BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG I HC Y H NI TH HIN XáC ĐịNH NGƯờI LàNH MANG GEN BệNH HEMOPHILIA A BằNG Kỹ THUậT MICROSATELLITE-DNA LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ĐỖ THỊ HIẾN X¸C ĐịNH NGƯờI LàNH MANG GEN BệNH HEMOPHILIA A BằNG Kỹ THUËT MICROSATELLITE-DNA Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số: 60720106 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Vân Khánh HÀ NỘI – 2016 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, thực luận văn này, nhận nhiều quan tâm, động viên quý báu từ Thầy Cô giáo, đồng nghiệp, gia đình bạn bè Bằng tất kính trọng tình cảm chân thành nhất, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Vân Khánh, Phó Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trưởng Bộ môn Bệnh học phân tử, Khoa Kỹ thuật Y học, Trường Đại học Y Hà Nội, người Thầy hết lịng quan tâm giúp đỡ, tận tình bảo, trực tiếp hướng dẫn từ ngày đầu làm luận văn Cơ ln khích lệ, động viên tơi lúc tơi gặp khó khăn học tập sống Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Tạ Thành Văn, Phó Hiệu trưởng, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trưởng Bộ mơn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội, người Thầy truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu tạo điều kiện thuận lợi để giúp tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy, Cơ Bộ mơn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội dạy dỗ truyền đạt kiến thức quý báu trình học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn đến CN Trần Quốc Đạt, CN Nguyễn Quý Hoài toàn thể anh, chị, em trung tâm Trung tâm Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội giúp đỡ q trình học tập kỹ thuật, hồn thiện quy trình kỹ thuật nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học, Trường Đại học Y Hà Nội Ban Giám đốc, lãnh đạo Khoa Hóa sinh, cán khoa Bệnh viện Đa khoa tỉnh Thái Bình tạo điều kiện cho tơi q trình học tập nghiên cứu Xin gửi lời cảm ơn tới bệnh nhân Hemophilia A thành viên gia đình bệnh nhân giúp tơi có số liệu luận án Cuối cùng, xin ghi nhớ cơng ơn sinh thành, ni dưỡng tình u thương Cha mẹ tôi, ủng hộ gia đình, bạn bè, đồng nghiệp, người ln bên cạnh động viên, ủng hộ, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi giúp đỡ tơi hồn thiện luận văn Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2016 Học viên Đỗ Thị Hiến LỜI CAM ĐOAN Kính gửi: Phịng quản lý đào tạo Sau Đại học-Trường Đại học Y Hà Nội Bộ mơn Hóa Sinh- Trường Đại học Y Hà Nội Hội đồng bảo vệ Luận văn Thạc sỹ Y học năm 2016 Tôi Đỗ Thị Hiến, học viên cao học khóa 23 Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa Sinh, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn PGS.TS Trần Vân Khánh Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2016 Người viết cam đoan Đỗ Thị Hiến DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT HA F8 DNA cDNA RNA mRNA NST Kb bp dNTP ddNTP PCR RT-PCR EDTA SDS SNP TE STR TBE Hemophilia A Gen tổng hợp protein yếu tố VIII Deoxyribonucleic Acid Complementary Deoxyribonucleic Acid Ribonucleic Acid Messenger Ribonucleic Acid (RNA thông tin) Nhiễm sắc thể Kilo base Base pair Deoxyribonucleoside triphosphate Dideoxyribonucleoside triphosphate Polymerase Chain Reaction Reverse Transcription PCR (PCR mã ngược) Ethylendiamin Tetraacetic Acid Sodium dodecyl sulfate Single Nucleotide Polymorphism Tris – EDTA Simple Tandem Repeat Tris Borate EDTA Phe (F): Phenylalanine Arg (R): Arginine Asn (N): Asparagine Asp (D):Aspartic Cys (C): Cysteine Gly (G): Glycine His (H): Histidine Glu (E): Glutamic Leu (L): Leucine Lys (K): Lysine Pro (P): Proline Ser (S): Serine Thr (T): Threonine Trp (W): Tryptophan Tyr (Y): Tyrorine Gln (Q): Glutamine Stop codon(X): mã kết thúc Met (M): Methionine Ala (A): Alanine Val (V): Valine Ile (I): Isoleucine MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH 11 ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm bệnh Hemophilia A 1.1.1 Những đặc điểm chung .3 1.1.2 Chẩn đoán bệnh Hemophilia A 1.1.3 Điều trị bệnh Hemophilia A .9 1.1.4 Cơ chế phân tử bệnh Hemophilia A 13 1.2 Người lành mang gen bệnh Hemophilia A .21 1.2.1 Đặc điểm chung 21 1.2.2 Đặc điểm chảy máu người lành mang gen bệnh Hemophilia A .22 1.2.3 Quản lý điều trị dự phòng cho người lành mang gen bệnh Hemophilia A 24 1.2.4 Vai trò việc phát người lành mang gen bệnh Hemophilia A 24 1.3 Các phương pháp phát người lành mang gen bệnh Hemophilia A 24 1.3.1 Dựa vào hoạt tính yếu tố VIII 24 1.3.2 Dựa vào phân tích phả hệ 25 1.3.3 Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử 25 1.4 Tình hình nghiên cứu người lành mang gen bệnh Hemophilia A Việt Nam .32 Chương 35 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Đối tượng nghiên cứu .35 2.2 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất sử dụng nghiên cứu .35 2.2.1 Trang thiết bị nghiên cứu 35 2.2.2 Dụng cụ nghiên cứu 36 2.2.3 Hóa chất nghiên cứu 36 2.3 Phương pháp nghiên cứu 38 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang 38 Sơ đồ nghiên cứu: 38 2.3.2 Nội dung nghiên cứu 39 2.3.3 Địa điểm nghiên cứu 39 2.3.4 Quy trình kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 39 2.4 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 47 Chương 47 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 47 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số .48 3.2 Áp dụng kỹ thuật Microsatellite-DNA để phát người lành mang gen bệnh Hemophilia A .51 3.2.1 Phát người lành mang gen bệnh Hemophilia A kỹ thuật Microsatellite-DNA thành viên nữ gia đình bệnh nhân .51 3.2.2 So sánh kết phát người lành mang gen bệnh Hemophilia A phương pháp gián tiếp Microsatellite-DNA phương pháp trực tiếp .61 3.2.3 Tỉ lệ phát người lành mang gen bệnh Hemophilia A kỹ thuật Microsatellite-DNA 66 Chương 67 BÀN LUẬN 67 4.1 Về quy trình kỹ thuật tách chiết DNA tổng số 67 4.2 Áp dụng quy trình kỹ thuật Microsatellite-DNA để phát người lành mang gen bệnh Hemophilia A .69 KẾT LUẬN 84 Bằng việc áp dụng kỹ thuật Microsatellite-DNA, xác định 24/37 thành viên nữ mang gen bệnh (chiếm 64,9%) 13/37 thành viên nữ không mang gen bệnh (chiếm 35,1%) 10 gia đình bệnh nhân Hemophilia A .84 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Chẩn đoán thể bệnh Hemophilia A theo nồng độ yếu tố VIII Bảng 1.2 Nồng độ yếu tố đông máu cần đạt thời gian điều trị có chảy máu 11 Bảng 2.1.Trình tự mồi khuếch đại STRs sử dụng nghiên cứu 37 - Hóa chất chạy điện di: 38 Bảng 2.2 Thành phần điều kiện phản ứng PCR khuếch đại STR .45 Bảng 3.1 Kết đo nồng độ độ tinh mẫu DNA tách từ máu ngoại vi đối tượng nghiên cứu 48 Bảng 3.2 Kết xác định người lành mang gen bệnh kỹ thuật Microsatellite-DNA .60 Như sau kiểm tra ngẫu nhiên kết phát người lành mang gen bệnh Hemophilia A gia đình phương pháp giải trình tự gen trực tiếp phương pháp gián tiếp MicrosatelliteDNA, kết phương pháp tương đồng (bảng 3.3) .64 Bảng 3.3 So sánh kết phát người lành mang gen bệnh phương pháp 65 Bảng 3.4 Tỷ lệ phát người lành mang gen bệnh kỹ thuật Microsatellite-DNA .66 71 thiếu yếu tố V thiếu FVIII (F5F8D) có biểu bệnh nhân Hemophilia A thể nhẹ, bệnh nhân có nồng độ FVIII thấp có biểu triệu chứng chảy máu lâm sàng chưa phối hợp nhiều phương pháp khác để xác định đột biến Tỷ lệ thay đổi tùy theo tính xác chẩn đốn bệnh Hemophilia A hiệu phát đột biến phương pháp sử dụng Xác định vị trí đột biến gen F8 bệnh nhân Hemophilia A cung cấp nhiều lợi ích cho khoa học ứng dụng lâm sàng Đối với bệnh nhân bị bệnh Hemophilia A, tiêu chuẩn vàng để khẳng định xác chẩn đốn bệnh, ngồi hỗ trợ việc tiên lượng mức độ nghiêm trọng bệnh diễn biến lâm sàng, dự báo nguy phát triển kháng thể kháng yếu tố FVIII để từ lựa chọn phương pháp điều trị tối ưu cho bệnh nhân Đối với thành viên nữ gia đình bệnh nhân, đột biến điểm cho việc xác định người lành mang gen bệnh Hemophilia A kỹ thuật trực tiếp Với bệnh nhân chưa phát đột biến điểm thách thức cho vấn đề xác định người lành mang gen bệnh thành viên nữ gia đình bệnh nhân Hiện giới sử dụng nhiều phương pháp khác để phát người lành mang gen bệnh Hemophilia A Năm 2004, Lê Nhật Minh cộng nghiên cứu người lành mang gen bệnh Hemophilia A cách sử dụng kỹ thuật enzym cắt giới hạn (PCR-RFLP) Năm 2014, Bùi Thị Thu Hương cộng sử dụng kỹ thuật I-PCR kỹ thuật giải trình tự gen để xác định người lành mang gen bệnh gia đình xác định đột biến điểm bệnh nhân Phần lớn việc phát người lành mang gen bệnh thường thực kỹ thuật trực tiếp dựa vào đột biến điểm bệnh nhân Tuy nhiên, chi phí cho việc phát đột biến gen F8 cao khơng phải bệnh nhân có điều kiện xét nghiệm gen, số bệnh nhân xét nghiệm gen, tỉ lệ định (khoảng 72 10%) bệnh nhân chưa phát đột biến gen F8 [7] Xuất phát từ thực tế nhóm nghiên cứu áp dụng kỹ thuật Microsatellite-DNA để phát người lành mang gen bệnh Hemophilia A thành viên nữ gia đình bệnh nhân Hemophilia A kiểm tra kết phương pháp kỹ thuật giải trình tự gen, kỹ thuật đại xác [77], dựa vào việc phát đột biến điểm bệnh nhân Hemophilia A Áp dụng kỹ thuật Microsatellite-DNA hướng cho việc xác định người lành mang gen bệnh Hemophilia A nói riêng bệnh lí di truyền Việt Nam nói chung Quy trình kỹ thuật Microsatellite-DNA có sử dụng 14 cặp mồi FXS8061, DXS9897, DXS9901, FXS52, FXS8087, FXS9796, FXS7501, FXS7153, FXS1073, FXS7532, FXS1108, DXS1073, F8int13, F8int22 đánh dấu huỳnh quang để khuyếch đại vùng trình tự lặp lại STR, sản phẩm khuếch đại PCR điện di hệ thống giải trình tự gen hãng Beckman coulter phân tích kết phần mềm GeneMapper v3.2 software để xác định người lành mang gen bệnh Hemophilia A có nhiều ưu điểm so với kỹ thuật khác tính bền vững cao hơn, yêu cầu thao tác kỹ thuật hơn, phù hợp với chẩn đốn có số lượng mẫu lớn, chẩn đốn có mẫu tách DNA chẩn đốn tiền làm tổ mẫu DNA tách chiết từ tế bào Kỹ thuật Microsatellite-DNA hứa hẹn phương pháp hữu hiệu để phát người lành mang gen bệnh Hemophilia A Việt Nam Sự thành công phương pháp bước quan trọng cho việc ứng dụng tiến y học chẩn đoán tiền làm tổ khơng với bệnh Hemophilia A nói riêng mà cịn với bệnh lí di truyền nói chung Hầu hết bệnh lý di truyền thách thức lớn Y học nước ta giới Các bệnh lý di truyền chiếm tỷ lệ tử vong cao khoảng 20% trường hợp tử vong giai đoạn sơ sinh 73 chiếm tỷ lệ cao bệnh lý gặp phải thời kỳ nhũ nhi trẻ nhỏ [78] Theo thống kê tần suất mắc bệnh mức độ biểu bệnh di truyền đơn gen thay đổi tùy theo chủng tộc chiếm 2% tất trẻ sơ sinh Tỷ lệ dị tật bẩm sinh Bệnh viện Phụ Sản trung ương năm 2001-2003 2,7% Phần lớn bệnh nhân tử vong, sống dằn vặt bệnh tật, để lại hậu nặng nề cho gia đình xã hội Một bệnh di truyền bệnh Hemophilia A Hemophilia A bệnh thiếu hụt yếu tố VIII, gen cấu trúc loại protein nằm nhiễm sắc thể giới tính X, khơng có alelle tương ứng nhiễm sắc thể Y Nam giới có cặp nhiễm sắc thể giới tính XY, nữ giới XX nên người nữ mang nhiễm sắc thể X đột biến không biểu bệnh bù trừ nhiễm sắc thể X cịn lại bình thường, nam giới mang nhiễm sắc thể X bị thương tổn nên bị bệnh, hậu trình di truyền đột biến phát sinh [79] Trong trình di truyền phả hệ, gen bệnh lý dần người mang gen bệnh không sinh đẻ thể nhiễm sắc X bị thương tổn không truyền cho hệ sau mà truyền nhiễm sắc thể X bình thường Hiện nay, hạn chế hiểu biết bệnh tính chất di truyền lặn, biểu bệnh giới nữ nên bệnh âm thầm truyền qua nhiều hệ mà đến Theo nghiên cứu Street AM cộng (2008) ước tính bệnh nhân Hemophilia A có khoảng người phụ nữ có khả mang gen bệnh trạng thái dị hợp tử [80] Tại Việt Nam ước tính có khoảng 6000 người bị bệnh Hemophilia A khoảng 30.000 người mang gen bệnh Hemophilia A [81], [2] Trước đây, người ta cho rối loạn đông máu di truyền chủ yếu gặp giới nam người nữ biểu bệnh mang gen bệnh trạng thái đồng hợp tử (hiếm gặp) Còn 10 -20% người nữ mang gen bệnh trạng thái dị hợp tử sống với triệu chứng họ nhiều năm mà không chẩn đốn chí nghi ngờ họ có rối loạn chảy máu [41] Người phụ nữ 74 chắn mang gen bệnh có trai bị bệnh có bố bị Hemophilia A có trai bị bệnh có người đàn ông họ mẹ bị bệnh có trai bị bệnh gia đình họ mẹ có người chẩn đoán người lành mang gen bệnh [2] Phần lớn người mang gen F8 đột biến khơng có triệu chứng, song có triệu chứng biểu chảy máu giống bệnh nhân Hemophilia A thể nhẹ, đơi người mang gen có nguy chảy máu kéo dài cịn phải cần can thiệp y tế [68], triệu chứng chảy máu sản phụ khoa Khoảng 10% người mang gen có hoạt tính yếu tố VIII huyết tương thấp so với bình thường, chí số trường hợp người mang gen bệnh có hoạt tính yếu tố VIII huyết thấp 4% gây chảy máu tương tự thể bệnh nặng, với nồng độ yếu tố VIII từ 5% đến 40% bị chảy máu tương tự bệnh nhân thể nhẹ Khoảng 20% người lành mang gen bệnh biểu triệu chứng chảy máu với mức độ khác nhau, bao gồm người có hoạt tính yếu tố VIII huyết tương giới hạn bình thường (40 đến 60%) Điều đặt thách thức việc phát hiện, quản lý điều trị dự phòng cho đối tượng Đặc biệt phụ nữ độ tuổi sinh đẻ 18 tuổi Việc xác định sớm tình trạng mang gen với trẻ nhỏ giúp bà mẹ quan tâm đến sớm từ chu kỳ kinh nguyệt xem có kéo dài khơng, có rong kinh khơng, có đau bụng khơng … đặc biệt sở để bố mẹ chuẩn bị trước tâm lý cho con, lựa chọn thời điểm thích hợp trao đổi với bệnh tật theo nhiều trung tâm quản lý điều trị Hemophilia A nước phát triển cho thấy kinh nghiệm cần phải tránh: nhiều đứa trẻ biết thơng tin bệnh có mặc cảm tự ti, oán trách người truyền gen bệnh cho [41] Để người trưởng thành có kiến thức, kế hoạch cho tương lai, chủ động phòng tránh nguy gây chảy máu, hạn chế xuất di chứng bệnh Đây sở khoa học để tư vấn di truyền, giúp chẩn đoán trước 75 sinh, chẩn đoán tiền làm tổ với thai phụ có nguy cao sinh bị bệnh Hemophilia A [83] Cùng với nỗ lực để rút ngắn khoảng cách việc chăm sóc người lành mang gen bệnh Liên đoàn Hemophilia Thế giới [41], có nhiều phương pháp phát người lành mang gen bệnh như: phương pháp phân tích phả hệ, phương pháp I-PCR, phương pháp giải trình tự gen Việc xác định người lành mang gen bệnh dựa phân tích phả hệ gặp nhiều khó khăn: Khó khăn lớn nhiều người số họ chưa biết người mang gen bệnh thiếu hiểu biết bệnh Hemophilia A nên hỏi tiền sử, có nhiều người mẹ khơng biết hệ trước gia đình có người bị bệnh hay khơng; khó khăn thứ hai, đơi họ khơng muốn cho gia đình chồng người xung quanh biết vấn đề bệnh tật di truyền dịng họ Trên thực tế nguyên nhân thứ hay gặp không bệnh mà với nhiều bệnh di truyền khác đặc biệt nước ta trình độ học vấn, kiến thức hiểu biết người dân bệnh lý di truyền thấp, khơng có điều kiện, phương tiện để chẩn đoán phát bệnh, với bệnh di truyền lặn, gen bệnh biểu lâm sàng mà âm thầm truyền từ hệ sang hệ khác Nguyên nhân thứ hai tế nhị chịu nhiều ảnh hưởng yếu tố phong tục, tập quán làm cho người phụ nữ buộc phải dấu kín tình trạng bệnh gia đình khơng ảnh hưởng đến hạnh phúc gia đình, ảnh hưởng tới tương lai cháu họ sau Trên thực tế, có nhiều nghiên cứu phát người lành mang gen bệnh thơng qua phương pháp phân tích phả hệ nghiên cứu Nguyễn Thị Mai, Nguyễn Anh Trí, Nguyễn Thị Nữ cộng (2012) áp dụng phương pháp “lần theo dấu vết” 54 phả hệ 54 bệnh nhân Hemophilia chẩn đoán viện Huyết học – Truyền máu TW [61] Hay nghiên cứu Bùi Thị Thu Hương cộng (2014), việc phân tích phả hệ 50 gia đình bệnh nhân Hemophilia A 76 phát 43/166 người chắn mang gen bệnh, chiếm tỷ lệ khoảng 26% [8] Mặc dù phương pháp phát người lành mang gen dựa kết phân tích phả hệ công nhận song điểm hạn chế phương pháp xác định số trường hợp người lành mang gen bệnh chắn (obligate carriers) [2] Đồng thời phương pháp yêu cầu thông tin thu thập để xây dựng phả hệ địi hỏi phải thật xác, bị ảnh hưởng yếu tố chủng tộc không áp dụng cho trường hợp bệnh đơn lẻ gia đình Chính khó khăn nên việc phát người lành mang gen bệnh thường thực kỹ thuật phát đột biến trực tiếp gen F8 dựa vào đột biến điểm bệnh nhân [44], [47] Nghiên cứu Bùi Thị Thu Hương cộng sử dụng kỹ thuật I-PCR phát đột biến đảo đoạn intron 22, kỹ thuật giải trình tự toàn 26 exon phát đột biến điểm xóa đoạn, kỹ thuật đại, xác để xác định tình trạng mang gen bệnh thành viên viên nữ có huyết thống với bệnh nhân dựa vào đột biến điểm phát bệnh nhân thu kết 89/166 thành viên nữ (bao gồm bà ngoại, mẹ, bác, dì, chị em gái bệnh nhân…) người lành mang gen bệnh Hemophilia A, chiếm tỷ lệ 53,6%, 77/166 thành viên nữ (gồm bà ngoại, bác, dì, chị, em gái …) khơng mang gen bệnh, chiếm tỷ lệ 46,4% Tuy nhiên, theo nghiên cứu Lưu Vũ Dũng 2014 tỷ lệ bệnh nhân Hemophilia A chưa phát đột biến 10,3% [7] nhiều việc phát đột biến gặp khó khăn cấu trúc gen F8 lớn, kỹ thuật phân tích gián tiếp Microsatellite-DNA dựa vào phân tích vùng trình tự lặp lại STR có tính đa hình cao áp dụng để phát người lành mang gen dựa vào xác định allele đột biến [58] Kỹ thuật Microsatellite-DNA kỹ thuật gián tiếp, không dựa vào đột biến điểm bệnh nhân, khơng quan tâm tới vị trí đột biến hay dạng đột biến mà dựa vào trình tự lặp lại ngắn STR, số lần lặp lại trình tự đặc trưng cho cá thể có khả di truyền qua hệ theo định 77 luật Menden Chính từ ý nghĩa nghiên cứu tiến hành xác định người lành mang gen bệnh thành viên gia đình bệnh nhân Hemophilia A kỹ thuật Microsatellite-DNA không cần phát đột biến điểm Đây ý nghĩa thực tiễn quan trọng phương pháp * Với gia đình bệnh nhân HA11: Phân tích phả hệ gia đình bệnh nhân mã số HA11 (hình 3.3) có hai người trai bị bệnh bệnh nhân mã số HA11 (III2) cậu bệnh nhân (II4) tử vong bệnh Hemophilia A, lại có chị bệnh nhân mang thai nên việc xác định đối tượng có nguy mang gen bệnh quan trọng Kết phân tích phả hệ: mẹ bà ngoại người chắn mang gen bệnh, bác gái chị bệnh nhân người có nguy mang gen bệnh trạng thái dị hợp tử Muốn xác định chắn tình trạng mang gen thành viên nữ gia đình bệnh nhân HA11 nghiên cứu sử dụng kỹ thuật Microsatellite-DNA Để biết alelle bệnh mà người mẹ truyền cho trai bị bệnh, trước tiên cần tiến hành kỹ thuật PCR khuếch đại 14 vùng trình tự lặp lại STR đặc hiệu mẫu mẹ Kết thu marker dị hợp tử gia đình mã số HA11 DXS9901, DXS9897 Sau để xác định người lành mang gen bệnh gia đình bệnh nhân, nghiên cứu tiến hành phản ứng PCR với marker dị hợp tử tìm DXS9901, DXS9897 DNA bệnh nhân, mẹ thành viên gia đình bệnh nhân chị bác gái bệnh nhân So sánh kích thước điện di sản phẩm PCR cho thấy: vùng trình tự lặp lại DXS9901, người mẹ xuất đỉnh, đỉnh khuếch đại tương ứng với kích thước 202bp không trùng với đỉnh bệnh nhân, chứng tỏ alen bình thường (X) đỉnh khuếch đại tương ứng với kích thước 198bp trùng với đỉnh bệnh nhân, đỉnh alen đột biến (Xb) mà bệnh nhân nhận từ người mẹ Chị bệnh nhân có đỉnh, đỉnh tương ứng kích thước 202bp khơng trùng với bệnh nhân, đỉnh tương ứng kích thước 198bp trùng với bệnh nhân nên chị bệnh nhân người lành mang gen Bác gái bệnh nhân có 78 đỉnh tương ứng với kích thước 197bp 215bp không đỉnh trùng với đỉnh bệnh nhân nên bác gái không mang gen bệnh Tương tự marker DXS9897 người mẹ xuất đỉnh tương ứng với kích thước 255bp (khơng trùng với đỉnh bệnh nhân) đỉnh kích thước 251bp (trùng với đỉnh bệnh nhân) chứng tỏ đỉnh 251bp đỉnh alen đột biến (Xb) mà bệnh nhân nhận từ người mẹ Chị bệnh nhân xuất đỉnh có đỉnh khuếch đại tương ứng với kích thước 251bp trùng với đỉnh bệnh nhân nên chị bệnh nhân người lành mang gen Bác gái bệnh nhân có đỉnh khơng có đỉnh trùng với đỉnh bệnh nhân nên bác gái không mang gen bệnh (hình 3.4) Việc phát tình trạng mang gen bệnh giúp cho mẹ chị bệnh nhân có thái độ chủ động phịng tránh nguy chảy máu đặc biệt với chị bệnh nhân kết cần thiết để có kế hoạch dự phịng để đảm bảo sức khỏe nói chung sức khỏe sinh sản nói riêng, sở làm chẩn đoán trước sinh, ngăn ngừa sinh đứa trẻ bị bệnh, nâng cao chất lượng sống Bác gái bệnh nhân có đỉnh khơng trùng với đỉnh bệnh nhân nên bác gái không mang gen bệnh Điều giải thoát cho bác gái khỏi ám ảnh bệnh tật mà đơi gây mặc cảm tự ti lo lắng ảnh hưởng tới sinh hoạt hàng ngày * Với gia đình bệnh nhân HA37: Phân tích phả hệ gia đình bệnh nhân mã số HA37 có hai người trai bị bệnh bệnh nhân mã số HA37 (III2) cậu bệnh nhân (II3) tử vong bệnh Hemophilia A, khẳng định chắn mẹ (II1) bà ngoại bệnh nhân (I1) người lành mang gen bệnh trạng thái dị hợp tử, chị bệnh nhân (III1) người có nguy mang gen bệnh trạng thái dị hợp tử (hình 3.6) Muốn xác định chắn tình trạng mang gen thành viên nữ gia đình bệnh nhân HA37 nghiên cứu sử dụng kỹ thuật Microsatellite-DNA Để biết alelle bệnh mà người mẹ truyền cho trai bị bệnh, trước tiên cần tiến 79 hành kỹ thuật PCR khuếch đại 14 vùng STR đặc hiệu mẫu mẹ Kết thu marker dị hợp tử gia đình mã số HA37 F8int13, FXS7532 Sau để xác định người lành mang gen bệnh gia đình bệnh nhân, nghiên cứu tiến hành phản ứng PCR với marker dị hợp tử tìm F8int13, FXS7532 So sánh kích thước đỉnh điện di sản phẩm PCR cho thấy: vùng trình tự lặp lại F8int13, FXS7532 mẹ chị bệnh nhân xuất đỉnh, đỉnh tương ứng với allele Ở đỉnh có kích thước 211kb, 223kb trùng với đỉnh bệnh nhân đỉnh allele đột biến X b, tức bệnh nhân nhận allele đột biến từ người mẹ, mẹ chị bệnh nhân mang gen F8 đột biến trạng thái dị hợp tử (hình 3.7) * Với gia đình bệnh nhân HA16: Tương tự phân tích phả hệ gia đình bệnh nhân mã số HA16 nghiên cứu phát mẹ (II3) bà ngoại bệnh nhân (I1) người lành mang gen bệnh trạng thái dị hợp tử, thành viên nữ khác gia đình bệnh nhân (II2, II6, III2, III4) người có nguy mang gen bệnh trạng thái dị hợp tử (hình 3.9) Muốn xác định chắn tình trạng mang gen bệnh thành viên nữ gia đình bệnh nhân HA16 trước tiên nghiên cứu sử dụng kỹ thuật MicrosatelliteDNA chọn marker dị hợp tử DXS1073, DXS9901 Sau tiến hành PCR khuếch đại marker dị hợp tử DXS1073, DXS9901 mẫu mẹ, bệnh nhân, thành viên nữ gia đình bệnh nhân HA16 Kết mẹ (II3), chị họ bệnh nhân (III2) bác gái bệnh nhân (II2) mang gen F8 đột biến trạng thái dị hợp tử (hình 3.10) Dì bệnh nhân khơng mang gen bệnh Bên cạnh chồng người dì (II7) khơng có triệu chứng chảy máu kéo dài bệnh Hemophilia A người gái dì (III4 – em gái họ bệnh nhân) không mang gen bệnh Em gái họ bệnh nhân mang thai, nên kết xác định người khơng mang gen bệnh có ý nghĩa vơ to lớn giúp em lo lắng vấn đề bệnh tật, yên tâm làm tròn thiên chức người phụ nữ, người mẹ 80 Tương tự thực kỹ thuật Microsatellite-DNA thành viên gia đình cịn lại nghiên cứu xác định 14/24 thành viên nữ (bao gồm mẹ, bà ngoại, dì ) người lành mang gen 10/24 thành viên nữ (bao gồm dì, chị, em họ, bác gái ) người khơng mang gen Vì phương pháp gián tiếp Microsatellite-DNA phát người lành mang gen bệnh không dựa vào đột biến điểm bệnh nhân, khơng xác định rõ vị trí dạng đột biến gen F8 nên nghiên cứu tiến hành đối chiếu ngẫu nhiên kết người lành mang gen phương pháp gián tiếp Microsatellite-DNA với phương pháp trực tiếp gia đình bệnh nhân là: HA11 HA37 * Gia đình bệnh nhân HA37 Kết giải trình tự 26 exon gen F8 bệnh nhân HA37 cho thấy có đột biến exon 14 vị trí c.5093: thay nuclotid T thành nuclotid C, gây đột biến thay acid amin Isoleucin acid amin Threonin (hình 3.12) Đột biến kiểm tra sở liệu Hamster CDC đột biến gây bệnh Hemophilia A công bố [82] Sau dựa vào đột biến điểm phát bệnh nhân HA37 để phát người lành mang gen bệnh kỹ thuật giải trình tự gen Hình ảnh giải trình tự exon 14 gen F8 người mẹ chị bệnh nhân HA37 xuất đỉnh chồng lên vị trí đột biến phát bệnh nhân HA37 (c.5093T>C), chứng tỏ mẹ chị bệnh nhân mang gen F8 đột biến trạng thái dị hợp tử (hình 3.13) Kết trùng với kết phát người lành mang gen kỹ thuật Microsatellite-DNA * Gia đình bệnh nhân HA11 Bệnh nhân mã số HA11 giải trình tự 26 exon gen F8 Kết so sánh với trình tự Genebank cho thấy có đột biến exon 14 gây chèn thêm nuclotid C vào vị trí c.2777 c.2778, đột biến khơng làm thay đổi loại acid amin vị trí đột biến gây lệch khung dịch mã toàn acid amin tạo thành stop codon sớm (hình 3.14) Đột biến 81 kiểm tra sở liệu Hamster CDC đột biến gây bệnh Hemophilia A Sau dựa vào đột biến điểm phát bệnh nhân HA11 để phát người lành mang gen bệnh kỹ thuật giải trình tự gen Hình ảnh giải trình tự exon 14 gen F8 mẹ chị bệnh nhân HA11 xuất đỉnh chồng lên vị trí đột biến phát bệnh nhân HA11 (c.2777_2778insC; p.Pro927ProfsX7) chứng tỏ mẹ chị bệnh nhân mang gen F8 đột biến trạng thái dị hợp tử Bác gái bệnh nhân không xuất đỉnh chồng lên vị trí đột biến c.2777_2778insC chứng tỏ bác gái bệnh nhân không mang gen bệnh Hemophilia A (hình 3.15) Kết trùng với kết phát người lành mang gen kỹ thuật Microsatellite-DNA Như đối chiếu kết phát người lành mang gen bệnh Hemophilia A phương pháp giải trình tự gen trực tiếp với kết phát người lành mang gen bệnh Hemophilia A kỹ thuật Microsatellite-DNA cho thấy kết phương pháp (bảng 3.3) Điều khẳng định kỹ thuật Microsatellite-DNA thực cho kết tin cậy, phù hợp với phương pháp giải trình tự gen mà Sanger cộng mơ tả trước Tóm lại, nghiên cứu việc áp dụng kỹ thuật MicrosatelliteDNA để xác định người lành mang gen bệnh đối tượng nghiên cứu thu kết (bảng 3.4): + 10/10 người mẹ mang gen bệnh (chiếm 100%) Kết dựa cỡ mẫu nhỏ nên chưa thể kết luận được, xong kết xác định tình trạng mang gen người mẹ quan trọng: người mẹ mang gen bệnh truyền bệnh cho trai truyền gen bệnh cho gái họ [1], [4], bệnh di truyền qua nhiều hệ có nhiều người mắc bệnh gia đình nên phát sớm, tư vấn di truyền làm giảm tỉ lệ mắc bệnh cộng đồng Khơng có trường hợp người mẹ không mang gen bệnh nên đột biến gen F8 người bị bệnh tượng khảm [40] đột biến phát 82 sinh Các thành viên nữ cịn lại gia đình bệnh nhân có nguy mang gen bệnh + 24/37 người lành mang gen bệnh (chiếm 64,9%) kết phù hợp với nghiên cứu Shetty S (2001) 102 gia đình bệnh nhân Hemophilia A Ấn Độ phát 64,5% người lành mang gen bệnh, kết cao nghiên cứu Bùi Thị Thu Hương (2014) 50 gia đình bệnh nhân Hemophilia A thấy tỷ lệ người lành mang gen bệnh 53,6% Có khác biệt kết thu cỡ mẫu nhỏ nên chưa thể kết luận được, đối tượng nghiên cứu có tiền sử bệnh khác nhau, mà thành viên nữ gia đình có tiền sử bệnh bị bệnh rõ ràng có nguy mang gen bệnh cao [47] Kết phát quan trọng với 24 thành viên nữ khơng cịn nghi ngờ mà chắn mang gen, kết giải thích tượng chảy máu bất thường số người phụ nữ mà trước chưa rõ nguyên nhân: rong kinh, đau bụng kỳ kinh, chảy máu kéo dài sau phẫu thuật… Kết giúp cho người phụ nữ có kế hoạch dự phịng để đảm bảo sức khỏe nói chung sức khỏe sinh sản nói riêng nhằm nâng cao chất lượng sống Kết cung cấp sở khoa học cho bác sỹ, chuyên gia để tư vấn tư vấn di truyền, chẩn đoán trước sinh chẩn đoán tiền làm tổ (nếu cịn có nhu cầu sinh đẻ) để ngăn ngừa sinh đứa trẻ bị bệnh Hemophilia A, tăng hiệu tác phòng ngừa bệnh tật, giảm tỉ lệ bệnh cộng đồng + Nghiên cứu khẳng định 13/37 (chiếm 35,1%) người phụ nữ khơng mang gen bệnh Như giải phóng tư tưởng cho 14 người nữ thoát khỏi ám ảnh bệnh tật mà đơi gây mặc cảm tự ti lo lắng sống, để người phụ nữ yên tâm thực thiên chức làm mẹ, làm vợ bao người phụ nữ bình thường 83 Đây nghiên cứu xác định người lành mang gen F8 đột biến thực Việt Nam sử dụng kỹ thuật Microsatellite-DNA Nghiên cứu đóng vai trị quan trọng có nhiều thành viên nữ mang gen bệnh lứa tuổi sinh đẻ, việc phát xác tình trạng mang gen F8 đột biến đối tượng sở khoa học cho công tác tư vấn di truyền, chẩn đoán trước sinh chẩn đoán tiền làm tổ (PGD), giúp ngăn ngừa tiếp tục sinh đứa trẻ bị bệnh Hemophilia A [47], tăng hiệu cơng tác phịng ngừa bệnh tật, hạn chế tối đa tình trạng chảy máu giảm thiểu di chứng bệnh, giảm bớt gánh nặng cho gia đình xã hội, nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe cộng đồng 84 KẾT LUẬN Bằng việc áp dụng kỹ thuật Microsatellite-DNA, xác định 24/37 thành viên nữ mang gen bệnh (chiếm 64,9%) 13/37 thành viên nữ không mang gen bệnh (chiếm 35,1%) 10 gia đình bệnh nhân Hemophilia A TÀI LIỆU THAM KHẢO ... GCTTGAAGTGCTCATGAGGTATC R: AGAAGCTGATGTGCTCCCTG F: GTCTTCCCTGAAGCGTCTCC R: AACAGAGCAAGACTCTGTCTAG F: CACTTAAGGACAGCAAAGCCAG R: CTTCTGTAAGCCTCAGTCTC F: AAAGAAACACCAGGCAAG R: GGATAGGGAGAGATATAG F:... GTGTTGTGTGGCACCATTGT R: ATCTACTGACTTTGATACCTGGGG F: GGCTGACTCCAGAGGC R: CCGAGTTATTACAAAGAAGCAC F: GTGAGTGGAGATAGTCACCTTCA R: AATGTTCCCAAAATGTTATTATTTG F: GTGAATTCATCATATGTGATTTCC R: ACTAGGCGACTAATACAGTGGTGC... ACTAGGCGACTAATACAGTGGTGC F: ATGCCCTCTCCGAGTTATTACA R: ATTGGTGGCCTTTGAAACAC F: AATAAGTTTGTTGTAATTCCATTTGC R: GCCTAGAGAATGCCAAAGTAACACA F: TCTTATTAATGCCCACATTTAGACTC R: AATAAGACCCTTAGCTGTTTCAT - H? ?a chất chạy