Đang tải... (xem toàn văn)
Mục đích của nghiên cứu nhằm đánh giá khả năng gây bệnh trên lợn của chủng virus dịch tả lợn châu Phi VNUA - ASFV - L01 phân lập được từ ổ dịch tại tỉnh Hà Nam trong năm 2019. Tiến hành gây nhiễm cho lợn thí nghiệm bằng đường tiêm bắp gốc tai với liều virus 104HAD50.
Vietnam J Agri Sci 2020, Vol 18, No 7: 510-519 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2020, 18(7): 510-519 www.vnua.edu.vn NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ ĐỘC LỰC CỦA CHỦNG VIRUS DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI VNUA - ASFV - L01 PHÂN LẬP TẠI TỈNH HÀ NAM - VIỆT NAM TRÊN LỢN THÍ NGHIỆM Trương Quang Lâm*, Nguyễn Thị Lan, Đào Lê Anh, Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Thu Hương Phịng thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam * Tác giả liên hệ: tqlam@vnua.edu.vn Ngày chấp nhận đăng: 23.06.2020 Ngày nhận bài: 18.05.2020 TĨM TẮT Mục đích nghiên cứu nhằm đánh giá khả gây bệnh lợn chủng virus dịch tả lợn châu Phi VNUA - ASFV - L01 phân lập từ ổ dịch tỉnh Hà Nam năm 2019 Tiến hành gây nhiễm cho lợn thí nghiệm đường tiêm bắp gốc tai với liều virus 10 HAD50 Lợn thí nghiệm biểu sốt cao sau 48 gây nhiễm, suy hô hấp xuất huyết da sau 5-6 ngày gây nhiễm Tất lợn thí nghiệm gây nhiễm chết vòng 7-9 ngày sau gây nhiễm với triệu chứng lâm sàng điển sốt cao (41-42°C), tiêu chảy, nôn mửa, ăn, phản xạ kém, suy hô hấp, xuất huyết da, biểu thần kinh, hôn mê; bệnh tích đại thể quan sát thấy mổ khám xuất huyết điển hình mơ, xuất huyết hạch lympho, thận, lách, màng não, tim lách sưng thấm dịch, gan túi mật sưng Kết phân tích virus huyết phương pháp realtime PCR cho thấy vào ngày thứ sau gây nhiễm bắt đầu có xuất virus DTLCP máu, virus nhân lên mạnh máu từ ngày 3-6 sau gây nhiễm Kết nghiên cứu bước đầu khẳng định chủng virus VNUA - ASFV - L01 có độc lực cao đốivới lợn Từ khóa: Virus dịch tả lợn châu Phi, độc lực, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể, virus huyết, thải Virulence in Experimental Pigs of Field African Swine Fever Virus Strain (VNUA - ASFV - L01) Isolated from Infected Pig in Ha Nam Province of Vietnam ABSTRACT This study aimed to assess the virulence in experimental pigs of field African swine fever virus strain (VNUA ASFV - L01) belonged to genotype which isolated from the infected pig during an outbreak occurred in Ha Nam province of Vietnam, 2019 The experimental pigs were intramuscularly inoculated with the virus at a dose of 10 HAD50 All inoculated pigs showed acute disease manifestations and died between and days post-infection (dpi) with clinical features of ASF including high fever (41-42°C), diarrhea, vomiting, loss of appetite and reflexes, depression, respiratory distress, haemorrhages in the skin, neurological signs, coma and death Haemorrhagic lesions were typically observed in multiple tissue organ in ASFV infected pigs with remarkable signs of diffuse hemorrhages in lymph nodes, renal cortex, haemorrhagic spleen, swollen liver, edema of the gall bladder, and hemorrhagic meninges Analysis of viremia in the blood of pigs by real-time PCR showed that ASFV viremia was detected in the blood of pigs at days post-inoculation, thereafter rapidly replication of field virus strain was observed in the blood of infected pigs at a later time point post-infection (days to 6) These initial results indicate that VNUA ASFV - L01 strain is highly virulent in pigs Keywords: African swine fever virus (ASFV), Virulence, clinical signs, pathological lesions Viremia, shedding ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh dðch tâ lĉn Châu Phi (DTLCP) African swine fever virus (ASFV) cũ kớch thỵc genome ln (khoõng 170-190 kilobase) mó húa 510 tỵng ng cho 151 n 157 protein, virus DNA sĉi kép (chi Asfarvirus) thuộc họ Asfarviridae gây ć lĉn nhà lĉn rÿng (Tulman & cs., 2009) Bệnh cú biu hin xuỗt huyt trn lan nhiu c quan vĆi tČ lệ tā vong lên tĆi 100% Trương Quang Lâm, Nguyễn Thị Lan, Đào Lê Anh, Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Thu Hương (Gómez-Villamandos & cs., 2013; Zao & cs., 2019; FAO, 2020) ASF ỵc cụng b lổn đæu ć Kenya vào nëm 1921 (Eustace Montgomery, 1921), sau đò nhanh chòng lan rộng quốc gia châu Phi, châu Âu, châu Mč châu Á khác (Gómez-Villamandos & cs., 2013; Zao & cs., 2019, FAO, 2020) Trên giĆi, nhà khoa học têp trung nghiên cĀu phân lêp chûng độc lăc nhỵc c t nghiờn, nghiờn cu c lc v phỏt triển vacxin phòng bệnh DTLCP (Rowlands & cs., 2008; Dixon & cs., 2013; Gallardo & cs., 2019; Zhao & cs., 2019) Đáng ċ, nëm 2007 2019 nhòm nghiên cĀu cûa Rowlands & Zhao phån lêp thành công chûng độc lăc cao ASFV Georgia 2007 Pig/Heilongjiang/2018 thuộc genotype II tÿ lĉn nhà täi Georgia Trung Quốc, đåy cüng genotype gåy bệnh ć châu Âu, Trung Quốc Việt Nam thąi gian qua, m c hi cho cỏc hỵng nghiờn cu phũng bệnh điều trð bệnh bìng vacxin, chế phèm tớnh ng dýng thc t cỷa hỵng nghiờn cu ny toàn giĆi (Rowlands & cs., 2008; Dixon cs., 2013; Reis & cs., 2016; O’Donnell & cs., 2017; Sánchez-Cordón & cs., 2017b; Zhao & cs., 2019) Cho đến nay, nghiờn cu sõn xuỗt vacxin phũng DTLCP vộn ang gặp nhiều cân trć thiếu thơng tin đỉy đû cĄ chế gây bệnh miễn dðch Bệnh bùng phát læn đæu tiên täi Việt Nam vào đæu tháng 2/2019, sau đị nhanh chịng lan rộng khíp tỵnh thành tồn quốc (63/63 tỵnh, thành phố) vĆi hĄn triệu lĉn bð tiêu hûy tính đến đæu tháng 5/2020, bệnh đe dọa nghiêm trọng đến ngành chën ni lĉn täi Việt Nam Chính phû, cĄ quan quõn lý nh nỵc v cỏc nh khoa hc Việt Nam gặp nhiều khị khën kiểm sốt, nghiên cĀu bệnh DTLCP đặt nhiệm vý trọng tồm i vi nghiờn cu khốn cỗp cỏc giõi phỏp tổng thể phòng, chống dðch bệnh DTLCP Trong đò, nghiên cu v sõn xuỗt vacxin phũng bnh DTLCP t cỏc chỷng virus gõy bnh tọi Vit Nam l hỵng i rỗt cổn thit, mang tớnh bn vng, lõu di Vi mýc tiêu làm tiền đề cho nghiên cĀu sâu vacxin Dðch tâ lĉn châu Phi, việc nghiên cĀu phân lờp, la chn ỵc chỷng virus ọi din ọt cỏc tiêu chí đặc tính sinh học, tính độc lăc, tính sinh miễn dðch ổn đðnh tÿ chûng virus DTLCP phõn lờp ỵc t cỏc dch ũng vai trủ quan trng v cỗp thit Chỷng virus DTLCP ký hiu VNUA - ASFV L01 ỵc Phũng Thớ nghim trọng điểm công nghệ sinh học Thú y phân lêp thành công tÿ méu bệnh phèm thu thêp tÿ ổ dðch täi tỵnh Hà Nam, Việt Nam vào tháng nởm 2019 Chỷng virus ỵc nuụi cỗy v phỏt trin tt trờn mụi trỵng t bo ph nang ln (PAM) gúp phổn la chn ỵc chỷng virus DTLCP thớch hp dựng sõn xuỗt vacxin, nghiờn cu ny nhóm nghiên cĀu triển khai nghiên cĀu đánh giá độc lăc, khâ nëng nhån lên thâi cûa chûng virus VNUA - ASFV - L01 lĉn thí nghiệm, tÿ đò xác đðnh khâ nëng gåy bệnh cûa chûng vi rút, làm cĄ sć cho nghiên cĀu tip theo v tọo chỷng virus v sõn xuỗt vacxin phòng bệnh DTLCP PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Chûng virus dðch tâ lĉn châu Phi VNUA ASFV - L01 ọt hiu giỏ 7.5 x 106 HAD50/ml ỵc phân lêp tÿ méu lách cûa lĉn nhiễm bệnh täi tỵnh Hà Nam vào tháng nëm 2019 täi Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ sinh học Thú y, Khoa Thú y 2.2 Phương pháp phân lập hiệu giá virus DTLCP Lĉn khóe mänh, 6-7 tn tuổi, âm tớnh vi virus v khỏng th DTLCP, ỵc la chn để thu tế bào đäi thăc bào phế nang phổi (OIE, 2019) Chuèn bð tế bào đäi thăc bào phế nang phổi nhĂng khay 12, 24 48 giếng Cỏc mộu bnh phốm chốn oỏn dỵng tớnh vi virus dch tõ ln chõu Phi bỡng phỵng phỏp realtime PCR ỵc x lý thnh huyn dch sau ũ gõy nhim 100µl huyễn dðch giếng tế bào, û 37C điều kiện có 5% CO2 tiếng Lội bó dðch gây nhiễm rāa läi bìng PBS 1X 511 Nghiên cứu đánh giá độc lực chủng virus dịch tả lợn châu Phi VNUA - ASFV - L01 phân lập tỉnh Hà Nam Việt Nam lợn thí nghiệm bổ sung penicillin, streptomycin, neomycin gentamycin khỏng nỗm (antifungal) B sung mụi trỵng RPMI 10% FBS hoc 10% PS, 1% khỏng sinh, 1% khỏng nỗm, 2% hng cổu ln, nuụi cỗy iu kin 37C vi 5% CO2, theo dõi bệnh tích hìng ngày Chûng virus sau phõn lờp, cỗy chuyn i ỵc xỏc nh hiu giỏ bỡng phỵng phỏp pha loóng c s 10, sau ũ gõy nhim t bo nhỵ mụ tõ mýc phân lêp vi rút Sau đò, cën cĀ vào nồng độ pha lỗng, số giếng có bệnh tích tế bào, tČ lệ bð nhiễm virus ć nhĂng giếng cò độ pha lỗng virus khác mà tính log HAD50 s dýng phỵng phỏp Reed & Muench 50àl, vi điều kiện phân Āng tuân theo nghiên cĀu cụng b Sõn phốm PCR dỵng tớnh s ỵc tinh säch trăc tiếp bìng sinh phèm QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) theo hỵng dộn cỷa nh sõn xuỗt Sõn phốm PCR tinh sọch sau ũ s ỵc s dýng giõi trỡnh t bỡng phỵng phỏp Sager Trỡnh t nucleotide ỵc phõn tớch bỡng phổn mm Bioedit Dng cỏc phát sinh chûng lồi vĆi trình tă gen ó xỏc nh bỡng phổn mm MEGA 4.1 theo phỵng pháp Neighbor Joining vĆi giá trð Bootstrap 1.000 Các trỡnh t tham chiu trờn th gii s ỵc thu nhên tÿ GenBank 2.3 Tách chiết DNA 2.5 Gây nhiễm đánh giá độc lực lợn thí nghiệm DNA tng s ỵc tỏch chit t huyn dch mộu bnh phốm lỏch v dch nuụi cỗy t bo, s dýng hệ thống chiết tách DNA tă động (Kingfisher Duo Prime, Thermo Scientific, Mč) vĆi Kit chiết tách DNA tổng số thỵng kốm theo h thng tỏch chit (Thermo Scientific, M) Cỏc bỵc chit tỏch DNA tng s ỵc thc hin theo hỵng dộn cỷa nh sõn xuỗt 2.4 Phng pháp PCR Realtime PCR Phân Āng realtime PCR phát hin virus DTLCP ỵc thc hin bỡng cp mi probe (p72) theo quy trỡnh ó cụng b trỵc ồy (Tignon, 2011) Sõn phốm DNA tng s tỏch chit ỵc phi trộn vĆi cặp mồi probe thành phæn cûa Quantabio One-Step RT-qPCR ToughMix Kit (Quantabio, Mč) thăc theo quy trỡnh ó ỵc cụng b (OIE 2019; Tignon, 2011) Kt quõ ỵc phõn tớch da trờn mc DNA cûa virus DTLCP méu xét nghiệm thông qua giỏ tr chu k ngỵng (threshold cycle values: Ct, Ct
