QUY TRÌNH SỬ DỤNG MÁY ACQUITY ULPC H-CLASS Chuẩn bị dung môi Kênh A: Nước Kênh B: MeOH Kênh C: Acetonitril Kênh D: Hệ đệm (nếu có) Seal wash: MeOH - H2O (10:90) Needle wash: MeOH - H2O (90:10) Yêu cầu  Nước nước cất lần dung môi đệm cần lọc qua màng 0,2 μm (cellulose acetate nitrat), nước sử dụng không ngày  Mẫu: cần lọc qua màng 0,22 μm, màng lọc chịu dung môi pha mẫu  Acetonitril MeOH (Merck) ngun chai khơng cần lọc  Các đầu lọc không khô mà cắm ngập dung môi Nếu không dùng máy thời gian dài bảo quản methanol acetonitril – nước (9:1)  Chai dung mơi phải siêu âm đuổi khí 10-15 phút  Đặt bình vào vị trí, đầu hút dung môi phải ngập dung môi  Khoảng nồng độ phù hợp cho số acid thông dụng (lưu ý loại cột sử dụng có thể chịu khoảng pH bao nhiên) Chuẩn bị máy Bật công tắc Máy tính, Quaternary Solvents Manager, Sample Manager, PDA Detector Chờ máy khởi động xong Khởi động phần mềm ACQUITY console 2.1 Prime kênh dung môi chạy * Vào Quaternary Solvent Manager  control  prime solvents - Bấm chọn kênh dung mơi để prime (có thể chọn kênh hay toàn kênh lúc) - Khai báo thời gian (khoảng 2-4 phút), khai báo flow rate (~ ml/p) bấm Start Prime seal wash 2.2 * Vào Quaternary Solvent Manager  control  prime seal wash - Máy tự động prime, rửa khoảng 2-4 phút Wash needle 2.3 * Vào Sample Manager  Control  Wash needle Những lưu ý chung trình chạy máy Cột 3.1 Cân cột - Với pha động khơng có đệm cần cân cột pha động 10 lần thể tích cột - Với pha động có đệm phải cân cột pha động có nước với lần thể tích cột, sau cân bằng pha động có đệm (ví dụ: 60% MeOH/H2O 60% MeOH/đệm) - Bảo quản cột: nên bảo quản cột MeOH: H2O (70:30), không nên bảo quản cột dung dịch đệm chạy đệm rửa cột với 10 lần nước chuyển dung môi bảo quản Chuẩn bị mẫu 4.2 - Mẫu cần lọc qua màng lọc 0,22 μm, lưu ý lựa chọn màng lọc chịu dung môi pha mẫu Hệ thống bơm 4.3 - Phải đảm bảo áp suất Degas nằm ngưỡng 0,9 psi - Bơm có thể đảm bảo tốc độ dịng mL/p (ở áp suất 15000 psi) tới mL/p (9000 psi) Khởi động Empower - Khởi động phần mềm Empower với (user name: system; password: manager) - Configure the system: Thay đổi cấu hình máy muốn tạo project - Run sample: Chạy mẫu - Browse projects: Xem lại mẫu chạy Tạo project (Configure the system) Tạo project - Nhấp chọn Configure the System cửa sổ bên Tạo Project Vào Menu file > New > Project  khởi tạo project project từ project sẵn có Chọn thư mục mẹ cho project > Next Tablespace: Bỏ chọn FullAudit Trailsupport > Next Option: Chọn Photo Diode Array System Suitability > Next Access Control: - Chọn Owner only > Next Copy selection Chọn Project để copy chương trình vào project > Next Name Entry Gõ tên Project vào Project name > Finish NHƯ VẬY ĐÃ HOÀN THÀNH XONG BƯỚC TẠO PROJECT MỚI Tạo METHOD SET Từ cửa sổ Empower chọn Run Samples, chọn Project  Ok Màn hình xuất bên: Lưu ý: để chạy mẫu, ban đầu phải có Method set gồm: Instrument method (rất quan trọng), Processing method Report method Method set có thể có sẵn tạo Vào Menu Edit > New method set > chọn “Yes” bạn muốn tạo method set hoàn toàn “No” bạn tạo từ việc edit cũ (sẽ đỡ thời gian hơn) Sau chọn “Yes”  Xuất hộp thoại New Method set: Select Instrument Method 7.2 Tạo Instrument method cách edit cũ create new (ở trang tiếp theo)  Thông số Detector PDA Chọn Chương trình cho PDA Chọn Range bước sóng cần đo  Thông số hệ thống bơm QSM Chọn Max Pressure limit: < =15.000 psi Chọn kênh dung mơi Chương trình tốc dộ dịng  Thơng số hệ thống mẫu Sample manager Chọn chương trình rửa kim 7.3 Chọn processing/Report/Export method Chọn processing có sẵn, edit lại có thể bỏ trống cách chọn (No processing / No Chọn chương trình nhiệt độ Reporting/ No Exporting) Nhập tên Method set vào ô “Method set name” Lưu y: Nên lưu tên Instrument Method giống tên Method set để có thể dễ dàng tìm kiếm Run samples Từ hộp thoại khởi động phần mềm Empower 3.0 > Run Sample Chọn instrument method để setup Các thông số cần lưu ý: Plate/well: nguyên tắc khai báo “Khay:Hàng,cột” Ví du: 1:D,2 - Nếu chạy lần đầu cần define Plates cách vào edit > plates > Chọn mẫu define phù hợp OK - Inject Volumn: thể tích tiêm mẫu, khoảng 0,5 – 10 μl - Sample name: tên mẫu - Function: chọn function phù hợp, có thể chọn inject samples chạy mẫu equilibrate muốn cân cột - Method set/report method: chọn method phù hợp để chạy - Run time: chọn thời gian chạy tùy vào thời gian set chạy Instrument method - Lưu tên Sample set để lần chạy cần chỉnh sửa danh sách mẫu chạy Bấm run: chế độ chạy: - Chạy toàn mẫu sample set - Chạy mẫu đánh dấu 10 Nếu muốn dừng chương trình chạy, bấm Stop Các chế độ: - Dừng lập tức - Dừng sau chạy hết vial… Xem kết quả: (tóm tắt bước cần thiết để xem sắc kí đồ phổ UV) Sau chạy xong: - Prime lại kênh pha đệm với Nước, - Rửa cột - Tắt đèn - Tắt máy - Ghi sổ Nếu cần trợ giúp có cố xảy đề nghị báo cho người quản lí máy… Xem kết tạo Processing method Từ hộp thoại khởi động phần mềm Empower 3.0 → Browse Project → chọn Project chứa liệu muốn xử lý Sau chọn Project, xuất Project window sau: 11 Chọn tab Injections xuất mẫu tiêm, chọn tab Channels để xuất kênh (nếu sử dụng nhiều bước sóng chương trình chạy 2D) XEM KẾT QUẢ Trong tab Channels, chọn mẫu cần xem, nhấn chuột lần, chọn icon hay vào Tool → View Cửa sổ Review xuất Từ khung Extract Choices list in Review, chọn Max Plot để sắc ký đồ max plot Nếu muốn trích xuất sắc ký đồ bước sóng bất kỳ, gõ bước sóng vào 12 Ví dụ: Nếu muốn trích sắc ký đồ 254 nm, gõ 254 vào 13 TẠO PROCESSING METHOD Chọn mẫu cần tạo Processing method, hộp thoại Review xuất hiện, chọn Icon Processing Method Wizard Hộp thoại Processing Method Wizard xuất hiện, thực theo bước sau để bắt đầu tạo Processing method: * Chú ý: Nên tạo Processing method với mẫu chuẩn có nồng độ thấp Sau áp dụng Processing với mẫu có nồng độ cao Chọn Create a New Processing Method Nhấn OK Trong ô Processing Type, chọn LC Trong ô Intergration Algorithm, chọn ApexTrack Đảm bảo không chọn ô Use Processing Method Wizard Nhấn OK 14 Chọn Create a New Processing Method Nhấn OK Bỏ chọn ô Nhấn OK Chọn vùng sắc ký đồ muốn phân tích (integrate) cách nhấn kéo chuột sắc ký đồ → nhấn Next 15 Đặt Peak Width Threshold → Next Chú ý: Ở bước 4, chọn thuật tốn phân tích (Intergration Algorithm) ApexTrack phần mềm tự động xác định Peak Width Threshold Đặt Minimum Area Minimum Height để loại bỏ peak khơng muốn phân tích Nhấp chuột vào peak thấp muốn phân tích Peak chuyển thành màu đỏ Nhấp chuột vào ô Minimum Height/Minimum Area: Giá trị xuất ô 95% chiều cao/diện tích thật peak chọn → Next 16 10 Chọn nội dung sau: - Select the method of quantitation: Area - Select component information: Amount - Select the calibration curve fit type: Linear → Next 11 Hộp thông báo sau xuất → chọn No 12 Đặt tên cho peak → Next 17 13 Chọn External Standard Calibration → Next 18 14 Đặt tên cho Processing Method vừa tạo ô Method Name → Finish Nhấn vào tab Results → Update để kết 19 10 Cài đặt Processing method tạo cho method set Thực bước sau: Tên Method set Processing method xuất Method Bar cho biết Processing method mở Nhấn vào Method Set tool để xuất nội dung Method set Tên Processing method xuất khung Default Processing method Đóng sổ Method Set Chọn File → Save as → Method Set * Chú ý: Mặc dù tên Processing method tự động xuất Method set phải lưu lại method set 11 Kiểm tra tinh khiết peak Trước kiểm tra tinh khiết peak phải tạo Processing method Trong cửa sổ Review, nhấp vào biểu tượng xuất cửa sổ Review Main chọn Window → Main window để Nhấp vào biểu tượng chọn Process → Apply Method Set để trích xuất xử lý kênh chọn Method set tạo Chọn tab Peaks phía cửa sổ Review Main để kết tinh khiết peak Peak xem tinh khiết giá trị Purity Angle < Purity Threshold 20 Có nhiều cách để xem kết quả, có thể sử dụng Spectrum Index xem sổ Results  Spectrum Index Hiện Spectrum Index tool: nhấp chuột phải vào toolbar, chọn Spectrum Index; chọn View → Toolbar → Spectrum Index 21 Nhấp (Maximum impurity – Pass 1) để phổ tính khiết vùng Spectrum Index Phổ UV vùng trích tại vị trí nét đứt sắc ký đồ Zoom vào peak để xem trùng khít phổ UV từ vị trí trích xuất từ peak Peak Không trùng khớp Peak Không trùng khớp Peak Trùng khớp  Cửa sổ result Nhấp hay chọn Windows → Results Window để cửa sổ Results 22 Nhấp vào tab Purity khung tab Purity Plot khung cuối - Purity Plot sắc ký đồ peak chọn đường thể Purity Angle, Purity Threshold - Purity thông tin độ tinh khiết peak Chọn peak khung the Peak list 23 - Để xuất điểm không tinh khiết Purity plot, nhấn chuột phải Purity Plot, chọn Properties để mở hộp thoại Plot Properties - Trong tab Purity, chọn Annonate Peak Apex/Max Impurity - Lúc vùng Purity Plot xuất điểm không tinh khiết đánh dấu chữ “M”, đỉnh peak đánh dấu đường thẳng vng góc với đường 24 ... Manager  control  prime seal wash - Máy tự động prime, rửa khoảng 2-4 phút Wash needle 2.3 * Vào Sample Manager  Control  Wash needle Những lưu ý chung trình chạy máy Cột 3.1 Cân cột - Với pha động... chạy tùy vào thời gian set chạy Instrument method - Lưu tên Sample set để lần chạy cần chỉnh sửa danh sách mẫu chạy Bấm run: chế độ chạy: - Chạy toàn mẫu sample set - Chạy mẫu đánh dấu 10... Prime lại kênh pha đệm với Nước, - Rửa cột - Tắt đèn - Tắt máy - Ghi sổ Nếu cần trợ giúp có cố xảy đề nghị báo cho người quản lí máy? ?? Xem kết tạo Processing method Từ hộp thoại khởi động phần