HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN DUY HƯNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LỒI, TÍNH GÂY BỆNH VÀ KHẢ NĂNG PHÒNG CHỐNG NẤM Colletotrichum spp GÂY BỆNH THÁN THƯ ỚT TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG Chuyên ngành : Bảo vệ thực vật Mã số : 9620112 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2020 Cơng trình hồn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn: PGS.TS Hà Viết Cường TS Hoàng Chúng Lằm Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Văn Viết Viện Nghiên cứu Phát triển Nafoods Phản biện 2: GS.TS Phạm Xuân Hội Viện Di truyền Nông nghiệp Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Thị Mão Trường Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện Họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện Lương Định Của, Học viện Nông nghiệp Việt Nam PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cây ớt (Capsicum sp) thuộc chi Capsicum, họ cà (Solanaceae) có xuất xứ từ Mehico, Goatemala từ trung tâm khởi nguyên Đơng Nam Á Trong nhóm trồng thuộc họ cà (Solanaceae), ớt có tầm quan trọng thứ hai sau cà chua Ngày nay, ớt trồng rộng rãi toàn giới từ 55o vĩ độ bắc đến 55o vĩ độ nam Đồng sông Hồng (ĐBSH) vùng sản xuất ớt hàng hóa tập trung lớn nước ta Theo Tổng cục thống kê, đến năm 2017 diện tích trồng ớt ĐBSH đạt 5.049 sản lượng 79.640 Hiện nay, ớt xem trồng quan trọng, mang lại hiệu kinh tế cao cho người sản xuất Cũng nhiều trồng khác, ớt bị công nhiều dịch hại Trong số dịch hại ớt, nấm Colletotrichum spp (gây bệnh thán thư) xem nguy hiểm (Than et al., 2008a) Tại Hàn Quốc, Ấn Độ, Thái Lan bệnh làm giảm từ 10 - 80% suất, cá biệt bang Ohio, Mỹ bệnh làm giảm gần 100% suất ớt (Kumar, 2014; Sheu, 2013; Than et al., 2008a) Tại Việt Nam, tất vùng trồng ớt tập trung bị bệnh thán thư phá hại nặng Cho tới năm 2008, thành phần loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt công bố giới đa dạng, bao gồm lồi C gloeosporioides, C capsici, C acutatum, C coccodes, C dematium, C nigrum C atramentarium Thành phần loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt quốc gia, vùng khác khác Đến nay, có nhiều kết nghiên cứu loài ghi nhận song nhiều điều cần nghiên cứu thêm trình lây bệnh mối quan hệ phức hợp loài (Than et al., 2008a) Tại Việt Nam, trước thực đề tài này, loài C acutatum, C capsici, C gloeosporioides, C nigrum công bố gây bênh thán thư ớt (Don et al., 2007; Ngơ Bích Hảo, 1991, 1992) Việc định danh nấm Colletotrichum hại ớt (cũng lồi Colletotrichum khác) dựa vào đặc điểm hình thái (màu sắc, tốc độ phát triển cấu trúc tản nấm; hình dạng, kích thước bào tử phân sinh, đĩa áp ) có nhiều nhầm lẫn Nguyên nhân đặc điểm hình thái lồi Colletotrichum có phụ thuộc cao vào điều kiện mơi trường (Hyde et al., 2009a) Theo Weir et al (2012) Damm et al (2012a) C gloeosporioides C acutatum thực chất phức hợp lồi, C gloeosporioides gồm 23 lồi khác C acutatum gồm 31 lồi khác Đối với nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt, nghiên cứu phân loại gần đây, dựa phân tích phân tử, cho thấy có thay đổi lớn thành phần lồi so với cơng bố trước Tại Ấn Độ, định danh lại 52 mẫu nấm C gloeosporioides sensu lato (s.l) cho thấy chúng thuộc loài C fructicola C siamense (Sharma & Shenoy, 2013) Tại Thái Lan, loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt xác định C gloeosporioides sensu stricto (s.s), C siamense, C acutatum C truncatum (Suwannarat et al., 2017) Tại Trung Quốc, phân tích trình tự mẫu nấm Colletotrichum thu 29 tỉnh xác định 15 lồi có lồi phổ biến C fioriniae, C fructicola, C gloeosporioides s.s, C scovillei C truncatum (Diao et al., 2017) Xác định xác thành phần định danh nấm Colletotrichum có vai trị quan trọng khơng mặt khoa học mà cịn thực tiễn quản lý bệnh quan hệ nấm với ký chủ tính mẫn cảm với thuốc hóa học khác theo loài Kim et al (2004) cho thấy C acutatum C gloeosporioides nhiễm ớt giai đoạn phát triển thường không gây bệnh thân Trái lại C coccodes C dematium gây hại chủ yếu thân ớt, đặc biệt Các loài Colletotrichum có tính gây bệnh khác theo giai đoạn phát triển ớt Chẳng hạn, C capsici gây hại phổ biến ớt chín đỏ, C acutatum C gloeosporioides gây hại phổ biến ớt xanh chín (Hong & Hwang, 1998; Kim et al., 1999) Hiện tại, việc phòng trừ bệnh thán thư hại ớt sản xuất chủ yếu thuốc hóa học, chưa thu hiệu mong muốn Nguyên nhân chủ yếu là: (i) thiếu thông tin đầy đủ, cập nhật xác thành phần lồi Colletotrichum gây bệnh, đặc biệt tiêu chí phân loại chi nấm thay đổi nhanh chóng; (ii) thiếu thơng tin đặc điểm sinh học loài/ kiểu gây bệnh nấm Colletotrichum phổ biến nhất, quan trọng tính gây bệnh giống ớt phản ứng với thuốc trừ nấm khác Việc xác định thông tin có vai trị quan trọng sở khoa học chủ yếu để đề xuất biện pháp kỹ thuật nhằm phòng chống hiệu bệnh thán thư hại ớt Việt Nam 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 1.2.1 Mục đích Xác định thành phần loài đánh giá số đặc điểm sinh học chủ yếu nấm Colletotrichum hại ớt ĐBSH 1.2.2 Yêu cầu - Đánh giá trạng gây hại bệnh thán thư ớt ĐBSH - Xác định thành phần, mức độ phổ biến phương pháp chẩn đốn nhanh lồi nấm Colletotrichum hại ớt ĐBSH - Xác định tính gây bệnh lồi nấm Colletotrichum phát ớt ĐBSH - Đánh giá hiệu lực số thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng dịch chiết địa y lồi Colletotrichum phát điều kiện in vitro 1.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu Bệnh thán thư gây hại ớt nấm Colletotrichum spp gây 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu Đề tài tập trung nghiên cứu thành phần lồi, số đặc tính sinh học, tính gây bệnh số biện pháp phịng chống nấm Colletotrichum spp điều kiện in vitro 1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đã xác định loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt ĐBSH số tỉnh gồm C truncatum, C gloeosporioides s.s, C siamense, C fructicola C aeschynomenes Ngoại trừ loài C truncatum, lồi nấm cịn lại phát thấy gây hại ớt Việt Nam lần Trong loài nấm phát hiện, C siamense loài phổ biến (51,9%), loài khác: C fructicola (21,2%), C truncatum (15,4%), C gloeosporioides s.s (9,6%) C aeschynomenes (1,9%) Đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu phục vụ chẩn đốn lồi Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt gồm C gloeosporioides s.s, C fructicola, C siamense C truncatum Ngoài ra, hồn thiện phương pháp chẩn đốn nhanh lồi nấm Colletotrichum kỹ thuật PCR Đã xác định bào tử loài nấm C siamense C truncatum có khả nảy mầm, hình thành đĩa áp, xâm nhập trực tiếp qua tầng cutin, trì trạng thái ngủ nghỉ/ nội sinh sau xâm nhập khơng gây triệu chứng ớt tới tuần sau lây nhiễm Đây phát vị trí tồn nguồn bệnh thán thư ớt Ngồi ra, kết giúp giải thích lý bệnh thán thư ớt lại gặp đồng ruộng lây nhiễm nhân tạo khơng dẫn tới hình thành vết bệnh 1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1 Ý nghĩa khoa học đề tài Các kết nghiên cứu đề tài cung cấp thơng tin cập nhật xác phân loại, đặc điểm sinh học tính gây bệnh nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt Định danh xác lồi Colletotrichum hại ớt có ý nghĩa khoa học quan trọng, đóng góp vào trạng phân loại lại lồi Colletotrichum giới Đặc tính xâm nhiễm nấm Colletotrichum ớt xác định luận án đóng góp vào hiểu biết chung mối quan hệ sinh học nấm Colletotrichum ký chủ 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Hiện nay, bệnh thán thư nguyên nhân quan trọng cản trở sản xuất ớt Việt Nam Xác định không biểu triệu chứng nguồn bệnh quan trọng để tiếp tục gây hại giúp điều chỉnh kỹ thuật phịng chống phù hợp, cần trọng phòng trừ bệnh từ giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng Các kết nghiên cứu phòng trừ phịng thí nghiệm tiền đề để lựa chọn thuốc hóa học phù hợp để giảm thiểu mức độ gây hại bệnh đồng ruộng PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT ỚT TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM Đến năm 2018, diện tích trồng ớt giới đạt 1,99 triệu ha, suất bình quân đạt 18,47 tấn/ha sản lượng đạt 36,77 triệu Châu Á xem trung tâm lớn sản xuất ớt giới, chiếm 69% sản lượng ớt toàn cầu Hiện nay, Trung Quốc quốc gia sản xuất ớt lớn giới với sản lượng chiếm 49% sản lượng toàn cầu (FAOSTAT, 2020) Ở nước ta, đến năm 2017 diện tích trồng ớt nước đạt 43.807 ha, suất bình quân đạt 13,72 tấn/ha sản lượng đạt 579,92 nghìn ĐBSH vùng sản xuất ớt hàng hóa tập trung lớn khu vực phía Bắc bốn vùng sản xuất ớt hàng hóa tập trung nước Diện tích trồng ớt vùng đạt 5.049 ha, suất trung bình đạt 15,8 tấn/ sản lượng đạt 79,64 nghìn (Tổng cục Thống kê, 2018) 2.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU Ở NƯỚC NGOÀI 2.2.1 Tầm quan trọng bệnh thán thư Bệnh thán thư ớt công bố lần New Jersey (Mỹ) vào năm 1890 Halsted công bố khắp nước trồng ớt giới Các lồi nấm Colletotrichum spp gây bệnh hầu hết phận ớt, nhiên bệnh có ý nghĩa quan trọng Hiện nay, bệnh xem đối tượng có ý nghĩa kinh tế quan trọng ớt tất nước Tại Hàn Quốc, Ấn Độ, Thái Lan bệnh làm giảm từ 10 - 80% suất, cá biệt bang Ohio, Mỹ bệnh làm giảm gần 100% suất ớt (Kumar, 2014; Sheu, 2013; Than et al., 2008a) 2.2.2 Phân loại nấm Colletotrichum Colletotrichum (họ Glomerellaceae, Sordariomycetidae, lớp Sordariomycetes, ngành Ascomycota (Sutton et al., 1992) chi nấm lớn, có lịch sử phân loại phức tạp trải qua nhiều giai đoạn Tên nấm Colletotrichum giới thiệu lần Corda vào năm 1837 Từ thời điểm có nhiều nghiên cứu khác phân loại nấm Tuy nhiên, đến nghiên cứu phân loại nấm Colletotrichum dựa vào đặc điểm hình thái tạo nhiều sai lầm phụ thuộc cao đặc điểm hình thái vào điều kiện mơi trường nên phân tích phân tử xem chuẩn vàng phân loại nhóm nấm Hiện nay, vùng gen ITS, MAT loạt gen khác ứng dụng phân loại nấm Colletotrichum (Sreenivasaprasad et al., 1992; Cannon et al., 2000; Hyde et al., 2009a; Damm et al., 2012a, 2014; Weir et al., 2012; Cannon et al., 2012 …) 2.2.3 Thành phần nấm Colletotrichum gây hại ớt Thành phần loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt công bố giới đa dạng nhiều tác giả đề cập Don et al (2007); Than et al (2008a, 2008b); Ko et al (2011); Suwannarat et al (2017); Diao et al (2017); De Silva et al (2017a) … 2.2.4 Một số loài nấm Colletotrichum gây hại ớt Các đặc điểm hình thái, phạm vi ký chủ lồi, phức hợp lồi nấm Colletotrichum gây hại ớt nhiều tác giả nghiên cứu đề cập Cannon et al (2008); Damm et al (2009); Prihastuti et al (2009); Yang et al (2009); Weir et al (2012); Liu et al (2017) … 2.2.5 Xâm nhiễm gây bệnh nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt Quá trình xâm nhiễm gây bệnh nấm Colletotrichum nhiều tác giả nghiên cứu De Silva et al (2017b); Munch et al (2008); O'Connell et al (2012); Wharton & Diéguez-Uribeondo (2004) 2.2.6 Khả truyền qua hạt ớt nấm Colletotrichum Khả truyền qua hạt ớt nấm Colletotrichum nhiều tác giả đề cập Nik et al (1988); Than et al (2008a); Hemannavar et al (2009); Chigoziri & Ekefan (2013) … 2.2.7 Đặc điểm sinh thái nấm Colletotrichum gây bệnh ớt Các đặc điểm sinh thái (nhiệt độ, ẩm độ, khả tồn …) đề cập tác giả Pring et al (1995) Than et al (2008a) 2.3 PHÒNG CHỐNG NẤM Colletotrichum TRÊN ỚT Nghiên cứu biện pháp phòng chống nấm Colletotrichum gây hại ớt nhiều tác giả đề cập Mahasuk et al (2009a); Hasyim et al (2014); Ranasingh et al (2010); Yadav et al (2014); Rashid et al (2015); Mongkolporn (2019) … 2.4 NHỮNG NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC Các nghiên cứu thành phần loài, đặc điểm hình thái, quy luật phát sinh, gây hại … số loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt Việt Nam nghiên cứu đề cập tác giả Ngơ Bích Hảo (1991, 1992, 1993) Trần Tú Ngà & cs (1993) Một số kết nghiên cứu biện pháp phòng trừ bệnh thán thư nấm Colletotrichum gây hại ớt số tác giả đề cập Trần Nguyễn Hà & cs (2005); Trần Thị Thu Thủy & cs (2010); Nguyễn Thị Liên & cs (2016); Phạm Đình Dũng & cs (2017) Tóm lại: Bệnh thán thư nấm Colletotrichum gây đối tượng có ý nghĩa kinh tế quan trọng ớt tất nước Đến thời điểm giới có nhiều nghiên cứu chi tiết thành phần lồi, tính gây bệnh biện pháp phịng trừ cụ thể cho loài nấm Tuy nhiên, đến nước ta chưa có nghiên cứu mang tính hệ thống lĩnh vực bệnh thán thư hại ớt Chính vậy, việc triển khai nghiên cứu vấn đề cần thiết PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.1.1 Vật liệu Mẫu bệnh thán thư thu thập giống ớt trồng phổ biến sản xuất Giống ớt sử dụng lây bệnh nhân tạo gồm: Demon, Lai 20, Chìa vơi Sussan’ Joy 3.1.2 Thiết bị, dụng cụ - Thiết bị nghiên cứu: máy PCR, kính hiển vi, tủ lạnh bảo quản mẫu, tủ định ôn, nồi hấp khử trùng, buồng nuôi cấy vi sinh, v.v - Dụng cụ nghiên cứu: Pipet tự động đầu côn, buồng đếm hồng cầu, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy nấm, lamen, lam kính, đèn cồn v.v 3.1.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu Điều tra, thu thập mẫu bệnh thực tại tỉnh thuộc ĐBSH số tỉnh khác Thái Nguyên, Bắc Giang, Sơn La Tiền Giang Nghiên cứu phòng thực Trung tâm Bệnh nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Viện Nghiên cứu Rau Đề tài thực từ năm 2015 đến năm 2019 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Điều tra đánh giá tác hại thu thập mẫu bệnh thán thư ớt - Xác định thành phần loài nấm Colletotrichum hại ớt ĐBSH số tỉnh - Nghiên cứu số đặc điểm sinh học, tính gây bệnh lồi nấm Colletotrichum phát - Đánh giá hiệu lực số thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng loài Colletotrichum phát điều kiện in vitro 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Phương pháp điều tra theo QCVN 01-38: 2010/BNNPTNT - Phân lập nấm theo qui trình Cai et al (2009) Bảo quản mẫu nấm theo phương pháp Abd-Elsalam et al (2010) - Phương pháp chiết DNA mẫu nấm thực theo Doyle & Doyle (1987) Wang et al (1993) - Định danh mẫu nấm thực cặp mồi: ITS4 & ITS5 (White et al., 1990) AM-F & AM-R (Silva et al., 2012) - Mồi đặc hiệu thiết kế dựa trình tự gen cơng bố lồi chuẩn (Cannon et al., 2012; Damm et al., 2012a, 2012b; Weir et al., 2012) Các trình tự lựa chọn phân tích phần mềm ClustalX 2.0 (Larkin et al., 2007) - Đặc điểm tản nấm, hình dạng bào tử, đĩa áp đánh giá theo phương pháp Cai et al (2009), Than et al (2008b), Johnston & Jones, (1997) - Xác định tính gây bệnh lồi thực theo phương pháp Montri et al (2009) Than et al (2008b) Đánh giá khả tồn số loài Colletotrichum ớt thực theo phương pháp Ranathunge et al (2016) - Đánh giá khả ức chế số loại thuốc hóa học, dịch chiết địa y vi khuẩn đối kháng đến với loài nấm Colletotrichum điều kiện invitro thực theo phương pháp Gopinath et al (2006) Kumar et al (2012) Hiệu lực thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng, dịch chiết địa y tính theo cơng thức Abbott (1925) - Phân tích đa dạng thực dùng phầm mềm ClustalX 2.0 MEGA 6.0 Các số liệu thí nghiệm khác xử lý thống kê theo phương pháp phân tích phương sai phần mềm IRRISTART 5.0 kiếm BLAST so sánh trình tự, phân tích phả hệ dựa vùng ITS cho thấy tám mẫu lại gồm C1, C4, C6, C9, C14, C26, C33 (nhóm hình thái I) C29 (nhóm hình thái II) phân nhóm rõ rệt cụm phức hợp lồi C gloeosporioides s.l (hình 4.1) Chú thích: Cây xây dựng phương pháp Neighbor-Joining (NJ) Giá trị nốt giá trị thống kê boostrap dạng % (1000 lần lặp) (chỉ trình bày giá trị > ngưỡng tin cậy chung 75%) Ký tự (T) mẫu đại diện loài (Type strain) Thanh tỷ lệ khoảng cách di truyền Hình 4.1 Phân tích phả hệ dựa trình tự vùng ITS mẫu nấm Colletotrichum thuộc phức hợp lồi C gloeosporioides s.l lồi cơng bố gây bệnh thán thư ớt 11 Kết thu hồn tồn phù hợp với cơng bố Cannon et al (2012) vùng ITS không đủ để phân biệt loài thuộc số phức hợp loài C gloeosporioides s.l 4.2.1.2 Định danh phân tử loài Colletotrichum vùng liên gen ApMat Chín mẫu nấm thuộc phức hợp lồi C gloeosporioides s.l giải trình tự vùng liên gen ApMat Kết giải trình tự thu có chất lượng tốt, kích thước từ 894 đến 930 bp Chú thích: Cây xây dựng phương pháp Neighbor-Joining (NJ) Giá trị nốt giá trị thống kê boostrap dạng % (1000 lần lặp) (chỉ trình bày giá trị > ngưỡng tin cậy chung 75%) Ký tự (T) mẫu đại diện loài (Type strain) Thanh tỷ lệ khoảng cách di truyền Hình 4.2 Phân tích phả hệ dựa trình tự vùng ApMat mẫu nấm Colletotrichum thuộc phức hợp lồi C gloeosporioides s.l 12 Kết tìm kiếm BLAST cho thấy trình tự GenBank trùng khớp với mẫu C1, C6, C9 loài C fructicola, trùng khớp với mẫu C4, C33 loài C siamense, trùng khớp với mẫu C9, C26, C44 loài C gloeosporioides s.s, trùng khớp với mẫu C29 lồi C aeschynomenes Kết so sánh trình tự vùng ApMat cho thấy: Ba mẫu C9, C44, C26 có mức đồng trình tự cao, từ 98,6 - 98,8% mẫu loài C gloeosporioides s.s Hai mẫu C4, C33 có mức đồng trình tự cao, từ 98,2 - 99,7% mẫu lồi C siamense Ba mẫu C1, C6 C14 có mức đồng trình tự cao, từ 99,7 - 100% mẫu loài C fructicola Mẫu C29 có mức đồng trình tự cao, 99,3% lồi C aeschynomenes Phân tích phả hệ dựa trình tự vùng ApMat (hình 4.2) cho thấy ba mẫu C9, C44, C26 thuộc cụm loài C gloeosporioides s.s điển hình, hai mẫu C4, C33 thuộc cụm lồi C siamense điển hình, ba mẫu C1, C6, C14 thuộc cụm lồi C fructicola điển hình gần gũi với loài C aenigma C alienum Riêng mẫu C29, với mẫu loài C aeschynomenes GenBank hình thành cụm lồi đặc trưng phân biệt rõ rệt với loài khác 4.2.2 Tổng kết thành phần loài Colletotricum phát ớt đồng sông Hồng số tỉnh Kết định danh giải trình tự vùng ITS ApMat xác định thành phần loài mẫu nấm Colletotrichum thu thập ĐBSH số tỉnh gồm loài là: C truncatum, C fructicola, C siamense, C gloeosporioides s.s C aeschynomenes Trong loài xác định, ngoại trừ lồi C truncatum, lồi cịn lại loài lần phát gây hại ớt Việt Nam (hình 4.3) Nhìn chung, đặc điểm hình thái (màu sắc, cấu trúc tản nấm; hình dạng, kích thước bào tử phân sinh, đĩa áp) loài nấm phát trùng khớp với đặc điểm hình thái lồi chuẩn công bố tác giả Cannon et al (2008), Damm et al (2009), Prihattusi et al (2009) Weir et al (2012) 13 Chú thích: A - C gloeosporioides s.s (mẫu C44), B - C siamense (mẫu C4), C - C fructicola (mẫu C1), D - C aechynomenes (mẫu C29), E - C truncatum (mẫu C30) Ký tự a b mặt mặt tản nấm môi trường PDA sau cấy ngày, c d bào tử phân sinh đĩa áp Thanh bar: 10 µm Hình 4.3 Đặc điểm hình thái lồi Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt xác định đồng sông Hồng 4.2.3 Phát triển kỹ thuật PCR chẩn đoán nhanh loài nấm Colletotrichum gây hại ớt 4.2.3.1 Thiết kế mồi đặc hiệu chẩn đốn nhanh lồi Colletotrichum Dựa kết so sánh giải trình tự mẫu nấm dựa vùng ITS ApMat với mẫu chuẩn lồi cơng bố GenBank thiết kế cặp mồi đặc hiệu C.sia-F1/-R1, C.glo-F/-R, C-tru-F-/R C.fru-F1/-R1 Các cặp mồi thiết kế có tham số chất lượng mồi phù hợp với công bố hướng dẫn thiết kế mồi PCR Dieffenbach et al (1993), Judelson (2006) Rychlik et al (1990) Cụ thể: độ dài 18 - 22 nucleotide, nhiệt độ tách sợi 41,2 - 53,8oC, nhiệt độ gắn mồi 53,0 - 55,9oC, hàm lượng GC 42,9 - 57,9% Các cặp mồi dùng để xác định loài nấm C gloeosporioides s.s, C fructicola, C siamense C truncatum gây bệnh thán thư ớt 14 4.2.3.2 Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho cặp mồi thiết kế Các cặp mồi đặc hiệu tự thiết kế thử nghiệm ngưỡng nhiệt độ gắn mồi 54oC, 58oC 62oC Kết PCR cho thấy: Hai cặp mồi C.tru-F C.tru-R (đặc hiệu loài C truncatum) C.glo-F C.glo-R (đặc hiệu loài C gloeosporioides s.s) tạo vạch băng đặc hiệu đậm nhiệt độ 58oC 62oC không tạo băng sản phẩm mẫu Colletotrichum khác Cặp mồi C.fruc-F1 C.fruc-R1 (đặc hiệu loài C fructicola), tạo băng đặc hiệu rõ nét nhiệt độ 62oC không tạo băng sản phẩm mẫu Colletotrichum khác Đối với cặp mồi C.sia-F1 C.sia-R1 (đặc hiệu loài C siamense) tạo băng đặc hiệu rõ nét nhiệt độ 62oC song tạo băng không đặc hiệu mẫu C1 (C fructicola), nhiên băng phân biệt với băng đặc hiệu (hình 4.4) Như vậy, nhiệt độ gắn mồi tối ưu cặp mồi C.tru-F/-R, C.glo-F/R từ 58 - 62oC, cặp mồi C.fru-F1/-R1, C.sia-F1/-R1 62oC Chú thích: Mũi tên băng sản phẩm mong muốn cho cặp mồi Các giếng mẫu nấm xác định danh tính: C25 C30 (C truncatum), C1 C14 (C fructicola), C4 C33 (C siamense), C9 C44 (C gloeosporioides s.s), C29 (C aeschynomenes) Hình 4.4 PCR xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho cặp mồi đặc hiệu Colletotrichum 15 4.2.3.3 Tối ưu hóa phương pháp chiết DNA phục vụ chẩn đốn nhanh loài nấm Colletotrichum Kết kiểm tra PCR so sánh chiết DNA phương pháp truyền thống (CTAB) phương pháp cải biến (NaOH) cho thấy, băng PCR đặc hiệu hình thành mẫu nấm rõ tương đương phương pháp Điều chứng tỏ phương pháp chiết nhanh DNA mẫu nấm Colletotrichum NaOH thu kết tương đương với phương pháp truyền thống CTAB (hình 4.5) Chú thích: M thang DNA 100 bp (Generuler 100 bp, Thermo Scientific) với băng từ 100 - 500 bp mũi tên Các giếng mẫu nấm xác định danh tính: C25 C30 (C truncatum), C1 C14 (C fructicola), C4 C33 (C siamense), C9 C44 (C gloeosporioides s.s) Hình 4.5 Phản ứng PCR so sánh phương pháp chiết DNA từ nấm Colletotrichum với cặp mồi đặc hiệu Từ kết thu khẳng định phương pháp chiết nhanh NaOH biến đổi hoàn toàn phù hợp để chiết DNA từ mẫu nấm Colletotrichum cho phản ứng PCR Phương pháp chiết DNA cải biến có nhiều ưu điểm: (1) Cực kỳ nhanh chóng, gồm bước nghiền sợi nấm bào tử NaOH sau hịa lỗng đệm Tris; (2) giảm thiểu nhiễm chéo mẫu số bước chiết ít; (3) bảo vệ DNA khỏi bị phân hủy enzyme NaOH phân hủy nuclease giải phóng trình nghiền 4.2.4 Xác định thành phần, mức độ phân bố đa dạng loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt PCR 4.2.4.1 Xác định thành phần loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt đồng sông Hồng số tỉnh PCR Sử dụng cặp mồi thiết kế xác định thành phần loài 16 Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt thu thập ĐBSH tỉnh gồm 27 mẫu nấm loài C siamense, 11 mẫu nấm loài C fructicola, mẫu nấm loài C gloeosporioides s.s mẫu nấm loài C truncatum Riêng mẫu C29 phản ứng âm tính với cặp mồi giải trình tự vùng ApMat xác định mẫu lồi C aeschynomenes (có hình minh họa) 4.2.4.2 Phân bố mức độ đa dạng loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt đồng sông Hồng số tỉnh Trong số 52 mẫu nấm thu thập ĐBSH số tỉnh C siamense loài nấm phổ biến nhất, với 27 mẫu thu thập (chiếm 51,9%) Loài C fructicola loài nấm phổ biến thứ hai, với 11 mẫu (chiếm 21,2%) C truncatum loài nấm phổ biến thứ ba, với mẫu (chiếm 15,4%) Loài C gloeosporioides s.s loài phổ biến thứ tư, với mẫu (chiếm 9,6%) Loài C aeschynomenes phát 01 mẫu (chiếm 1,9%) (hình 4.6) Hình 4.6 Phân bố lồi Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt từ tất địa điểm (A) tỉnh đồng sông Hồng (B) Nhìn chung, mức độ đa dạng lồi Colletotrichum ĐBSH cao Trong số tỉnh thu thập mẫu, Hà Nội, Hưng Yên Hải Phòng tỉnh có thành phần lồi đa dạng có xuất loài nấm C gloeosporioides s.s, C siamense, C fructicola C truncatum tỉnh Hai tỉnh Hải Dương Thái Bình ghi nhận xuất loài nấm C siamense, C fructicola C truncatum Tỉnh Bắc Ninh xuất loài nấm C siamense, C fructicola C gloeosporioides s.s Tỉnh Nam Định xuất loài nấm C siamense C gloeosporioides s.s Tỉnh Thái Nguyên xuất loài nấm C siamense C aeschynomenes Tỉnh Tiền Giang xuất loài nấm C siamense C truncatum Các tỉnh Ninh Bình, Bắc Giang Sơn La ghi nhận xuất loài C siamense C fructicola Duy nhất, tỉnh Hà Nam ghi nhận 100% số mẫu thu thập loài C siamense 17 4.3 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, TÍNH GÂY BỆNH CỦA CÁC LOÀI Colletotrichum GÂY BỆNH THÁN THƯ ỚT ĐƯỢC THU THẬP 4.3.1 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả sinh trưởng loài nấm Colletotrichum Xác định PDA mơi trường thích hợp cho phát triển sợi nấm Tản nấm loài C gloeosporioides s.s, C siamense, C fructicola, C aeschynomenes phát triển kín đĩa (90 mm) sau ngày, lồi C truncatum sau ngày Môi trường PCA môi trường thích hợp cho việc hình thành bào tử loài nấm Colletotrichum Trong loài nấm phát hiện, loài C gloeosporioides s.s sinh bào tử nhất, lồi nấm cịn lại sinh bào tử dễ dàng Kết thu hoàn toàn phù hợp với công bố tác giả Than et al (2008a), Yang et al (2009), Chethana et al (2015), Kommula et al (2017) Su et al (2012) 4.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng lồi nấm Colletotrichum mơi trường PDA Luận án xác định nhiệt độ thích hợp cho phát triển tản nấm hình thành bào tử loài nấm Cụ thể: loài C gloeosporioides s.s phát triển tản nấm thuận lợi 25oC, bào tử hình thành mơi trường ni cấy 25 - 30oC Loài C siamense C fructicola phát triển tản nấm hình thành bào tử thuận lợi 25 - 30oC Loài C aeschynomenes phát triển tản nấm thuận lợi 25oC, bào tử hình thành thuận lợi 20 - 25oC Loài C truncatum phát triển tản nấm thuận lợi 25oC, bào tử hình thành thuận lợi 25 - 35oC 4.3.3 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng loài nấm Colletotrichum môi trường PDA Xác định loài C gloeosporioides s.s, C fructicola, C aeschynomenes C truncatum có khả sinh trưởng, phát triển, sinh bào tử thuận lợi pH 6,0 Riêng loài C siamense có khả sinh trưởng, phát triển, sinh bào tử thuận lợi khoảng pH rộng hơn, từ 5,0 - 6,0 4.3.4 Tính gây bệnh lồi Colletotrichum thu thập 4.3.4.1 Tính gây bệnh mẫu nấm đại diện cho loài ớt Trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo lồi nấm Colletotrichum khơng xuất triệu chứng bệnh ớt xanh lây phương pháp có gây tổn thương không gây tổn thương sau ngày theo dõi Triệu chứng bệnh xuất lây bệnh ớt chín lây 18 bệnh phương pháp có tổn thương Thời kỳ tiềm dục lồi nấm Colletotrichum lây bệnh ớt chín xác định 3,1 - 4,8 ngày tùy thuộc vào loài nấm giống ớt Hai loài nấm C siamense C truncatum có tỷ lệ nhiễm bệnh cao lồi cịn lại, đạt 66,7 93,3% Lồi C aeschynomenes có tỷ lệ nhiễm bệnh thấp nhất, đạt 40,0 - 53,3%, nhiên kích thước vết bệnh đạt lớn (8,1 - 13,2 mm) so với loài nấm khác (3,2 - 11,4 mm) lây bệnh giống ớt Kết phù hợp với giải thích Ahn et al (2003) công bố Noor & Zakaria (2018), Akhtra et al (2016), Ranathunge & Sandani (2016) lây nhiễm nhân tạo loài nấm Colletotrichum ớt Kết quan sát đặc điểm vết bệnh tạo sau lây nhiễm cho thấy, triệu chứng bệnh tạo khơng mang tính đặc trưng cho lồi nấm Colletotrichum khơng có giá trị chẩn đốn 4.3.4.2 Tính gây bệnh mẫu nấm đại diện cho loài số trồng hay bị nhiễm bệnh thán thư Tương tự kết thu lây bệnh nhân tạo ớt, triệu chứng bệnh không xuất sau lây nhiễm ngày loại xanh (xoài, chuối tiêu chuối tây) Triệu chứng bệnh xuất chín lây bệnh phương pháp có tổn thương Trong lồi nấm sử dụng lây bệnh, vết bệnh xuất bệnh loài nấm thuộc phức hợp loài C gloeosporioides s.l, lồi C truncatum khơng xuất bệnh loại thí nghiệm Thời kỳ tiềm dục loài nấm Colletotrichum lây bệnh loại chín xác định 3,0 - 3,7 ngày tùy thuộc vào loài nấm loại Lồi C siamense có tỷ lệ nhiễm bệnh đường kính vết bệnh sau lây nhiễm lớn số loài nấm Colletotrichum gây bệnh loại chín (xồi, chuối tiêu chuối tây) 4.3.5 Xác định khả tồn bào tử loài nấm C siamense C truncatum ớt Luận án xác định bào tử loài nấm C siamense C truncatum có khả nảy mầm, hình thành đĩa áp, xâm nhập trực tiếp qua tầng cutin, trì trạng thái ngủ nghỉ/ nội sinh sau xâm nhập không gây triệu chứng ớt sau lây nhiễm tuần (hình 4.7) Kết giúp xác định thêm vị trí tồn quan trọng nguồn bệnh đồng ruộng Ngồi ra, kết giúp giải thích bệnh thán thư ớt không quan sát thấy ngồi đồng ruộng khơng thể 19 lây nhiễm nấm dù lây bệnh phương pháp gây tổn thương Kết sở để đưa khuyến cáo phòng trừ bệnh thán thư sản xuất Để hạn chế tác hại bệnh thán thư ớt cần tiến hành phun thuốc tiêu diệt nguồn bệnh trước thời điểm chín từ - 1,5 tháng Chú thích: Các đặc điểm quan trọng mũi tên đỏ Hình 4.7 Đặc điểm bào tử nấm C siamense C truncatum bề mặt ớt giống Demon lây nhiễm phương pháp gây tổn thương 4.4 ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA MỘT SỐ THUỐC HÓA HỌC, VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG Bacillus spp VÀ DỊCH CHIẾT ĐỊA Y VỚI CÁC LOÀI Colletotrichum ĐƯỢC PHÁT HIỆN TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO 4.4.1 Ảnh hưởng số thuốc hóa học đến khả sinh trưởng, phát triển loài nấm Colletotrichum phát điều kiện in vitro Các thí nghiệm đánh giá khả ức chế sinh trưởng nảy mầm bào tử loại thuốc trừ nấm loài nấm Colletotrichum cho thấy: Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm nảy mầm bào tử đạt cao thuốc Score 250EC, tiếp đến thuốc Tiptop 250EC, thuốc Antracol 70WP thấp thuốc Azony 25SC Cụ thể, nồng độ khuyến cáo, thuốc 20 Score 250EC ức chế hoàn toàn sinh trưởng tản nấm nảy mầm bào tử loài nấm Thuốc Tiptop 250EC ức chế hoàn toàn sinh trưởng tản nấm loài C gloeosporioides s.s, C fructicola, C aeschynomenes ức chế hoàn toàn nảy mầm bào tử loài C fructicola, C aeschynomenes Trên lồi cịn lại hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm thuốc đạt 82,2 91,5% 69,1 - 70,8% với nảy mầm bào tử Hai loại thuốc cịn lại Antracol 70WP, Azony 25SC khơng ức chế hoàn toàn sinh trưởng tản nấm nảy mầm bào tử loài nấm nồng độ khuyến cáo Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm nảy mầm bào tử thuốc Antracol 70WP loài nấm đạt 46,3 - 78,5% 50,4 - 73,2% Tương tự, hiệu lực thuốc Azony 25SC với loài nấm đạt 17,8 - 50,4% 45,2 - 68,2% Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm nảy mầm bào tử loại thuốc hóa học khác loài nấm Trên tất các loại thuốc thí nghiệm, hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm nảy mầm bào tử thu loài nấm C fructicola, C aeschynomenes C gloeosporioides s.s ln cao lồi C siamense C truncatum Điều chứng tỏ lồi nấm phát hiện, lồi C truncatum C siamense có khả chống chịu với loại thuốc thí nghiệm cao lồi cịn lại 4.4.2 Ảnh hưởng số mẫu vi khuẩn đối kháng Bacillus spp đến sinh trưởng lồi nấm Colletotrichum mơi trường PDA Kết thí nghiệm mẫu vi khuẩn đối kháng cho thấy: mẫu vi khuẩn sử dụng có khả ức chế với lồi nấm thí nghiệm Hiệu lực ức chế mẫu vi khuẩn đạt 55,2 - 87,8% tùy thuộc vào mẫu vi khuẩn loài nấm Trong mẫu vi khuẩn sử dụng, hai mẫu HT1 N2 có khả ức chế cao với tất lồi nấm thí nghiệm Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm với loài nấm thí nghiệm chủng HT1 đạt 79,3 - 87,7% N2 đạt 79,2 - 84,8% Nhìn chung mẫu vi khuẩn sử dụng có khả ức chế loài nấm Colletotrichum cao rõ rệt so với công bố trước Nguyễn Thị Liên & cs (2016), Ashwini & Srividya (2014) Begum et al (2008) Đặc biệt, hai mẫu vi khuẩn HT1 N2 (đã xác định B velezensis) có hiệu lực ức chế tương đương số thuốc hóa học Các chủng vi khuẩn sử dụng rộng rãi phòng trừ bệnh thán thư ớt tiếp tục đầu tư nghiên cứu để phát triển thành sản phẩm thuốc BVTV 21 4.4.3 Ảnh hưởng số dịch chiết địa y đến sinh trưởng loài nấm Colletotrichum môi trường PDA Kết đánh giá hiệu lực loại dịch chiết địa y loài nấm C siamense C truncatum cho thấy: Hiệu lực ức chế loại dịch chiết địa y loài C siamense C truncatum không cao, đạt 21,8 - 43,3% Trong số loại dịch chiết, US hexan US metanol có hiệu lực cao nhất, đạt 42,2 - 42,3% Tuy hiệu lực ức chế khơng cao song chúng sử dụng để xử lý mầm bệnh cho giai đoạn sau thu hoạch đa số loại dịch chiết địa y có thời gian cách ly ngắn tương đối an toàn với người PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 1) Bệnh thán thư nấm Colletotrichum spp bệnh phổ biến gây hại ớt ĐBSH với tần suất phát ruộng bệnh > 25% Bệnh gây hại tất giống ớt trồng phổ biến thời vụ năm Mức độ gây hại bệnh ruộng thu lứa nặng so với ruộng thu lứa 2) Tổng số 52 mẫu nấm thán thư ớt thu thập tỉnh ĐBSH tỉnh khác phân lập từ đơn bào tử Các phân tích hình thái dựa đặc điểm bào tử phân sinh đĩa áp xác định chúng thuộc nhóm hình thái Các đặc điểm đặc trưng hình thái khơng xác định lồi nấm Colletotrichum thu thập 3) Phân tích trình tự vùng ITS mẫu nấm đại diện cho nhóm hình thái xác định lồi C truncatum phức hợp lồi C gloeosporioides s.l Phân tích trình tự vùng liên gen ApMat mẫu nấm đại diện thuộc phức hợp loài C gloeosporioides s.l xác định loài C gloeosporioides s.s, C siamense, C fructicola C aeschynomenes Tất loài lồi lần phát hiện, cơng bố Việt Nam 4) Đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu chẩn đốn lồi Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt (C gloeosporioides s.s, C fructicola, C siamense C truncatum) Ở điều kiện nhiệt độ gắn mồi tối ưu, cặp mồi chứng tỏ phát đặc hiệu loài tương ứng Đặc 22 biệt phương pháp chiết nhanh DNA từ mẫu nấm dùng NaOH đệm Tris lần đầu áp dụng nấm Colletotrichum chứng tỏ phù hợp để chuẩn bị DNA nhóm nấm cho phản ứng PCR 5) Kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu áp dụng để định danh tất 52 mẫu nấm thu thập Kết xác định thành phần loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt ĐBSH số tỉnh gồm loài, C siamense lồi phổ biến (phát thấy tất 13 tỉnh chiếm 51,9%); C fructicola loài phổ biến thứ hai (phát thấy 9/13 tỉnh, chiếm 19,5%); C truncatum loài phổ biến thứ ba (phát thấy 6/13 tỉnh, chiếm 15,4%); C gloeosporioides s.s loài phổ biến thứ tư (phát thấy 5/13 tỉnh, chiếm 9,6%); riêng loài C aeschynomenes phát mẫu Thái Nguyên, chiếm 1,9% 6) Các loài nấm Colletotrichum thu thập phát triển tản nấm thuận lợi môi trường PDA hình thành bào tử thuận mơi trường PCA Nhiệt độ thích hợp để phát triển tản nấm hình thành bào tử lồi Colletotrichum 25oC Ngoại trừ loài C siamense phát triển thuận lợi pH từ 5,0 - 6,0, lồi nấm cịn lại phát triển thuận lợi pH 6,0 7) Kết lây bệnh nhân tạo lá, xanh, chín giống ớt (Demon, Lai 20, Chìa vơi Susan’ Joy) loại (xoài, chuối tây chuối tiêu) cho thấy loài nấm tạo vết bệnh loại chín phương pháp có gây tổn thương Trên ớt chín, thời kỳ tiềm dục, tỷ lệ nhiễm kích thước vết bệnh thay đổi tùy theo tổ hợp loài nấm giống ớt Loài C truncatum gây bệnh giống ớt; loài C siamense C aeschynomenes gây bệnh giống ớt; loài C gloeosporioides s.s C fructicola gây bệnh giống ớt Triệu chứng vết bệnh tạo sau lây nhiễm không đặc trưng theo lồi khơng có giá trị chẩn đốn Trên loại chín cịn lại, thời kỳ tiềm dục, tỷ lệ nhiễm kích thước vết bệnh thay đổi tùy theo tổ hợp loài nấm loại Loài C siamense C fructicola gây bệnh loại quả; loài C gloeosporioides s.s nhiễm chuối tây chuối tiêu; loài C aeschynomenes gây bệnh xoài chuối tây Đáng ý, lồi C truncatum khơng gây bệnh loại 23 8) Xác định bào tử loài nấm C truncatum C siamense có khả nảy mầm, hình thành đĩa áp, xâm nhập trực tiếp qua tầng cutin, trì trạng thái ngủ nghỉ/nội sinh sau xâm nhập không gây triệu chứng tới tuần sau lây nhiễm Nghiên cứu xác định thêm vị trí tồn quan trọng nguồn bệnh đồng ruộng Ngoài ra, nghiên cứu giúp giải thích bệnh thán thư ớt khơng quan sát thấy ngồi đồng ruộng khơng thể lây nhiễm nấm dù phương pháp có gây tổn thương 9) Thuốc Score 250 EC (difenoconazole) Tiptop 250EC (propiconazole) có hiệu lực cao với lồi nấm Colletotrichum điều kiện phịng thí nghiệm Tại nồng độ khuyến cáo, thuốc Score 250EC ức chế hoàn toàn sinh trưởng tản nấm nảy mầm bào tử loài nấm Thuốc Tiptop 250EC đạt hiệu lực 100% loài nấm C fructicola, C aeschynomenes 69% với lồi nấm cịn lại Các lồi nấm có mức độ mẫn cảm khác với loại thuốc Trên loại thuốc thí nghiệm, hiệu lực thuốc loài C truncatum C siamense ln thấp lồi cịn lại Hai mẫu N2 HT1 (được xác định Bacillus velezensis) có khả ức chế sinh trưởng cao với loài nấm, hiệu lực đạt 79,3 - 87,8% Các loại dịch chiết dung mơi từ lồi địa y có khả ức chế sinh trưởng thấp loài nấm C siamense C truncatum Hiệu lực tối đa đạt 43,3% 5.2 KIẾN NGHỊ 1) Để phòng trừ hiệu bệnh thán thư đồng ruộng nên phun thuốc ngăn chặn nguồn bệnh tồn trước thời điểm thu hoạch lứa khoảng tháng 2) Tiếp tục thu thập, nghiên cứu xác định đặc điểm sinh học, tính gây bệnh loài Colletotrichum khác gây bệnh thán thư ớt để cung cấp đầy đủ thơng tin thành phần lồi nấm Colletotrichum gây hại ớt Việt Nam 3) Bổ sung kết nghiên cứu phương pháp phân loại, đặc điểm sinh học, tính gây bệnh loài nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt phát vào tài liệu giảng dạy chuyên ngành 24 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Duy Hưng, Hà Viết Cường, Hoàng Chúng Lằm & Nguyễn Đức Huy (2017) Xác định nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt đồng sông Hồng.Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam, 12 (85): 87-93 Nguyễn Duy Hưng, Hà Viết Cường & Hoàng Chúng Lằm (2018) Phát loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt phản ứng chuỗi polymerase Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam, 16 (12): 10251038 ... nghiền 4.2.4 Xác định thành phần, mức độ phân bố đa dạng loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt PCR 4.2.4.1 Xác định thành phần loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt đồng sông Hồng số tỉnh PCR... Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt 4.2 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI NẤM Colletotrichum HẠI ỚT TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG VÀ MỘT SỐ TỈNH 4.2.1 Định danh nấm dựa giải trình tự gen mẫu nấm đại diện thuộc... địa y lồi Colletotrichum phát điều kiện in vitro 1.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu Bệnh thán thư gây hại ớt nấm Colletotrichum spp gây 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu Đề tài