: hoạt động chaperone để cuộn gấp protein Vùng peptidase_S8_subtilisin_subset: mang chức enzyme, chứa trung tâm hoạt động Như bị thiếu chuỗi tín hiệu Trình tự chuỗi protein dự đoán: AGKSSTEKKYIVGFKQTMSAMSSAKKKDVISEKGGKVQKQFKYVNAAAATLDEKAVKELKKDPSVAYVE EDHIAHEYAQSVPYGISQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLNVRGGASFVPSETNPYQDG SSHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLDSTGSGQYSWIINGIEWAISNNMDVINMSLGGPS GSTALKTVVDKAVSSGIVVAAAAGNEGSSGSTSTVGYPAKYPSTIAVGAVNSSNQRASFSSVGSELDVM APGVSIQSTLPGGTYGAYNGTSMATPHVAGAAALILSKHPTWT XÂY DỰNG PHƯƠNG ÁN TÁCH DỊNG Dựa vào thơng tin protein chuỗi nucleotide khuấy đại, xây dựng phương án tách dịng gene Cơng cụ sử dụng: Phần mềm pDRAW32 https://www.acaclone com/ Quy trình tách dịng Thực phản ứng PCR để nhân đoạn gene cần tách dòng Chu trình PCR: 94°C/4′ 35 chu kì: 94°C/45″ 54°C/1′ 72°C/1′ 72°C/10′ Thực trình tái tổ hợp Biến nạp vào tế bào Sàng lọc dòng tế bào mang vecto biến nạp Nuôi cấy tế bào tái tổ hợp để thu sản phẩm Sử dụng phần mềm pDRAW32 để thiết kế vecto tách dòng Giao diện phần mềm pDRAW32 Thiết kế thêm trình tự cắt nối vào mồi • Tế bào chủ để biến nạp tách dịng Bacillus subtilis strain WB800 • Để thuận tiện cho việc cắt nối bổ sung trình tự cắt nối:  Eco RI  Xho I vào đầu 5’ mồi xuôi mồi ngược • Vecto tách dòng sử dụng pTZ57R/T Forward primer(5’-3’) GAATTCTGCCGGAAAAAGCAGTACAGA Reverse primer(5’-3’) CTCGAGTTTGTCCAAGTCGGGTGCTT • Để quan sát chi tiết cấu trúc vecto tách dòng, truy cập đường dẫn: https://www.snapgene.com/resources/pla smidfles/?set=ta_and_gc_cloning_vecto rs&plasmid=pTZ57R_T Tài liệu tham khảo: 1.Cloning and enhancing production of a detergent- and organic-solvent-resistant nattokinase from Bacillus subtilis VTCC-DVN-12-01 by using an eight-protease-genedefcient Bacillus subtilis WB800 , Thao Thi Nguyen , Thi Dinh Quyen and Hoang Thanh Le http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html 3.Giáo trình tin sinh học, GS.TS Nguyễn Văn Cách, nhà xuất Khoa Học Kĩ Thuật, 2003 ... phản ứng PCR ảo chương trình, dự đốn tính chất protein • Xây dựng phương án tách dịng gene TÌM KIẾM THƠNG TIN VỀ NATTOKINASE TÌM THƠNG TIN VỀ GENE CẦN TÁCH DỊNG TRÊN CSDL TRỰC TUYẾN • Đối tượng. .. KHN • Trong trường hợp vi khuẩn, vi? ??c xác định dựa đặc điểm canh trường nuôi cấy, thời gian địa điểm, để xác định quan hệ gần gũi cần xác định thêm tiến hóa vi khuẩn nhờ vào giải trình tự 16S RNA,... xác định vùng bảo thủ Vùng bảo thủ Vùng phân li Vùng bảo thủ vùng có nhiều dấu bên dưới, dùng làm vùng thiết kế mồi THIẾT KẾ MỒI • Lựa chọn genome gần gũi với đối tượng cần tách dịng vi khuẩn bacillus