ĐỊNH LƯỢNG B.CEREUS ĐẶC ĐIỂM • Họ Bacillusaceae • Trực khuẩn Gram (+) • Hiếu, kỵ khí tùy ý • Di động • Sinh nội bào tử • Lên men Glucose sinh hơi • VP(+) • Nitrat (+) ĐỘC LỰC • Sinh độc tố ruột bền và không bền nhiệt • Độc tố tan máu (haemolysin GÂY BỆNH • Nôn mửa • Tiêu chảy • Viêm dạ dày ruột • Hoại tử sau chấn thương, đặc biệt ở mắt • Các nhiễm trùng cơ hội khác • Ngộ độc thực phẩm: thể nôn (do độc tố chịu nhiệt) và thể tiêu chảy (do thức ăn bị nhiễm khuẩn) • Thời gian ủ bệnh trên 6 giờ, thường từ 10 – 12 giờ DỊCH TỄ • Phân bố rộng rãi trong tự nhiên • Có nhiều trong đất và thực phẩm bị ô nhiễm • Thực phẩm nguy cơ cao: gạo, các loại ngũ cốc, thịt, rau… ĐỊNH LƯỢNG B.CEREUS Nguyên lý phương pháp - Định lượng VSV có khả năng phân giải Lecithin lòng đỏ trứng gà trên MT thạch MYP chọn lọc khi ủ ở 30 o C /24h và có phản ứng VSHH phù hợp trong phép thử khẳng định Phạm vi áp dụng: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi THIẾT BỊ DỤNG CỤ • Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 90 -100 mm • Pipet có chia độ loại 1ml, 5ml, 10 ml đã tiệt khuẩn. • Nồi cách thuỷ điều chỉnh nhiệt độ 45 ±1 o C. • Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 37 ±1 o C. • Tủ sấy khô. • Nồi hấp áp lực . • Bình thuỷ tinh dung tích 250- 500ml. • Ống nghiệm loại 16-160 mm và lớn hơn . • pH met hoặc giấy đo pH. HÓA CHẤT MÔI TRƯỜNG • Nước đệm pepton . • Thạch Mannitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP) hoặc thạch Cereus Selective Agar (MOSSEL). • Nhũ tương lòng đỏ trứng, 50% • Canh thang Phenol Red Glucose. • Môi trường Voges-Proskauer. • Canh thang Nitrate –(Nitrat Broth). • Thạch dinh dưỡng • Thạch máu cừu hoặc thỏ. • Môi trường kiểm tra sự di động. • Thuốc thử nitrate (dung dịch A, dung dịch B). • Thuốc nhuộm Gram CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ MẪU THỬ • Chuẩn bị môi trường - Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng và dung dịch cần thiết được điều chế theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (110 o C/30 phút hoặc 121 o C/15 phút). Môi trường chọn lọc được bổ sung nhũ tương lòng đỏ trứng theo công thức. • Chuẩn bị mẫu - Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất. • Chuẩn bị dung dịch mẫu thử - Cân chính xác 25g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 10ml thực phẩm lỏng) cho vào bình nón có chứa 225 ml đệm pepton, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH • Pha loãng mẫu - Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước pepton, trộn đều để thu được dung dịch mẫu thử 10-2. Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng tiếp theo • Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ cấy 2 đĩa petri và dùng một pipet đã tiệt khuẩn riêng. • Lấy 0,1ml sản phẩm lỏng hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào đĩa thạch chọn lọc • Dùng que cấy thủy tinh vô trùng trải đều mẫu thử. • Lật ngược đĩa và ủ ở 30 ± 1 o C /24 giờ. ĐỌC KẾT QUẢ • Do B.cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng polymycin nên trên môi trường MYP khuẩn lạc B.cereus có màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa (có mặt lecithinase). • Trường hợp sử dụng môi trường MOSSEL, khuẩn lạc B.cereus to, màu hồng, xung quanh có vòng sáng. • Chọn từ mỗi đĩa 5 khuẩn lạc điển hình cấy sang thạch dinh dưỡng ở 30 ± 1 o C /24 giờ. để thử các phản ứng khẳng định THỬ KHẲNG ĐỊNH • Gram (+) • Lên men kỵ khí Glucose • Khử Nitrat – nitrit (+) • VP (+) • Tan máu ß • Di động (+) (Các phản ứng thử ở 35 ± 1 o C /24 giờ) TÍNH KẾT QUẢ: Như đối với S.aureus . ĐỊNH LƯỢNG B. CEREUS ĐẶC ĐIỂM • Họ Bacillusaceae • Trực khuẩn Gram (+) • Hiếu, kỵ khí tùy ý • Di động • Sinh nội b o tử • Lên men Glucose. phẩm nguy cơ cao: gạo, các loại ngũ cốc, thịt, rau… ĐỊNH LƯỢNG B. CEREUS Nguyên lý phương pháp - Định lượng VSV có khả năng phân giải Lecithin lòng đỏ trứng