Đang tải... (xem toàn văn)
Bệnh huyết sắc tố H (HbH) là một trong các thể bệnh của bệnh α thal với ba trên bốn gen α globin của cơ thể bị đột biến. Mục tiêu: Phát hiện các đột biến gen α globin gây bệnh HbH bằng các kỹ thuật phân tử.
tạp chí nhi khoa 2016, 9, ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN α GLOBIN GÂY BỆNH HEMOGLOBIN H Ngô Thị Tuyết Nhung*, Lý Thị Thanh Hà*, Ngô Diễm Ngọc*, ,Nguyễn Thị Phương Mai*, Ngô Mạnh Tiến*, Nguyễn Thị Mai Hương*, Nguyễn Thị Mai Hương** * Khoa Di truyền Sinh học phân tử- Bệnh viện Nhi Trung ương ** Khoa Huyết học lâm sàng- Bệnh viện Nhi Trung ương TÓM TẮT Alpha thalassemia (α thal) bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường phổ biến giới, đặc biệt vùng nhiệt đới cận nhiệt đới, có khu vực Đơng Nam Á[1,2] Bệnh huyết sắc tố H (HbH) thể bệnh bệnh α thal với ba bốn gen α globin thể bị đột biến Mục tiêu: Phát đột biến gen α globin gây bệnh HbH kỹ thuật phân tử Đối tượng phương pháp: 40 mẫu máu ngoại vi bệnh nhi chẩn đoán mắc HbH dựa lâm sàng Bệnh viện Nhi TƯ Các kỹ thuật phân tử bao gồm: Multiplex Gap PCR, CARMS PCR , giải trình tự gen, MLPA để phát đột biến gen α globin Kết quả: Tỷ lệ phát đột biến 40/40(100%) Kỹ thuật Multiplex Gap PCR CARMS PCR phát 33/40(82,5%) bệnh nhân có kiểu gen sau: ( SEA/-HbCs); ( SEA/-α3,7); ( SEA/-α4.2); ( SEA/-HbQs), với tỷ lệ là: 17/40 (42,5%);10/40(25%); 4/40(10%); 2/40 (5%) Kỹ thuật MLPA phát 1/40 (2,5%) bệnh nhân mang đột biến ( SEA/-HbA1) 4/40 (10%) bệnh nhân mang đột biến ( SEA/-c.2delT), 1/40(2,5%) bệnh nhân mang đột biến ( SEA/c.92G>A),1/40(2,5%) bệnh nhân mang đột biến( SEA/- c.426A>T) phát phương pháp giải trình tự gen HbA1, HbA2 Kết luận: 100% bệnh nhân HbH phát đột biến gen α globin bằng kỹ thuật phân tử, có ba đột biến gặp Điều có ý nghĩa quan trọng điều trị, tiên lượng bệnh, tư vấn di truyền chẩn đốn trước sinh cho gia đình có nguy cao sinh mắc bệnh HbH Từ khóa: HbH, α Thalassemia, Multiplex Gap PCR, CARMS PCR, giải trình tự gen, MLPA ĐẶT VẤN ĐỀ Alpha thalassemia bệnh di truyền đơn gen phổ biến, nguyên nhân hàng đầu gây thiếu máu, tan máu trẻ em, đột biến gen α-globin nằm cánh ngắn NST 16 (16p13.3) quy định, gây giảm tổng hợp chuỗi α globin [1] Người bình thường có tổng số gen α globin, nằm hai nhiễm sắc thể (NST) số 16 tương đồng, NST 16 có gen α globin (αα/ αα) Trong bệnh HbH, NST 16 hoàn toàn hai gen α globin, NST 16 tương đồng lại đột biến gen α globin Hậu thiếu hụt tổng hợp chuỗi α globin dẫn đến tăng tổng hợp chuỗi β globin, tạo thành chuỗi β4, Hemoglobin H (HbH)[1,2] Bệnh HbH chia thành hai thể, dựa vào hai loại đột biến gặp gen α globin: 80 đột biến đoạn đột biến không đoạn Thông thường, 90% bệnh đột biến đoạn gen gây nên kết hợp đột biến hai gen α globin NST 16 đột biến gen α globin NST 16 cịn lại Trong đó, kiểu đoạn gen dạng SEA ( SEA), Thailand( THAI), Philipin ( FIL), α 4.2 (-α4.2), α3.7(α3.7) kiểu đoạn thường gặp quần thể người Trung Quốc Đông Nam Á [ 7,8] Bệnh HbH không đoạn gen chiếm khoảng 10% Thể bệnh kết hợp hai gen α globin NST 16 đột biến điểm gen α globin NST 16 cịn lại, đột biến điểm Hb Constant Spring (HbCs), Hb Qzuong Sze (HbQs) gen α2 đột biến điểm thường gặp quần thể người Trung Quốc Đông Nam Á[4,5,8] phần nghiên cứu Bệnh HbH gây thiếu máu lâm sàng nhiều mức độ khác nhau, có khơng phụ thuộc truyền máu, tử vong biến chứng truyền máu Do đó, việc xác định loại đột biến gây bệnh HbH đóng vai trị quan trọng vấn đề tiên lượng mức độ bệnh để đưa định điều trị phù hợp, đặc biệt việc tư vấn di truyền chẩn đốn trước sinh Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Xác định đột biến gen α globin gây bệnh HbH kỹ thuật phân tử ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng Nghiên cứu thực 40 bệnh nhi Bệnh viện Nhi Trung ương, từ tháng 1/2016 đến tháng 8/2016 2.2 Phương pháp 2.2.1 Kỹ thADN tách trực tiếp từ mẫu máu ngoại vi (chống đông EDTA) Kit QiaAmp DNA mini kit (Qiagen, Đức) 2.2.2 Kỹ thuật Multiplex Gap Polymerase Chain Reaction( Multiplex Gap PCR) Kỹ thuật Multiplex Gap PCR thực Khoa Di truyền Sinh học phân tử Bệnh viện Nhi Trung ương để sàng lọc loại đột biến đoạn gen gen thường gặp quân thể người châu Á: SEA ( SEA) (1349 bp), α 4.2 (-α4.2) (1628 bp), α 3.7(-α3.7) (1800 bp), Philipin ( FIL) (560 bp), Thailand( THAI) (411 bp) 2.2.3 Kỹ thuật CAMRS PCR (Combine Amplification Refractory Mutation System-PCR) Kỹ thuật CARMS PCR sàng lọc hai đột biến điểm HbCs (Hb Constant Spring-283bp) HbQs (Hb Quong Sze-238 bp) 2.2.4 Kỹ thuật giải trình tự gen Giải trình tự gen thực máy ABI 3130 Kết phân tích phần mềm Chromas Chromas Pro, sau đưa lên Ngân hàng gene (Gene Bank) để so sánh với trình tự chuẩn Kỹ thuật sử dụng để sàng lọc đột biến điểm khác gen HbA1, HbA2 2.2.5 Kỹ thuật Multiplex Ligation-Dependent probe Amplification (MLPA) Kỹ thuật MLPA (MRC-Holland, Hà Lan) thực cách sử dụng đầu dò thương mại P140-B4 để phát đột biến đoạn lớn Kết phân tích phần mềm COFALYSER KẾT QUẢ Trong nghiên cứu này, phát 40/40 mẫu mang đồng thời hai đột biến gây bệnh HbH, đó: 33/40mẫu phát kỹ thuật Multiplex Gap PCR CARMS PCR, chiếm 82.5%, 07/40 mẫu phát phương pháp giải trình tự gen HbA, HbA2 01/40 mẫu xác định kỹ thuật MLPA, chiếm 2% Có 17 mẫu mang kiểu gen ( SEA/-HbCs), chiếm 42,5%, 10 mẫu mang kiểu gen ( SEA/- α3,7), chiếm 25%, 04 mẫu ( SEA/-c.2delT), 01 mẫu mang kiểu gen ( SEA/-c.92G>A), chiếm 2.5%, 01 mẫu mang kiểu gen ( SEA/- c.426A>T) chiếm 2,5% 01 mẫu mang đột biến ( SEA/HbA1) chiếm 2,5% Bảng Kiểu gen tỷ lệ đột biến bệnh nhân HbH Kiểu gen bệnh nhân HbH Số lượng bệnh nhân Tỷ lệ % (n=40) Đột biến đoạn 15 37,5 ( SEA/-α3.7) 10 25 ( SEA/-4.2) 10 ( SEA/-HbA1) 2,5 Đột biến không đoạn 25 62,5 ( SEA/-HbCs) 17 42,5 ( SEA/-c2delT) 10 ( SEA/-HbQs) ( SEA/-c.92G>A) 2,5 ( SEA/- c.426A>T) 2,5 Tổng số 40 81 tạp chí nhi khoa 2016, 9, Hình Xác định đột biến đoạn kỹ thuật Multiplex Gap PCR M: Maker 1kp; 1: Chứng bình thường; 2:Chứng dị hợp tử SEA; 3: Chứng dị hợp tử α3.7; 4: Chứng bệnh SEA/ α4.2; 5: ADN bệnh nhân dị hợp tử SEA; 6: ADN bệnh nhân SEA/ α4.2; 7: ADN bệnh nhân dị hợp tử SEA; 8: ADN bệnh nhân SEA/ α3.7; 9: Mẫu khơng chứa ADN Hình Phát đột biến không đoạn kỹ thuật CARMS PCR M: Maker 100bp; 1: Chứng bình thường; 2:Chứng bệnh SEA/HbCs; 3: Chứng bệnh SEA/HbQs; 4: ADN bệnh nhân SEA/HbCs; 5: ADN bệnh nhân SEA/HbQs; 6: ADN bệnh nhân không bị đột biến; 7: Mẫu không chứa AND Mẫu bình thường Mẫu BN mang đột biến c.2delT Hình Đột biến c.2delT phát kỹ thuật giải trình tự gen 82 phần nghiên cứu Mẫu bình thường Mẫu BN mang đột biến c.92G>A Hình Đột biến c.92G>A phát kỹ thuật giải trình tự gen Mẫu bình thường Mẫu BN mang đột biến c.426A>T Hình Đột biến c.426A>T phát kỹ thuật giải trình tự gen Mẫu bình thường Mẫu BN mang đột biến đoạn HbA1 Hình Đột biến đoạn HbA1 phát phương pháp MLPA 83 tạp chí nhi khoa 2016, 9, BÀN LUẬN Trong tổng số 40 bệnh nhân nghiên cứu, có 25/40 (62,5%) người mắc HbH thuộc nhóm đột biến khơng đoạn,15/40 (37,5%) thuộc nhóm đột biến đoạn Người mang kiểu gen (- - SEA/HbCs) chiếm tỷ l ệ cao nhất: 42,5%, người mang kiểu gen (- - SEA/- α 3.7): 25%; người mang kiểu gen (- - SEA/ HbQs): 5%, ( SEA/-α4.2): 10% Kết phù hợp với số nghiên cứu khác tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc Trong 435 bệnh nhân HbH nghiên cứu tỉnh Quảng Đơng, có 328/435 (75,6%) người mắc HbH thuộc nhóm đột biến khơng đoạn, 107/435 (25,4%) thuộc nhóm đột biến đoạn[ 4,6] Một nghiên cứu khác Thái Lan, người mang kiểu gen (- - SEA/HbCs): 181/355 (51%), người mang kiểu gen (- - SEA/-α 3,7): 135/355 (38%), tỷ lệ người mang kiểu gen ( SEA/HbQs), ( SEA/-α4,2) là: 5/355 (1,4%) 2/355 (0,6%) Tuy nhiên, kết có đặc điểm khác biệt so với nhiều nghiên cứu khác [1,4,8] Do đó, để kết luận tỷ lệ phân bố kiểu gen bệnh nhân HbH, tiếp tục tiến hành nghiên cứu khảo sát cỡ mẫu lớn Trong nghiên cứu này, sử dụng kỹ thuật Multiplex Gap PCR CARMS PCR để sàng lọc đột biến có tần suất gặp cao người Đông Nam Á: SEA, α 3.7, α4,2, Thailand, Philipin, HbCs, HbQs, phát 33/40(82,5%) mẫu mang đột biến, mẫu phát đột biến đoạn gen SEA Trong trường hợp chúng tơi tiến hành giải trình tự gen MLPA để tìm đột biến cịn lại Đối với mẫu phát đột biến (SEA), chúng tơi tiếp tục tiến hành giải trình tự gen phát đột biến điểm c.2delT(ATG>A-G), đột biến điểm c.92G>A,1 đột biến điểm c.426A>T sử dụng kỹ thuật MLPA phát đột biến mât đoạn gen HbA1 Đặc biệt đột biến điểm c.426A>T (p.Term143Tyr) đột biến điểm gây bệnh Hemoglobin Pakse phát mức độ phân tử Việt Nam Phát bước đầu mang nhiều ý nghĩa, đóng vai trò quan trọng việc xác định đột biến gặp đột biến Bệnh HbH bệnh tan máu mạn tính nhiều mức độ khác Dựa vào hai loại đột biến gặp gen α globin, bệnh HbH chia thành hai thể: đột biến đoạn (deletional type) đột biến không đoạn (non-deletional type) Bệnh 84 không đoạn gen thường có biểu lâm sàng nặng loại đoạn gen [7] Do đó,việc xác định loại đột biến gây bệnh HbH đóng vai trị quan trọng vấn đề tiên lượng mức độ bệnh để đưa định điều trị phù hợp, đặc biệt việc tư vấn di truyền chẩn đoán trước sinh KẾT LUẬN Tỷ lệ phát đột biến 40/40 (100%) Kỹ thuật Multiplex Gap PCR CARMS PCR phát 33/40(82,5%) bệnh nhân, kiểu gen ( SEA/-HbCs) chiếm tỷ lệ cao nhất:17/40 (42,5%) Kỹ thuật MLPA phát 1/40 (2,5%) bệnh nhân mang đột biến ( SEA/- HbA1) 4/40 (10%) bệnh nhân mang đột biến ( SEA/- c.2delT), 1/40(2,5%) bệnh nhân mang đột biến ( SEA/-c.92G>A) ( SEA/-c.426A>T) phát phương pháp giải trình tự gen HbA1, HbA2 Việc xác định loại đột biến gây bệnh HbH đóng vai trị quan trọng vấn đề tiên lượng mức độ bệnh để đưa định điều trị phù hợp, đặc biệt việc tư vấn di truyền chẩn đoán trước sinh, giảm nguy sinh bị bệnh, làm tăng chất lượng sống TÀI LIỆU THAM KHẢO Amy Yuk-Yin Chan, Chi-Chiu So, Edmond Shiu-Kwan Ma et al A laboratory strategy for genotyping haemoglobin H disease in the Chinese J Clin Pathol 2007; 60: 931–934 Higgs DR, Vickers AOM, Wilkie I-M, et al A review of the molecular genetics of the human a-globin gene cluster Blood1989;73:1081–104 Liebhaber SA A-Thalassemia Hemoglobin 1989; 13: 685–731 Guangxi province, Southern China: clinical review of 357 patients.Acta Haematol 2010; 124(2): 86–91 Chen FE, Ooi C, Ha SY, et al Genetic and clinical features of hemoglobin H Yin XL, Zhang XH, Zhou TH, et al Hemoglobin H disease in disease in Chinese patients.N Engl J Med2000;343:544–50 Chan Pui Wah Vicky (2003) “Molecular Genetics of HbH Disease in Hong Kong Chinese” Thesis submitted for the Degree of Master Science, Dept of Pathology, Hong Kong University Fang J, Chen L, Zeng R, Tian Q,et al The Hb H disease genotypes in Southern China Hemoglobin 2014; 38(1): 76-8 ... định đột biến gặp đột biến Bệnh HbH bệnh tan máu mạn tính nhiều mức độ khác Dựa vào hai loại đột biến gặp gen α globin, bệnh HbH chia thành hai thể: đột biến đoạn (deletional type) đột biến không... chứa ADN H? ?nh Phát đột biến không đoạn kỹ thuật CARMS PCR M: Maker 100bp; 1: Chứng bình thường; 2:Chứng bệnh SEA/HbCs; 3: Chứng bệnh SEA/HbQs; 4: ADN bệnh nhân SEA/HbCs; 5: ADN bệnh nhân SEA/HbQs;... mang đột biến c.92G>A H? ?nh Đột biến c.92G>A phát kỹ thuật giải trình tự gen Mẫu bình thường Mẫu BN mang đột biến c.426A>T H? ?nh Đột biến c.426A>T phát kỹ thuật giải trình tự gen Mẫu bình thường