Đang tải... (xem toàn văn)
1.1. Đặt vấn đề Escherichia coli (E. coli) là một trong những vi khuẩn phổ biến trong đường tiêu hóa của người và động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E. coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây h
LỜI CẢM TẠTôi xin chân thành cảm ơn đến:Gia đình đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho tôi cả về vật chất lẫn tinh thần, là chỗ dựa vững chắc để tôi học tập tốt.Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường.Thầy Nguyễn Ngọc Tuân đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.BSTY Bùi Thị Thu Trang đã nhiệt tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài.BSTY Lê Hữu Ngọc, phòng thực hành Kiểm nghiệm Thú sản và Môi Trường, Khoa CNTY Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.Quý thầy cô, cán bộ công chức tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa sinh Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập.Chân thành cảm ơnĐàm Thị Minh ThơTÓM TẮTiii ĐÀM THỊ MINH THƠ, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 9/2005. “ỨNG DỤNG KĨ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC CỦA NHÓM E. COLI SẢN SINH ĐỘC TỐ SHIGA (STEC) PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ PHÂN BÒ, HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ”. Hội đồng hướng dẫn:PGS. TS Nguyễn Ngọc TuânBSTY Bùi Thị Thu Trang Đề tài được thực hiện nhằm phát hiện các gen độc lực stx1, stx2, eae, ehxA, và gen uid của vi khuẩn E. coli được phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, heo, bê và 9 mẫu bề mặt thịt bò bằng kỹ thuật multiplex – PCR. Quan sát và ghi nhận trên môi trường MAC chỉ có một loại khuẩn lạc hồng, trên môi trường SMAC có hai loại khuẩn lạc hồng và trắng, trên môi trường CT-SMAC cũng có hai loại khuẩn lạc hồng và trắng. Mỗi nhóm chọn khoảng 6 – 10 khuẩn lạc riêng lẻ. Ly trích DNA theo nhóm khuẩn lạc và từng khuẩn lạc riêng lẻ theo phương pháp nhiệt. Kết quả multiplex - PCR được ghi nhận như sau: (1) Nhóm khuẩn lạc có mang gen độc lực thì chưa chắc từng khuẩn lạc riêng lẻ có mang gen độc lực đó.(2) 100% mẫu phân tiêu chảy đều có E. coli mang gen gây dung huyết ehxA. Tần số phát hiện gen stx của E. coli từ những mẫu phân tiêu chảy lần lượt là: 50% ở bò, 44,4% ở heo cai sữa và 100% trên bê. Ở phân bò tiêu chảy: có 5/10 mẫu (50%) phát hiện E. coli mang gen độc lực thuộc nhóm Stx; 10/10 mẫu (100%) phát hiện E. coli mang gen ehxA; 4/10 mẫu (40%) E. coli mang gen stx2, 1/10 mẫu (10%) E. coli mang gen stx1; và không phát hiện được gen uid và eae.Ở phân heo cai sữa tiêu chảy: có 4/9 mẫu (44,4%) phát hiện E. coli mang gen stx, trong đó có ¼ mẫu mang gen stx1 (25%) và ¾ mẫu mang gen stx2 (75%), không có mẫu nào mang gen uid và eae, 9/9 mẫu (100%) mang gen ehxA.Ở phân bê tiêu chảy: có 8/8 mẫu (100%) phát hiện được ít nhất 1 gen độc lực, có mẫu phát hiện 2 -3 gen độc lực; 8/8 mẫu (100%) phát hiện được gen ehxA; 7/8 mẫu (87,5%) phát hiện được gen stx1; 1/8 mẫu (12,5%) phát hiện được gen stx2. Trong khi đó, không phát hiện được gen uid trong bất kì mẫu nào, 7/8 (87,5%) mẫu đều hiện diện cả gen ehxA và stx. (3) 9 mẫu bề mặt thịt bò khảo sát hoàn toàn chưa phát hiện được gen độc lực của E. coli.(4) Chưa phát hiện được gen uid và eae trong 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, bê và heo cai sữa; và 9 mẫu bề mặt thịt.SUMMARYiv “The application of multiplex - PCR in detecting some virulent genes ofE. coli isolated from diarrhea faeces of bovine and swine, swabs of beef surface”The study was carried out to detect stx1, stx2, eae, ehxA and uid genes of isolated E. coli from 27 diarrhea stools samples of bovines, calves, piglets, and 9 swabs of the beef surface by multiplex - PCR. There was the observing on each the isolating medium: one kind of pink colony on MAC (HM), white colony on SMAC (TS), pink colony on SMAC (HS), white colony on CT-SMAC (TCT), and pink colony on CT-SMAC (HCT). Each colony group was chosen about 6 – 10 separate colonies. DNA of the colony groups and each separate colonies were extracted by the heat method. The results of multiplex - PCR were showed that:(1) The colony group had virulent genes, the separate colony belonging to that group did or did not have those genes.(2) Frequency of ehxA gene of isolated E. coli from diarrhea stools samples was 100%; stx gene was 50% from bovine; 100% from calves; 44.4% from piglets.In diarrhea bovine stools samples: 5 of 10 samples (50%) detected E. coli carrying stx gene, all of 10 samples (100%) were detected E. coli carrying ehxA gene, 4 of 10 samples (40%) were detected E. coli carrying stx2, 1 of 10 samples (10%) were detected E. coli carrying stx1, none of those samples were detected E. coli carrying uid and eae.In diarrhea piglet stools samples: 4 of 9 samples (44.4%) were detected E. coli carrying stx, including of 1 of 4 samples were detected E. coli carrying stx1 (25%) and 3 of 4 samples were detected E. coli carrying stx2 (75%); all of 9 samples (100%) were detected E. coli carrying ehxA, and no sample was detected E. coli carrying uid and eae.In diarrhea calf stools samples: all of 8 samples (100%) were detected no less than one virulent gene, some samples were detected 2-3 virulent genes; 7 of 8 samples (87.5%) were detected stx1 gene; 1 of 8 samples (12.5%) was detected stx1 gene; all of 8 samples (100%) were detected ehxA gene. Meanwhile, no sample was detected uid and eae genes; 7 of 8 samples (87.5%) were detected E. coli carrying both ehxA and stx genes.(3) 9 swabs samples were investigated but no sample contained the E. coli carrying the virulent genes . (4) In the 27 diarrhea bovine, calf, piglet stools samples, uid and eae genes have not been detected yet.v MỤC LỤC TRANG Lời cảm tạ .iiiTóm tắt . ivSummary vMục lục .viDanh sách các chữ viết tắt .ixDanh sách các bảng xDanh sách các sơ đồ, biểu đồ, hình xi1. MỞ ĐẦU 11.1. Đặt vấn đề 11.2. Mục tiêu – yêu cầu 2 1.2.1. Mục tiêu .21.2.2. Yêu cầu .22. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .32.1. Vi khuẩn E. coli .32.1.1 Đặc điểm sinh học .32.1.2. Yếu tố kháng nguyên 32.1.3. Phân loại E. coli 42.2. Shiga toxigenic E. coli (STEC) .52.2.1.Thuật ngữ 52.2.2. Các yếu tố liên quan đến đặc tính gây bệnh của STEC .62.2.2.1. Độc tố Shiga (Stx) . 62.2.2.2. Enterohemolysin 82.2.2.3. Yếu tố bám dính . 82.2.3. Cách sinh bệnh . 92.2.4. Khía cạnh lâm sàng .102.2.5. Dịch tễ học .112.2.6. Chẩn đoán . 122.2.7. Phòng ngừa . 12vi 2.3. Serotype O157:H7 .122.4. Kỹ thuật PCR . 142.4.1. Khái niệm .142.4.2. Nguyên tắc 142.4.3. Các thành phần cần thiết của phản ứng PCR .152.4.4. Phân tích kết quả PCR 162.4.5 Multiplex – PCR 162.4.6. Ứng dụng 163. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 183.1.Thời gian và địa điểm thực hiện .18 3.1.1. Thời gian .183.1.2. Địa điểm 183.2. Nội dung thực hiện .183.3. Phương pháp thực hiện .183.3.1 Vật liệu thí nghiệm cơ bản .183.3.2. Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu 193.3.2. Nuôi cấy và phân lập E. coli .193.3.2.1. Môi trường nuôi cấy 193.3.2.2. Qui trình phân lập, định tính .19(1) Nuôi cấy và phân lập 19(2) Chọn khuẩn lạc E. coli 20(3) Thử sinh hóa 203.3.3. Ly trích DNA .203.3.4. Qui trình multiplex – PCR .223.3.5. Điện di, đọc kết quả 234. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 244.1. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bò tiêu chảy 244.2. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân heo con cai sữa tiêu chảy 26vii 4.3. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bê tiêu chảy 284.4. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ bề mặt thịt bò 294.5 Tổng kết kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trên các mẫu khảo sát có nguồn gốc từ bò và heo .315. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .345.1. Kết luận 345.2. Tồn tại và đề nghị .346. TÀI LIỆU THAM KHẢO .367. PHỤ LỤC 41viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮTA/E Attaching-and-effacingCT - SMAC Cefixime Tellurite Sorbitol MacConkey dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DNA Deoxyribonucleic acidEae E. coli attaching and effacingFAO Food and Agriculture OrganizationFDA Food and Drug Administration HC Haemorrhagic colitisHCT Khuẩn lạc hồng trên môi trường CT - SMACEhxA HaemolysinHM Khuẩn lạc hồng trên môi trường MAC HS Khuẩn lạc hồng trên môi trường SMACHUS Haemolytic uraemic syndromeIMViC Indol, Methyl Red, Voges-Proskauer, Simmon CitrateMAC MacConkey NA Nutrient agarPCR Polymerase chain reactionPVC Môi trường pepton đệm có bổ sung vancomycin và cefiximeSMAC Sorbitol MacConkey STEC Shiga toxin-producing E. coli Stx Shiga toxinTBE Tris borate EDTATCT Khuẩn lạc trắng trên môi trường CT - SMACTS Khuẩn lạc trắng trên môi trường SMACUV Ultra violetix VSV Vi sinh vật VT VerotoxinVTEC Verotoxigenic E. coli DANH SÁCH CÁC BẢNGBẢNG TRANGBảng 2.1. Danh pháp các thành viên trong họ Stx 6Bảng 3.1. Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng multiplex – PCR 22Bảng 4.1. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trong từng nhóm khuẩn lạc (HM, TS, và HS) ở phân bò tiêu chảy .25Bảng 4.2. Kết quả phát hiện gen độc lực E. coli từng khuẩn lạc riêng lẻ ở phân bò tiêu chảy .26Bảng 4.3. Kết quả phát hiện gen độc lực của nhóm khuẩn lạc đại diện cho E. coli trong phân heo cai sữa tiêu chảy 27Bảng 4.4. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trong từng nhóm khuẩn lạc ở phân bê tiêu chảy 29Bảng 4.5. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trên bề mặt thịt bò .30Bảng 4.6. Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli trên 36 mẫu khảo sát 32x DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ, HÌNHSƠ ĐỒ TRANGSơ đồ 3.1. Qui trình phân lập, định tính E. coli và phát hiện gen độc lực .21BIỂU ĐỒBiểu đồ 4.1. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli trên 36 mẫu khảo sát .32HÌNHHình 4.1. Kết quả điện di sản phẩm multiplex - PCR .33 xi xii . 9/2005. ỨNG DỤNG KĨ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC CỦA NHÓM E. COLI SẢN SINH ĐỘC TỐ SHIGA (STEC) PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ PHÂN BÒ, HEO TIÊU. eae, ehxA, và gen uid của vi khuẩn E. coli được phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, heo, bê và 9 mẫu bề mặt thịt bò bằng kỹ thuật multiplex – PCR. Quan