Đang tải... (xem toàn văn)
Sắc ký khí (GC Gas Chromatography) là một phương pháp sắc ký mà pha động là chất khí hoặc ở dạng hơi và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên bề mặt chất mang dạng rắn hay phủ đều lên thành phía trong của cột tạo lớp màng phim mỏng.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC TIỂU LUẬN MƠN HỌC CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CƠNG CỤ ĐỀ TÀI: “PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ VÀ ỨNG DỤNG” TPHCM, tháng năm 2014 MỤC LỤC ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ KHÍ 1.1 Khái niệm phân loại……………………………………………………………4 1.2 Vài nét lịch sử…………………………………………………………………… 1.3 Cơ sở lý thuyết chung sắc ký khí…………………………………………… 1.3.1 Q trình sắc kí………………………………………………………… 1.3.2 Các phương pháp tiến hành tách sắc kí………………………………… 1.3.4 Sự doãng rộng pic hiệu lực tách…………………………………11 1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực tách cột……………………… 13 1.3.6 Độ phân giải cột …………………………………………………….17 HỆ THỐNG SẮC KÝ KHÍ 2.1.Thiết bị……………………………………………………………………………20 2.2 Hệ thống cấp khí mang………………………………………………………….20 2.2.1 Hệ thống cấp khí mang…………………………………………………20 2.2.2 Khí mang……………………………………………………………… 21 2.3 Hệ thống tiêm mẫu……………………………………………………………….22 2.3.1 Buồng tiêm dùng cho cột nhồi…………………………………………23 2.3.2 Buồng tiêm dùng cho cột mao quản………………………………… 23 2.4 Cột sắc ký……………………………………………………………………….25 2.4.1 Cột nhồi……………………………………………………………… 26 2.4.2 Cột mao quản………………………………………………………….29 2.4.3 Pha tĩnh ……………………………………………………………… 33 2.5 Lò cột ……………………………………………………………………………42 2.6 Đầu dò……………………………………………………………….………….44 2.6.1 Dectector dẫn nhiệt (thermal conductivity dectector)……………….45 2.6.2 Detector ion hóa lửa (flame-ionization detector) …………… 47 2.6.3 Detector cộng kết điện tử (electron capture dtector) ……………… 49 2.6.4 Detector phát xạ nguyên tử (atomic-emission detector) ……………52 2.6.5 Detector quang kế lửa (flame photometric GC detector) …….53 2.6.6 Detector quang hóa ion (photoionization detector) ……………… 54 2.6.7 Chemiluminescence Spectroscopy………………………………… 55 2.6.8 Detector Nitơ-photpho NPD …………………………………………56 2.6.9 Detector khối phổ…………………………………………………….57 2.6.10 Các thông số quan trọng detector……………………………… 59 2.7 Hệ thống ghi nhận xử lý số liệu…………………………………………….61 TIẾN TRÌNH PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ 3.1 Xác định mục tiêu phân tích………………………………………………… 61 3.2 Chuẩn bị mẫu……………………………………………………………………62 3.3 Chọn Detector……………………………………………………………………62 3.4 Chọn cột………………………………………………………………………….63 3.5 Chọn phương pháp tiêm mẫu……………………………………………………64 3.6 Chương trình hóa nhiệt độ áp suất………………………………………… 64 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG BẰNG GC 4.1 Phân tích định tính………………………………………………………………67 4.2 Phân tích định lượng…………………………………………………………….67 4.2.1 Một số nguyên nhân gây sai số…………………………………….68 4.2.2 Các phương pháp tính tốn định lượng……………………………….68 ỨNG DỤNG CỦA GC 5.1 Ứng dụng GC CASE ……………………………………………………70 5.2 Hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ đầu dò Ion Trap(CASE)…………………71 5.2.1 Nguyên tắc hoạt động GCMS……………………………………… 71 5.2.2 Cấu tạo đầu dò khối phổ đầu dò bẫy ion (Ion trap)……………… 72 5.2.3 Ứng dụng hệ thống Thermo Polaris Q………………………………73 5.3 GCMS với độ phân giải cao (HRGC/HRMS)-CASE………………………….74 5.4 Xác định hàm lượng Diethylene Glycol, Ethylene Glycol có kem đánh phương pháp GC-MS…………………………………………………………75 5.4.1 Mở Đầu………………………………………………………………75 5.4.2 Nội dung tiến hành………………………………………………….75 5.4.3 Kết Luận…………………………………………………………… 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………….81 ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ KHÍ 1.1 Khái niệm phân loại Sắc kí (IUPAC-1993): phương pháp tách cấu tử tách phân bố hai pha, hai pha pha tĩnh đứng yên pha chuyển động theo hướng xác định Sắc ký khí (GC- Gas Chromatography) phương pháp sắc ký mà pha động chất khí dạng pha tĩnh chứa cột chất rắn chất lỏng phủ bề mặt chất mang dạng rắn hay phủ lên thành phía cột tạo lớp màng phim mỏng Cơ sở tách sắc kí khí phân bố mẫu hai pha: pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc lớn, pha động khí thấm qua tồn bề mặt tĩnh GC chia làm loại: - Sắc kí khí-rắn(GSC- Gas Solid Chromatography): pha tĩnh chất rắn Chất rắn nhồi cột thường silicagel, rây phân tử than hoạt tính Cơ chế tách chủ yếu hấp phụ - Sắc kí khí-lỏng(GLC- Gas Liquid Chromatography): pha tĩnh lỏng Chất lỏng bao bọc quanh bề mặt chất rắn trơ, gọi chất mang, tạo nên lớp phim mỏng Cơ chế tách phân bố mẫu lớp phim mỏng Mỗi thành phần hỗn hợp pha động qua pha tĩnh tương tác với pha tĩnh lực, lực chất với pha tĩnh khác nhau, chất có lực yếu với pha tĩnh khỏi cột trước chất có lực mạnh với pha tĩnh khỏi cột sau Đó đặc trưng pha động pha tĩnh, q trình chia tách xảy thay đổi nhiệt độ pha tĩnh áp suất pha động 1.2 Vài nét lịch sử 1905 Ramsey tách hỗn hợp khí dựa sở hấp phụ than hoạt tính 1906 Tswett tách sắc tố thực vật cột gọi q trình tách ‘sắc kí’ 1941 Martin Synge (giải thưởng Nobel) trình bày lý thuyết đĩa chưng cất chiết suất ngược dòng Trên sở James Martin đề xuất sắc kí khí-lỏng (1952) Từ đến GC ngày hồn thiện Đến năm 1968 có khoảng 18000 cơng trình GC Những năm gần hỗ trợ công nghệ điện tử tin học, GC đạt nhiều thành tựu 1.3 Cơ sở lý thuyết chung sắc ký khí 1.3.1 Q trình sắc kí Sắc kí kỹ thuật tách cấu tử cần tách hỗn hợp mẫu vận chuyển pha động qua pha tĩnh Mẫu vào tướng động mang theo dọc hệ thống sắc kí (cột, phẳng) có chứa pha tĩnh phân bố khắp Pha động pha lỏng khí, pha tĩnh lớp phim phủ bề mặt chất mang trơ bề mặt rắn Sự tương tác xảy cấu tử với pha tĩnh nhờ cấu tử phân bố pha động pha tĩnh Sự lực khác chất tan pha tĩnh làm chúng di chuyển với vận tốc khác pha động hệ thống sắc kí Kết chúng tách thành dải pha động vào lúc cuối trình cấu tử theo trật tự tương tác với pha tĩnh Cấu tử di chuyển chậm (tương tác yếu) trước, cấu tử bị lưu giữ mạnh sau dạng đỉnh (pic) tách riêng rẻ (hoặc bậc thang) tùy thuộc vào cách tiến hành sắc kí hiển thị dạng sắc kí đồ Hình minh họa q trình tách hỗn hợp đơn giản gồm hai chất A B (lực tương tác với pha tĩnh A < B) theo thời gian Mẫu chứa A B tiêm vào cột Khi cho chất rửa giải bắt đầu chảy qua cột, phần mẫu hòa tan pha động di chuyển phần đầu cột (tại thời điểm t0) Ở cấu tử A B tự phân bố hai pha Tiếp tục cho pha động qua cột đẩy phần hòa tan chạy xuống phân bố pha động pha tĩnh xảy (thời điểm t1) Đồng thời phân bố dung môi pha tĩnh diễn vị trí mẫu lúc đầu Việc thêm tiếp dung mơi mang phân tử hịa tan chạy xuống cột loạt liên tiếp chuyển biến hai pha Bởi di chuyển chất tan xảy pha động, nên tốc độ trung bình di chuyển chất tan phụ thuộc vào phần thời gian chất tan nằm pha Phần thời gian nhỏ chất tan bị lưu giữ mạnh pha tĩnh (cấu tử B ví dụ trên) lớn chất tan (cấu tử A) có lưu giữ pha động mạnh Sau thời gian phân tử chất A B tách khỏi Nếu đặt detector có khả phát chất tan (cấu tử A B) cuối cột tách tín hiệu vẽ lại hàm thời gian (hoặc thể tích thêm vào) loạt pic đối xứng ghi lại gọi sắc kí đồ Vị trí pic theo thời gian dùng để nhận diện định tính diện tích peak dùng cho phép phân tích định lượng cấu tử xét Hình Quá trình tách sắc kí cột hai chất A B 1.3.2 Các phương pháp tiến hành tách sắc kí Để thực tách sắc kí người ta sử dụng ba phương pháp sau: 1.3.2.1 Phương pháp rửa giải Kỹ thuật sử dụng rộng rãi phương pháp sắc kí Một lượng nhỏ hỗn hợp mẫu giới thiệu vào cột với pha động có lực với pha tĩnh bé so với cấu tử cần tách có mẫu Vì cấu tử cần tách di chuyển với tốc độ chậm so với chất rửa giải Tốc độ xác định lực tương đối cấu tử lên pha tĩnh so với pha động, hệ số phân bố K = Csp/Cmp Ở Csp, Cmp nồng độ cấu tử xét pha tĩnh pha động Các cấu tử rửa giải theo trật tự lực chúng tốc độ di chuyển tương đối chúng phụ thuộc vào tương tác thành phần chúng với pha động, với pha tĩnh pha động với pha tĩnh Bởi cấu tử tách khỏi với vùng pha động chúng nên phương pháp sử dụng phép tách với mục đích phân tích Pha động khơng thay đổi thành phần dung mơi suốt q trình rửa giải; thay đổi dung môi rửa giải sau thời gian định trước (rửa giải theo giai đoạn); khơng thay đổi dung môi tạo nên pha động thay đổi nồng độ thành phần có pha động sau thời gian định trước (rửa giải gradient) 1.3.2.2 Phương pháp tiền lưu Hỗn hợp cần tách gồm chất A, B C cho chảy liên tục vào phần cột, A cấu tử có lực yếu với pha tĩnh Do cấu tử A, B C bị lưu giữ cột, nên trước hết từ cột chảy có dung mơi A có lực tương tác cột yếu di chuyển xuống cịn cấu tử có lực mạnh A bị pha tĩnh giữ phần cột Do dung dượng có hạn pha tĩnh nên vượt dung lượng cấu tử A di chuyển dọc theo cột khỏi cột dạng nguyên chất sau hỗn hợp thành phần A+B A+B+C Phương pháp tiền lưu dùng không thực việc tách hoàn toàn cấu tử, đặc biệt sử dụng tách sắc kí vào mục đích phân tích 1.3.2.3 Phương pháp đẩy Mẫu cho vào cột, dùng dung mơi rửa giải có lực với pha tĩnh mạnh cấu tử hỗn hợp tách để đẩy cấu tử cần tách thoát khỏi cột Cấu tử thoát khỏi cột cấu tử tương tác yếu với pha tĩnh, sau đến cấu tử khác có lực với pha tĩnh tăng dần Phương pháp tạo nên dải rửa giải khơng hồn tồn tách khỏi nhau: có dải thu chất nguyên chất có dải dải ngun chất gồm hỗn hợp chúng Trong thực hành phịng thí nghiệm để tách hỗn hợp phức tạp người ta thường hay dùng phương pháp rửa giải Hình Các phương pháp rửa giải, tiền lưu, đẩy 1.3.3 Đặc tính sắc kí chất tan 1.3.3.1 Tính chất lưu giữ Tính chất lưu giữ phản ánh phân bố chất tan pha tĩnh pha động biểu thị đại lượng thể tích lưu hay thời gian lưu - Thể tích lưu VR thể tích pha động cần thiết để vận chuyển chất tan i từ thời điểm đưa mẫu vào, qua cột đến detectơ (trên sắc kí đồ điểm cực đại peak) - Thời gian lưu tR thời gian từ lúc chất tan i nạp vào cột tách phận tiêm mẫu lúc chất khỏi cột thời điểm có nồng độ cực đại Thể tích lưu nhận trực tiếp từ thời gian lưu tR sắc kí đồ cách nhân với tốc độ thể tích dịng Fc (thể tích pha động đơn vị thời gian): Tốc độ dịng tính theo thông số cột sau: - dc đường kính cột, - L chiều dài cột, - εt độ rỗng toàn phần chất nhồi cột (độ rỗng chất nhồi cột biểu thị tỉ số thể tích kẽ hở chất nhồi thể tích khối tồn phần nó: chất nhồi rắn = 0.35 - 0.45, chất nhồi xốp = 0.70 - 0.90, cột mao quản = 1.0), - Vc thể tích bên cột Tốc độ tuyến tính trung bình u dịch chuyển chất tan là: Tốc độ tuyến tính trung bình u pha động là: Ở tM hay to thời gian không bị lưu giữ chất tan (thời gian chất tan lưu pha động) Trong sắc kí khí, tM lấy thời gian cần thiết cho CH4 di chuyển qua cột Tương ứng tM hay to tích VM (hoặc Vo) biểu thị thể tích trống cột (bao gồm thể tích phận tiêm mẫu (injector), thể tích đoạn ống nối, thể tích rỗng cột thể tích detector) Thể tích lưu hiệu chỉnh V’R thời gian lưu hiệu chỉnh t’R cho bởi: V’R = VR –VM t’R = tR – tM (thời gian không bị lưu giữ chất tan gần xem thời gian lưu pha động) Hình Sắc kí đồ minh họa thời gian lưu t (hoặc thể tích lưu) độ rộng đáy peak W chất tan không bị lưu giữ M chất bị lưu giữ 1.3.3.2 Hệ số phân bố K (Partition coefficient) Mỗi cấu tử chất tan phân bố pha với cân thiết lập tất trình tách sắc kí dựa khác khả phân bố chất tan pha động pha tĩnh Khi chất tan vào hệ thống sắc kí, phân bố pha động pha tĩnh Giả thiết pha động dừng lại vào thời gian nào, chất tan có phân bố cân hai pha, nồng độ chất tan pha cho hệ số phân bố nhiệt động: Ở Cs CM nồng độ chất tan pha tĩnh pha động tương ứng Trường hợp K = chất tan phân bố hai pha Hệ số phân bố xác định tốc độ trung bình vùng chất tan (chính xác tâm vùng) pha động vận chuyển qua cột Đối với peak đối xứng, cực đại pic xuất lối cột, nửa lượng chất tan rửa khỏi cột thể tích lưu VR nửa cịn lại phân bố thể tích pha động VM thể tích pha tĩnh Vs: VRCM = VMCM + VsCs hay VR = VM + KVs hay VR – VM = KVs Phương trình với cột phân bố lỏng, cột hấp phụ, Vs phải thay Ss diện tích bề mặt chất hấp thụ 1.3.3.3 Hệ số dung lượng k’ (The capacity factor) Hệ số dung lượng k’ thông số thực nghiệm quan trọng sắc kí cột sử dụng rộng rải để mô tả tốc độ dịch chuyển chất tan cột Cho chất tan, hệ số dung lượng k’ định nghĩa tỉ số mol chất tan pha tĩnh số mol chất tan pha động: Tỉ số VM/Vs gọi tỉ số thể tích pha Hệ số dung lượng định nghĩa tỉ số thời gian chất tan lưu lại pha tĩnh thời gian cần để chất tan di chuyển pha động suốt chiều dài cột không bị lưu giữ tM Khi k’ cho chất tan nhỏ nhiều, rửa giải xảy nhanh nên việc xác định thời gian lưu khó Cịn k’ khoảng 20 đến 30 thời gian rửa giải bị kéo dài Vì phép tách nên thực điều kiện mà k’ chất tan nằm khoảng giá trị từ đến Giá trị k’ sắc kí khí thay đổi việc thay đổi nhiệt độ cách nhồi cột Cịn sắc kí lỏng, k’ thường điều khiển phép tách tốt thay đổi thành phần pha động pha tĩnh 1.3.3.4 Hệ số chọn lọc (The selectivity factor) Khả pha tĩnh tách cấu tử A B (B cấu tử bị lưu giữ mạnh hơn) xác định tỉ số phân bố tương đối chúng hệ số lưu giữ chúng pha tĩnh cho Hệ số chọn lọc α hàm lưu giữ tương đối cấu tử pha tĩnh Hệ số chọn lọc cặp dải (pic) gần hàm phụ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng, pha động nhiệt độ cột Để cho tách tốt α nên có gía trị lớn Hai chất cần tách tách xa khỏi α lớn lớn thời gian phân tích kéo dài, α nên khoảng từ 1,05 đến 2,0 1.3.3.5 Những yếu tố ảnh hưởng đến lưu giữ Tốc độ di chuyển dải chất tan qua cột hay đĩa sắc kí lớp mỏng phụ thuộc vào phân bố phân tử chất tan pha tĩnh pha động Những nhân tố ảnh hưởng đến phân bố hay lưu giữ là: - Thành phần tính chất pha động - Kiểu tính chất pha tĩnh - Các lực tương tác phân tử cấu tử pha động pha tĩnh - Nhiệt độ Hai yếu tố góp phần để tách tốt hợp chất sắc kí là: 10 (b) Mẫu cột (a) nhiệt độ tách chương trình hóa cho thấy độ phân giải cao thời gian ngắn PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG BẰNG GC Áp dụng mẫu bốc ổn định nhiệt đến vài trăm °C Có khả phát phân tích nhiều chất hỗn hợp Được ứng dụng rộng rãi để tách xác định cấu tử mẫu từ nhiều chủng loại khác Sắc ký khí kết hợp khối phổ 4.1 Phân tích định tính Trong phân tích định tính, hai detector nhận diện hợp chất detector khối phổ detector hồng ngoại chuyển hóa Fourier Một peak nhận diện cách so sánh phổ chúng với thư viện phổ lưu giữ máy tính Một phương pháp tinh tế nhận diện thời gian lưu chất với thời gian lưu chất mẫu biết trước (mẫu chuẩn) cột có độ phân cực khác Cách đáng tin cậy so sánh thời gian lưu sắc kí đồ thu mẫu biết trước (mẫu chuẩn) thêm mẫu cần dị tìm vào điều kiện sắc kí Nếu chất cần dị tìm trùng với chất có mẫu chuẩn pic chất mẫu thêm có diện tích hay chiều cao tăng lên so với chưa thêm chất chưa biết vào Sự nhận diện mức thăm dò thực cột, khẳng định thực vài cột loại pha tĩnh khác Trong hình cho thấy nhận diện đỉnh 2,3,4,7 metyl, etyl, npropyl, n-butyl, n-amyl alcol Cần có chất khác có thời gian lưu giống gần Vì cần xác định nhiều pha tĩnh khác sử dụng detector khối phổ hồng ngoại để xác định Hình Phân tích định tính cách so sánh thời gian lưu với chất chuẩn 4.2 Phân tích định lượng 67 4.2.1 Một số nguyên nhân gây sai số Chuẩn bị mẫu: phương pháp khác, mẫu đem phân tích lấy mẫu đại diện cho lô nguyên liệu hay sản phẩm Các qui tắc lấy mẫu cần phải tuân thủ cho loại mẫu Mẫu cần làm trước tiêm mẫu vào GC Việc làm khơng tốt gây nên cấu tử cần xác định Tiêm mẫu: chất lỏng tiêm vào buồng tiêm mẫu nhiệt độ thiết lập cao gây nên phân hủy mẫu, mẫu có tham dự vào phản ứng Kỹ thuật tiêm mẫu gây sai số Mẫu bị phân hủy bị hấp phụ: có nhiều trường hợp có phân hủy hấp phụ buồng tiêm mẫu, cột, detector làm cho pic khơng đại diện cho lượng chúng có mẫu Để khắc phục điều ta nên dùng phương pháp lập đường chuẩn để biết diện tích hay chiều cao pic có tỉ lệ tuyến tính với lượng mẫu đưa vào hay không Đáp ứng detector: detector đáp ứng khác với hợp chất khác Vì cần biết rõ hệ số đáp ứng Hơn điều kiện làm việc thay đổi đáp ứng detector thay đổi Trong GC sử dụng phương pháp chuẩn nội để khắc phục điều Kỹ thuật lấy tích phân: GC có nhiều cách thiết lập quan hệ thông tin nhận từ pic sắc kí với hàm lượng cấu tử: Đo chiều cao pic, dùng máy ghi tích phân, cắt cân giấy Các cách có sai số riêng q trình xử lí Ngày với ghép nối máy tính phần mềm hỗ trợ việc tích phân hóa diện tích peak trở nên dễ dàng thông dụng Kết báo cáo đầy đủ thông tin peak chiều cao, diện tích, phần trăm mẫu … 4.2.2 Các phương pháp tính tốn định lượng 4.2.2.1 Phương pháp chuẩn hóa diện tích Đây phương pháp tính thành phần phần trăm mẫu cách đo diện tích peak sắc kí đồ Theo cách đem diện tích pic chất quan tâm A cho tổng diện tích peak: %A = (diện tích peak A/tổng diện tích peak)x100 % Khi phân tích thành phần có điểm sơi sát dãy đồng đẳng, phương pháp dùng để tính tỷ lệ phần trăm khối lượng Phương pháp tất cấu tử rửa giải đáp ứng detector với cấu tử giống Nếu điều kiện thõa mãn phương pháp nhanh hiệu 4.2.2.2 Phương pháp tính theo hệ số hiệu chỉnh Như biết detector đáp ứng khác chất khác Vì cần phải tính hệ số hiệu chỉnh Nhờ hệ số tính thành phần phần trăm cấu tử mẫu 68 Cách xác định hệ số hiệu chỉnh: - Tiêm dung dịch chuẩn biết nồng độ cấu tử A, B, C… vào GC - Sắc kí đồ thu có pic phân giải hồn tồn diện tích thu tương ứng - SA, SB, SC… tương ứng với khối lượng mẫu mA, mB, mC… - Chọn pic làm chuẩn ví dụ A có tỉ lệ SA/mA gán giá trị FA = - Từ tỉ lệ SB/mB, SC/mC… suy FB, FC… 4.2.2.3 Phương pháp lập đường chuẩn: Lập đường chuẩn riêng rẽ cấu tử hỗn hợp cách tiêm thể tích loạt dung dịch hỗn hợp chất chuẩn có nồng độ khác Như loạt nồng độ chất chuẩn phân tích diện tích chúng xác định Một đường chuẩn dựng cho cấu tử với trục nồng độ trục diện tích tương ứng để kiểm tra tuyến tính đáp ứng detector Tiêm thể tích mẫu có cấu tử cần phân tích chạy sắc kí điều kiện chạy chuẩn Từ diện tích thu cấu tử cần phân tích đường chuẩn vừa thiết lập suy nồng độ chúng 4.2.2.4 Phương pháp dùng chuẩn nội Phương pháp gọi phương pháp chuẩn hóa tương đối hay gián tiếp Để định lượng cấu tử X ta cần phải chọn chất chuẩn S cho: - Nếu trộn lẫn X với S ta phải thu đỉnh riêng biệt sắc kí đồ - Peak X S phải gần Sau ta phải pha hỗn hợp có tỷ lệ trọng lượng X S biết trước, chạy sắc kí, đo diện tích peak, lập tỉ số diện tích tương ứng, cuối lập đường chuẩn tương đối Sc/Ss tỉ lệ diện tích cặp cấu tử cần xác định X chất chuẩn nội 69 Wc/Ws tỉ lệ trọng lượng cặp cấu tử cần xác định X chất chuẩn nội Khi phân tích mẫu thật, ta cho lượng biết trước chất chuẩn nội S vào mẫu tiến hành sắc kí hỗn hợp Từ tỉ lệ diện tích đo được, đường chuẩn tương đối vừa dựng ta có tỉ lệ trọng lượng Với trọng lượng chuẩn S thêm vào biết ta tính trọng lượng chất X Phương pháp có ưu điểm: - Khơng cần biết đến đáp ứng detector - Khơng cần trì nghiêm ngặt điều kiện tiến hành sắc kí thay đổi loại trừ theo cách tính tỷ số ỨNG DỤNG CỦA GC Cùng với phát triển kỹ thuật sắc ký, sắc ký khí cơng cụ hữu hiệu nghiên cứu khoa học đặc biệt lĩnh vực hóa học phân tích Phương pháp sắc ký khí phương pháp sử dụng phổ biến việc phân tích hợp chất hữu dễ bay loại mẫu Một vài ví dụ: Ketones: polydiméthyl siloxane Alkalọdes: 5% phenyl polydimethyl siloxane Steroïds: 50% phenyl polydimethyl siloxane Chlorinated Aromatics: 50% Trifluoropropyl polydimethyl siloxane Alcohols: Polyethylenglycol Esters: 50% Cyanopropyl polydimethyl siloxane 5.1 Ứng dụng GC CASE Tại CASE, hệ thống sắc ký khí hãng sản xuất thiết bị phân tích tiếng Shimadzu (GC 2010, GC 2010 Plus), Perkin Elmer, Varian (3800), Thermo Finnigan (Trace GC),… với đầu dò FID, ECD, NPD, FPD, TCD, MS có khả phân tích hợp chất hữu có chất khác Các hệ thống GC có gắn phận chích mẫu tự động (Autosampler) phận hóa (Headspace) Các hệ thống sắc ký khí với tất loại đầu dị, CASE phân tích hầu hết hợp chất thuốc trừ sâu họ Chlor (Aldrin, Eldrin,…), họ Phospho (Chlorpyriphos, Diazinon,…) họ Cúc (Cypermethrin, Deltamethrin,…), loại thuốc diệt cỏ, diệt nấm mẫu nông sản, thực phẩm, thủy hải sản, mơi trường… phục vụ cơng tác an tồn vệ sinh cho loại hàng hóa lưu thơng nước xuất Phân tích tiêu nước theo quy chuẩn Bộ Y tế (QCVN 01:2009/BYT) quy chuẩn khác 70 Phân tích dư lượng PCBs, PAHs, mẫu thực phẩm, môi trường, nước,… theo yêu cầu quan quản lý ngồi nước Phân tích hóa chất POPs (Persistent Organic Pollutants) môi trường, thực phẩm,… Phân tích 20 amino acid thực phẩm, phân bón, chế phẩm sinh học,… Phân tích mẫu bệnh phẩm, mẫu ngộ độc: Methanol, Trichloroacetic, Benzen, Toluen,… máu, nước tiểu Phân tích BTX (Benzen – Toluen – Xylen) số hợp chất bay khác khơng khí Phân tích hoạt chất, hương liệu dược phẩm,… theo dược điển Anh (BP), Mỹ (USP), Nhật (JP), Châu Âu (EP), Việt Nam,… Phân tích thành phần acid béo, cholesterol, thành phần khác theo yêu cầu bảng giá trị dinh dưỡng (Nutrition Fact)… 5.2 Hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ đầu dò Ion Trap(CASE) Hệ thống GCMS Thermo Polaris Q kết hợp máy sắc ký khí Ultra Trace GC đầu dò khối phổ bẫy ion Polaris Q với hệ phận bơm mẫu CompiPAL có khả phân tích nhận danh định lượng nhiều loại hợp chất hữu mẫu khác 5.2.1 Nguyên tắc hoạt động hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ (GCMS – Gas Chromatography Mass Spectrometry) Tương tự hệ thống sắc ký khí khác, hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ bao gồm phận: nguồn cung cấp khí, lị cột, phận tiêm mẫu, cột phân tích, đầu dị, phận ghi nhận tín hiệu, phận in liệu phân tích; đó, đầu dị đầu dị khối phổ 71 Hình 33 Sơ đồ cấu tạo đầu dò khối phổ Các cấu tử mẫu sau tách khỏi cột mao quản vào đầu dò khối phổ Tại đây, tùy thuộc vào chất chất cần phân tích, diễn trình ion hóa với kiểu ion hóa khác (API, ESI hay APPI), sau ion ghi nhận đầu dò 5.2.2 Cấu tạo đầu dò khối phổ đầu dò bẫy ion (Ion trap) Hệ thống GCMS Thermo Polaris Q bao gồm bơm chân không, bô bơm mẫu tự động (CompiPAL), máy sắc ký khí Trace GC Ultra, đầu dò khối phổ bẫy ion Polaris Q Đầu dị Polaris Q gồm có bốn phận sau: Nguồn ion hóa áp suất khí (API) Hệ quang học ion (ion optics) Bộ phân tích khối (mass analyzer) Hệ thống phát ion (ion detection system) 72 Hình 34 Cấu tạo đầu dị khối phổ bẫy ion 5.2.3 Ứng dụng hệ thống Thermo Polaris Q - Phân tích dư lượng PCBs, PAHs, mẫu thực phẩm, môi trường, nước, … theo yêu cầu quan quản lý nước - Phân tích hóa chất POPs (Persistent Organic Pollutants) mơi trường, thực phẩm,… - Phân tích dư lượng thuốc trừ sâu thực phẩm, thủy hải sản Trifluralin, Chlorpyrifos,… với khả phát đáp ứng yêu cầu khắt khe nước Nhật, châu Âu,… - Phân tích độc chất thực phẩm (3-MCPD, Histamin, Urea,…) - Phân tích hormone tăng trưởng mẫu thịt, thức ăn chăn nuôi học beta-agonist (Clenbuterol Salbutamol), Testosterol, DES,… hỗ trợ quan chức cơng tác kiểm sốt chất lượng bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm sản phẩm lưu hành thị trường Hình 35 Hệ thống GCMS Ion trap Thermo Polaris Q - Phân tích chất thuộc nhóm Phthalate (đặc biệt DEHP) mẫu thực phẩm, thơi nhiễm từ bao bì,… theo yêu cầu Bộ Y tế quan quản lý khác 73 - Phân tích Glyphosate sản phẩm gạo việc kiểm soát chất lượng nơng sản xuất sang châu Âu - Phân tích chất thuộc nhóm Nitroimidazole, thuốc diệt nấm (Propiconazole, Hexaconazole, Difenconazole) thủy sản, trái loại rau - Phân tích 22 hợp chất amin thơm sinh từ thuốc nhộm azo sản phẩm dệt may theo quy định Bộ Công thương (QCVN 01:2010/BCT) - Phân tích nhận danh, định tính tinh dầu hợp chất hữu khác … 5.3 Máy sắc ký khí ghép khối phổ với độ phân giải cao (HRGC/HRMS)-CASE CASE phịng thí nghiệm nước trang bị máy sắc ký khí ghép khối phổ độ phân giải cao (HRGC-HRMS) chun phân tích DIOXIN Từ 1993, khn khổ chương trình hợp tác khoa học kỹ thuật Việt Nam – Pháp, trung tâm phía Pháp viện trợ thiết bị HRGC-HRMS VG 70VSE hãng MICROMASS (Anh) Máy phân tích hàm lượng siêu vết Dioxin phù hợp với tiêu chuẩn EPA 1613 Mỹ độ phân giải 10.000, giới hạn phát mức 0,5ppt Đồng thời Pháp hỗ trợ đào tạo chuyên viên kỹ thuật phân tích xử lý mẫu Dioxin Trung tâm phân tích Soleize-Lyon-Pháp kỹ sư điện tử chuyên bảo trì sửa chữa thiết bị Điều giúp cho CASE phân tích Dioxin từ năm 1995 Hình 36 Máy HRGC/HRMS Năm 2004, trước yêu cầu phải phân tích 17 đồng phân PCDDs/PCDFs theo quy định WHO, Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm Ủy Ban Nhân Dân TP HCM đầu tư 6,7 tỷ đồng để trang bị thiết bị mới: máy HRGCHRMS AutoSpec Ultima NT tập đòan WATERS - Mỹ, thay cho thiết bị cũ nói xuống cấp Đây dòng máy thuộc hệ hãng WATERS, với hệ thống Autosampler GC PAL 98 vị trí Chương trình hịan tịan tự động từ khâu tiêm mẫu đến tính tóan định lượng Máy đạt đến độ phân giải 80.000, định lượng đồng 74 thời 17 đồng phân PCDDs / PCDFs mẫu vật mức giới hạn phát 0,01ppt Tất thao tác vận hành kiểm soát hệ thống máy tính với phần mềm Masslynx & Quanlynx Hệ thống SIOS thu thập xử lý liệu kiểm sóat khối phổ thực thơng qua máy IBM cực mạnh Máy cịn có chức tự động kiểm tra độ phân giải sau 12 tự động dừng phân tích phát độ phân giải giảm thấp giới hạn cho phép Trung tâm xây dựng quy trình phân tích Dioxin Furan nhiều lĩnh vực môi trường : đất, bùn trầm tích, nước sơng ngịi, nước ngầm…; thủy hải sản : tôm, cá, mực…; nông sản thực phẩm : gạo, đậu, cà phê, sữa…đặc biệt quy trình phân tích định lượng Dioxin mẫu bệnh phẩm : mơ mỡ, huyết thanh, gan… Các quy trình tổ chức VILAS công nhận 5.4 Xác định hàm lượng Diethylene Glycol, Ethylene Glycol có kem đánh phương pháp GC-MS 5.4.1 Mở Đầu a/ Mục đích Phương pháp phát triển Trung tâm hóa học pháp lý (FCC) để kiểm tra kem đánh có chứa diethylene glycol (và chất liên quan có độc tính tương tự, ethylene glycol) mức mg/g (0.1% trọng lượng) b/ Mục tiêu Sử dụng sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) c/ Phạm vi Phương pháp cho thấy có khả phát phân tích mức 0.5 mg/g nhiều nhãn hiệu khác kem đánh 5.4.2 Nội Dung tiến hành a/ Thiết bị trợ cấp - Hệ thống Agilent 5975i GC-MS trang bị với 30 m Stabilwax (crossbond Carbowax) cột mao quản (hoặc tương đương) hay hệ thống phổ khối khác - Máy ly tâm phịng thí nghiệm có khả áp dụng 5000 g với ống ly tâm cỡ 15 mL - Ống ly tâm polypropylene 15 mL có nắp vít b/ Tác chất chất chuẩn - Dung môi chiết: nước đến acetonitrile - 1,3-Propanediol + Dùng chất chuẩn nước Điều chế dung dịch có sẵn nồng độ 5.0 mg/mL 50% dung dịch nước với acetonitrile 75 + Thêm 0.050 mL dung dịch vào 0.500 mL mẫu chiết lọ autosampler trước phân tích - Diethylene Glycol Điều chế dung dịch có sẵn 10.0 mg/mL 50% dung dịch nước với acetonitrile - Ethylene Glycol Điều chế dung dịch có sẵn 10.0 mg/mL 50% dung dịch nước với acetonitrile - Dung dịch hỗn hợp chất chuẩn Pha trộn chuẩn có sẵn với lượng c/ Các yếu tố kiểm tra định lượng Một mẫu trắng gồm 10 mL dung dịch chiết lấy thông qua tồn quy trình kể việc thêm chất chuẩn nội phải ước lượng để bảo đảm không nhiễm tác chất từ vật chứa Điều kiện để hệ thống bước đầu mẫu cách tiến hành hai mẫu tiêm với chuẩn cao Một chuẩn thấp, có chứa chất phân tích mức 0.10 mg/mL, nên phải phân tích từ mẫu đến mẫu cuối cùng, thiết lập để thấy độ nhạy cần thiết đạt tới phương tiện Một chuẩn cao mức 0.50 mg/mL chất phân tích phân tích từ mẫu đầu đến cuối, thiết lập để cung cấp sở cho việc đánh giá bán định lượng theo dõi lượng lắng suốt q trình phân tích thiết lập mẫu Một mẫu kiểm tra làm giàu gồm có đại diện cho loại mẫu phân tích va làm giàu thêm chất phân tích (tức Diethylene glycol ethylene glycol) mức mg/g (hoặc 0.1 % trọng lượng) Phép phân tích mẫu phải thể chất có diện Phép phân tích để minh chứng hiệu hệ thống có hiệu mức độ đề d/ Quy trình - Chuẩn bị mẫu Cân khoảng 1.0 g kem đánh cho vào ống ly tâm polypropylene 15-mL Thêm mL nước Trộn để phân tán hoàn tồn tồn mẫu Sử dụng máy trộn xốy (ví dụ Genie 2, Fisher Scientific) hỗ trợ trình Bọt tạo thành Sau thêm mL acetonitrile hai phần chia với khuấy cẩn thận lần thêm Acetonitrile ngăn chặn tạo bọt Ly tâm 10 phút 5000 g (xấp xỉ 6200 vòng/ phút) cao 76 Chuyển 0.50 mL phần mặt vào lọ nhỏ autosampler Thêm 0.050 mL chuẩn nội (tức 1,3-propanediol mức 5.0 mg/mL) Đem phân tích - Các tham số cơng cụ Quy trình đề nghị GC vận hành chế độ chia (20:1) để cải tiến hình dạng peak giảm lặp thành phần mẫu hệ thống ghi phổ sắc Các thông số kỹ thuật chuẩn bị máy GC Các điều kiện GC Cột Restek Stabilwax (30 m X 0.25 mm id X 0.25 µm df) with a m retention gap (or equivalent) Nhiệt độ vào 250 °C Nhiệt chuyển dòng 250 °C Chế độ tiêm Chia dịng ‘split’ (20:1) Lượng tiêm µL Dịng khí mang He mức 35 cm/giây (cố định dịng) Chương trình nhiệt 100°C (1 phút) đến 250°C mức 10°C/phút (giữ 4.00 phút) tổng thời gian chạy 20 phút Sử dụng 50% dung dịch nước với acetonitrile lọ rửa để làm ống tiêm lần tiêm Điều loại bỏ phần lại mẫu mà không tan dung môi rửa khác Điều làm giảm sai số tiêm mẫu Lưu ý: Sự thay đổi tới chương trình nhiệt GC dùng để khắc phục tượng nhiễu Bổ sung đáng kể độ phân giải đạt cách giảm độ dốc nhiệt độ phần chia thích hợp sắc phổ Điều thay đổi thời gian lưu cho chất phân tích chúng cần tái thiết lập Các thông số kỹ thuật chuẩn bị chế độ MS Các điều kiện MS (Chế độ scan đầy đủ) Điều chỉnh Điều chỉnh tự động phổ chuẩn Vùng scan 29 - 400 amu Tốc độ mẫu (tốc độ scan khoảng scans/giây) Ngưỡng 100 Sự trì hỗn dung mơi phút 77 230 °C (nguồn); 150 °C (Quad) Nhiệt độ MS Các điều kiện MS (SIM Mode) Điều cung cấp chủ yếu đối thơng tin khơng SIM cần dược sử dụng Có nhiều nhiễu có tiềm tàng với ion khối lượng thấp Những ion khối lượng cao hữu ích mặc dù, nói chung, nhạy cảm tương đối thấp Khơng có ion phân tử quan sát 1,2-propanediol, 1,3-propanediol, diethylene glycol hay glycerin Selected Ions b Start Time a (min) Group 1,2-Propanediol 4.0 31 (11) c 43 (15) 45 (100) 61 (5) Ethylene Glycol 6.6 31 (100) 33 (35) 43 (8) 62 (M) d (4) 1,3-Propanediol 7.5 31 (100) 43 (22) 57 (73) 58 (68) Diethylene Glycol 9.0 31 (11) 45 (100) 75 (24) 76 (12) Glycerin 12.0 31 (40) 43 (78) 60 (13) 61 (100) a Start Times cần điều chỉnh dựa thời gian lưu chuẩn hệ thống Dwell times điều chỉnh để đưa thời gian vòng khoảng scans/giây c Phần trăm dồi tương ý tới phong phú cao ion d M ion phân tử b - Sự nhận peak: Thời gian lưu gần phép phân tích: Chất Chú giải Thời gian lưu (min) 1,2-Propanediol 6.4 Ethylene Glycol 6.8 1,3-Propanediol 8.4 Đây chất có quan hệ Chất chuẩn nội 78 Diethylene Glycol 10.4 Glycerin 13.7 Chất có thường thấy kem đánh Các điều cần xác thực hệ thống Hình 37.Sắc phổ đồ chuẩn biểu diễn phép phân tích đề cập - Làm giàu mẫu điều chế hỗn hợp mẫu chuẩn Một dung dịch hỗn hợp chuẩn cuối điều chế cách trộn phần hai dung dịch chuẩn có sẵn để tạo thành dung dịch 5.0 mg/mL phân tích Sự điều chế chấm dứt (spike): Cân phần 1.0 g kem đánh vào ống ly tâm 15-mL Một phân tích trước đó, mẫu đại diện sản phẩm tìm thấy nhiễm với chất cần xác định sử dụng Cách khác, chọn mẫu mà phân tích chấm dứt phần chia Việc phải lặp lại với mẫu khác việc phân tích mẫu mà khơng làm giàu mẫu cung cấp cho chứng nhiễm Thêm trực tiếp 200 µL dung dịch hỗn hợp chuẩn cuối vào mẫu đại diện không bị nhiễm tiến hành với phương pháp Kết thúc phải quan sát để cung cấp sở cho việc trình bày mẫu cung cấp tín hiệu ngưỡng định có chứa 1.0 mg/g mục tiêu Chuẩn cao: Pha loãng dung dịch hỗn hợp chuẩn cuối 0.5 mg/mL với 50% dung dịch nước acetonitrile Đặt 500 µL dung dịch lọ nhỏ thêm 50 µL dung dịch chuẩn nội 79 Chuẩn thấp: Pha loãng dung dịch hỗn hợp chuẩn cuối 0.10 mg/mL Đặt 500 µL dung dịch lọ nhỏ thêm 50 µL dung dịch chuẩn nội Chọn ion để dùng ước tính hàm lượng chất cần phân tích (chẳng hạn, m/z = 75 diethylene glycol m/z = 62 ethylene glycol) Việc sử dụng chuẩn cao (0.50 mg/mL) mà chạy mẫu ban đầu chuẩn cao mà chạy mẫu cuối, tính tốn diện tích peak trung bình ion chọn Áp dụng cơng thức sau: Nồng độ mẫu chiết (µg/mL) = [Diện tích (mẫu kiểm tra) / diện tích trung bình (mẫu chuẩn cao)]x 0.50mg/mL Sau đó, Nồng độ mẫu (µg/g) = Nồng độ mẫu chiết (mg/mL) x 10.0 mL x [1 / trọng lượng mẫu (g)] Nồng độ mẫu (% trọng lượng) = Nồng độ mẫu (mg/g) x 1/10 Nếu diện tích peak mẫu chuẩn nội khác 20% mẫu kiển tra mẫu chuẩn sau có điều chỉnh diện tích đáp trả phân tích cách chia theo diện tích hợp chuẩn nội (sử dụng ion mức 58 amu) Sử dụng tỷ số thay cho vùng tổng hợp Xem phân tích lại khác vơ lớn từ cho biết ống tiêm bị tắt phần hay vấn đề thuộc cơng cụ khác Cuối cùng, tín hiệu từ ion mẫu nhiều 10 lần tín hiệu lớn từ chuẩn cao, sau pha lỗng phần chiết thêm để đưa nồng độ chất cần phân tích vào vùng chuẩn cao 5.4.3 Kết Luận Trong trường hợp phân tích quan sát mẫu kiểm tra đại diện làm giàu mức 1,0 mg/g khơng có tín hiệu phân tích quan sát mẫu mức độ mà quan sát việc kiểm tra làm giàu mẫu, sau mẫu khơng bị nhiễm với ethylene glycol diethylene glycol mức vượt 0,1% trọng lượng (tức mg/g) Nếu rõ ràng nhiều chất cần phân tích diện mẫu (dựa tiêu chí nhận dạng trên) mức độ lớn 1.0 mg/g, sau kết báo cáo điều có thực Đạt đánh giá bán định lượng mục tiêu phân tích 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO Chuyên đề sắc ký – TS Nguyễn Đình Lâm – Khoa Hố ĐHBK Đà Nẵng Cơ sở phân tích sắc ký khí – Thạc sĩ Bùi Xuân Vững Nguyên lý hoạt động số detector sắc ký khí – ThS Lê Nhất Tâm – Khoa Hố – ĐH Cơng Nghiệp TP.HCM http://www.case.vn/vi-VN/87/details.case 81 ... A B 1.3.2 Các phương pháp tiến hành tách sắc kí Để thực tách sắc kí người ta sử dụng ba phương pháp sau: 1.3.2.1 Phương pháp rửa giải Kỹ thuật sử dụng rộng rãi phương pháp sắc kí Một lượng nhỏ... pha động Kết cho thấy sắc kí khí lẫn sắc kí lỏng có chiều cao đĩa lí thuyết đạt cực tiểu vùng tốc độ dịng thấp pha động nói chung tốc độ sắc kí lỏng thấp so với sắc kí khí 1.3.5.2 Lí thuyết dỗng... hợp thành phần A+B A+B+C Phương pháp tiền lưu dùng khơng thực việc tách hồn tồn cấu tử, đặc biệt sử dụng tách sắc kí vào mục đích phân tích 1.3.2.3 Phương pháp đẩy Mẫu cho vào cột, dùng dung môi