BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PHẠM HỒNG NGỌC NGHI£N CøU MốI LIÊN QUAN GIữA ĐA HìNH KIểU GEN MTHFR C677T VớI MộT Số BIếN CHứNG BệNH NHÂN ĐáI THáO §¦êNG TYPE ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PHM HNG NGC NGHIÊN CứU MốI LIÊN QUAN GIữA ĐA H×NH KIĨU GEN MTHFR C677T VíI MéT Sè BIÕN CHøNG BệNH NHÂN ĐáI THáO ĐƯờNG TYPE Chuyờn ngnh: Sinh lý học Mã số: 60720106 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1.TS Nguyễn Huy Bình 2.TS Nguyễn Thi Thanh Hương HÀ NỘI - 2016 CÁC TỪ VIẾT TẮT ĐTĐ Đái tháo đường HTKTW Hệ thần kinh trung ương Hcy Homocystein TK Thần kinh MTHFR Methyl tetrahydrofolate reductase TBMMN Tai biến mạch máu não TALTT Tăng áp lực thẩm thấu HCTH Hội chứng thận hư DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Vị trí kiểu đột biến gen MTHFR .13 Bảng 1.2: Bảng tần số đột biến gen MTHFR giới 13 Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR 28 Bảng 2.2: Trình tự chuỗi DNA mồi .28 Bảng 2.3: Phân độ tăng huyết áp 32 Bảng 2.4: Tiêu chuẩn kiểm soát glucose HbA1c theo IDF 2005 33 Bảng 3.1 Phân bố tuổi đối tượng nghiên cứu 34 Bảng 3.2 Phân bố giới đối tượng nghiên cứu 34 Bảng 3.3: Chỉ số vòng bụng, vòng mơng, chiều cao, cân nặng .34 Bảng 3.4: Chỉ số khối thể BMI 35 Bảng 3.5 Các yếu tố nguy ĐTĐ .35 Bảng 3.6 Thời gian mắc ĐTĐ .36 Bảng 3.7 Xét nghiệm hóa sinh 36 Bảng 3.8 Xét nghiệm kiểm soát đường máu 37 Bảng 3.9 Tình trạng rối loạn lipid máu bệnh nhân nghiên cứu .37 Bảng 3.10 Xét nghiệm tổng phân tích nước tiểu 37 Bảng 3.10 Bảng kết quản siêu âm tim 38 Bảng 3.11 Bảng kết quản siêu âm Doppler động mạch cảnhError! Bookmark not defined Bảng 3.11 Kết tách chiết ADN .38 Bảng 3.12 Kết xác định kiểu gen phương pháp ARMS-PCR .38 Bảng 3.13 Kết phân tích kiểu gen MTHFR bệnh nhân ĐTĐ 38 Bảng 3.14 Mối liên quan đột biến gen MTHFR với số nhân trắc học 38 Bảng 3.15 Mối liên quan đột biến gen MTHFR với HA động mạch 38 Bảng 3.16 Mối liên quan đột biến gen MTHFR với RLMM .39 Bảng 3.17 Mối liên quan đột biến gen MTHFR với xơ vữa động mạch chủ 39 Bảng 3.18 Mối liên quan đột biến gen MTHFR với biến chứng thận 40 Bảng 3.19 Mối liên quan đột biến gen MTHFR với kiểm soát đường máu 40 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Vị trí gen MTHFR 10 Hình 1.2: Vai trò MTHFR chu trình chuyển hóa acid folic 12 Hình 1.3: Cơ chế hình thành huyết khối ảnh hưởng đột biến gen MTHFR 15 Hình 1.4: Minh họa chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 18 Hình 1.5: Kết chụp huỳnh quang sau ARMS - PCR .20 Hình 1.6: Kết giải trình tự gen 22 Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 25 Hình 2.2: Đột biến MTHFR C677T 29 Hình 2.3: Kết giải trình tự gen 30 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đái tháo đường type 1.1.1 Định nghĩa .3 1.1.2 Sinh lý bệnh đái tháo đường type 1.1.3 Triệu chứng lâm sàng 1.1.4 Triệu chứng cận lâm sàng 1.1.5 Chẩn đoán xác định ĐTĐ 1.1.6 Biến chứng .5 1.1.7 Điều trị .8 1.2 Gen MTHFR .9 1.2.1 Tổng quan gen MTHFR 1.2.2 Vai trò gen MTHFR 10 1.2.3 Đột biến gen MTHFR .12 1.2.4 Mối liên quan đột biến gen MTHFR với số lâm sàng cận lâm sàng bệnh nhân ĐTĐ type .14 1.3 Các phương pháp phân tích đột biến gen MTHFR 16 1.3.1 Kỹ thuật PCR 17 1.3.2 Kỹ thuật RFLP-PCR 19 1.3.3 Kỹ thuật ARMS – PCR 19 1.3.4 Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp 21 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu .23 2.1.1 Lựa chọn đối tượng nghiên cứu 23 2.1.2 Quy trình lấy máu .24 2.1.3 Đánh giá biến chứng đái tháo đường 24 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 25 2.2.1 Thời gian nghiên cứu 25 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 25 2.3 Thiết kế nghiên cứu 25 2.4 Phương tiện nghiên cứu 25 2.4.1 Trang thiết bị 26 2.4.2 Hóa chất sinh phẩm .26 2.5 Các bước tiến hành 27 2.5.1 Tách DNA 27 2.5.2 Xác định kiểu gen phương pháp ARMS - PCR 27 2.5.3 Phương pháp giải trình tự gen 29 2.6 Tiêu chuẩn nghiên cứu đánh giá .30 2.6.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ 30 2.6.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán rối loạn lipid máu 31 2.6.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán THA 32 2.6.4 Tiêu chuẩn chẩn đoán biến chứng thận 32 2.6.5 Tiêu chuẩn chẩn đốn béo phì 32 2.6.6 Tiêu chuẩn kiểm soát đường máu .33 2.7 Đạo đức nghiên cứu 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34 3.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 34 3.2 Kết xét nghiệm lâm sàng 36 3.3 Kết xét nghiệm Gen 38 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 41 KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Đái tháo đường (ĐTĐ) bệnh lý phức tạp nhiều yếu tố nhiều gen gây nên Theo thơng báo Liên đồn ĐTĐ quốc tế IDF (International Diabetes Federation) có khoảng 415 triệu người mắc ĐTĐ type số tăng lên tới 642 triệu người vào năm 2020, khơng có hành động can thiệp kịp thời IDF ước tính 183 triệu người họ mắc ĐTĐ [1] Tại Việt Nam theo điều tra số thành phố lớn thấy tỷ lệ mắc ĐTĐ cao gia tăng nhanh chóng Năm 1990 điều tra Hà Nội, Huế, Thành phố Hồ Chí Minh tỷ lệ mắc ĐTĐ type tương ứng 1.2%, 0,96% 2.52% [2] Theo thống kê năm 2008, tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ nước 5% (khoảng 4,5 triệu người), thành phố lớn khu cơng nghiệp có tỷ lệ từ 7,0 đến 10% [3] Như sau 10 năm tỷ lệ ĐTĐ gia tăng 300% Tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ gia tăng nhanh chóng tồn giới kéo theo hậu nghiêm trọng sức khỏe kinh tế toàn xã hội ĐTĐ nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ giới, gây giảm tuổi thọ trung bình từ đến 10 năm, nguyên nhân hàng đầu gây mù loà suy thận giai đoạn cuối Có nhiều nguyên nhân làm gia tăng biến chứng ĐTĐ là: chế độ ăn uống khơng hợp lý, vận động, khơng tuân thủ chế độ chăm sóc điều trị dung thuốc khơng Ngồi yếu tố khác góp phần làm gia tăng biến chứng đột biến gen, có gen MTHFR C677T Gen MTHFR C677T đột biến làm tăng nồng độ homocystein (Hcy) máu làm giảm hoạt tính enzyme methyltetrahydrofolat (MTHF), giảm chuyển hóa Hcy thành methionine Do ức chế phát triển nội mạc, giảm đáp ứng vận mạch, giảm tác dụng heparin làm gia tăng biến chứng ĐTĐ đặc biệt biến chứng tim mạch Những người mang đột biến gen MTHFR 677TT dạng đồng hợp tử enzyme hoạt động 70% so với bình thường dạng dị hợp tử 30 – 40% [7], [8] Trên giới có nhiều nghiên cứu mối liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677T với biến chứng tim mạch, thận, thần kinh… Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu đề cập đến vấn đề trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu mối liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677T với số biến chứng tim mạch bệnh nhân đái tháo đường type 2” với hai mục tiêu: Xác định tỷ lệ đa hình kiểu gen MTHFR C677T bệnh nhân ĐTĐ type Xác định số liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677T với số biến chứng bệnh nhân ĐTĐ type HDL-C Nhận xét Bảng 3.8 Xét nghiệm kiểm sốt đường máu Thơng số Tốt n % Chấp nhận n % Kém n % Glucose máu HbA1c Nhận xét: Bảng 3.9 Tình trạng rối loạn lipid máu bệnh nhân nghiên cứu Thông số Tăng cholesterol Tăng TG Giảm HDL-C Tăng LDL-C Bệnh nhân Tỷ lệ (%) Nhận xét: Bảng 3.10 Xét nghiệm tổng phân tích nước tiểu Chỉ số Protein niệu Albumin niệu Microalbumin niệu Bệnh nhân Tỷ lệ (%) Nhận xét: Bảng 3.10 Bảng kết quản siêu âm tim Kết xét nghiệm Gen Bảng 3.11 Kết tách chiết ADN Mã số Nồng độ DNA (ng/µl) A260/A280 Nhận xét: Bảng 3.12 Kết xác định kiểu gen phương pháp ARMS-PCR Bảng 3.13 Kết phân tích kiểu gen MTHFR bệnh nhân ĐTĐ Mã số Kiểu gen CC CT TT Nhận xét: Bảng 3.14 Mối liên quan đột biến gen MTHFR với số nhân trắc học Cholesterol Kiểu gen Nhóm đột biến Nhóm khơng đột biến p Giới Tuổi BMI Vòng bụng Nhận xét: Bảng 3.15 Mối liên quan đột biến gen MTHFR với HA động mạch Cholesterol Kiểu gen Nhóm đột biến Nhóm khơng đột biến p HA tâm thu HA tâm trương Nhận xét: Bảng 3.16 Mối liên quan đột biến gen MTHFR với RLMM Cholesterol Kiểu gen Nhóm đột biến Nhóm không p đột biến CC CT TT p Nhận xét: Bảng 3.17 Mối liên quan đột biến gen MTHFR với xơ vữa động mạch chủ Có xơ vữa Kiểu gen Nhóm đột biến Nhóm khơng đột biến p CC CT TT p Nhận xét: Bảng 3.18 Mối liên quan đột biến gen MTHFR với biến chứng thận Có biến chứng Kiểu gen CC CT TT p Nhóm đột biến Nhóm khơng đột biến p Nhận xét: Bảng 3.19 Mối liên quan đột biến gen MTHFR với kiểm sốt đường máu Kiểm sốt khơng tốt Kiểu gen CC CT TT p Nhận xét: Nhóm đột biến Nhóm khơng đột biến p CHƯƠNG BÀN LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO Nam Han Choet et al (2015) Diabetes around the world International Deabetes Fedẻation, IDF Diabetes Atlas Seventh Edition 2015, International Deabetes Fedẻation, 14 - 19 Tạ Văn Bình (2006) Dịch tễ học bệnh ĐTĐ Việt nam phương pháp điều trị biện pháp dự phòng, Nhà xuất Y học, Hà Nội Tạ Văn Bình (2008) Bệnh đái tháo đường - Tăng glucose máu nguyên lý tảng, Nhà xuất Y học, Hà Nội Ozmen Bet et al (2002) Association between homocystein and renal function in patients with type II diabetes mellitus Ann Clin Lab Sci, 3(32), 279 - 286 Angeline Tet et al (2005) Homocystein status and acute myocardial infartion among Tamilians Ind J Clin Biochem, 1(20), 18 - 20 George N Welch, Joseph Loscalzo (1998) Homocystein and athrothrombosis The New England Journal of Medicine, 338(15), 1042 - 1050 Sharp L, Little J (2004) Polymorphisms in genes involved in folate metabolism and colorectal neoplasia: a huge review Am J Epidemiol(159), 423 - 443 Refsum Het et al (2004) Facts and recommendations about total Homocystein determination: An expert Opinion Clin Chem.(50), - 32 Ngô Quý Châu, Nguyễn Lân Việt, Nguyễn Đạt Anh et al (2012) Bệnh học nội khoa 10 Gauhan D.J.et et al (2000) The human and mouse methylenetetrahydrofolat reductase genes: genomic organization, mRNA structure and likage to the CLCN6 gene Gene(257), 279 - 289 11 Rodgers GM, Conn MT (1990) Homocystein, an athrogenic stimulus reduces protein C activation by arterial and venous endothelial cells Blood(75), 895 - 901 12 Rodgers GM, Kane WH (1986) Activation of endogenous factor V by a homocystein induced vascular endothelial cell activator J Clin Invest(77), 1909 - 1916 13 Harker LAet et al (1974) Homocystein: vascular injury and arterial throbosis N Engl J Med(291), 537 - 543 14 Harker LAet et al (1976) Homocystein induced arteriosclerosis: the role of endotheliak cell injury and platelet response in its genesis J Clin Invest(58), 731 - 741 15 Ratnoff OD (1968) Activation of hageman factor by L - Homocystein Science(162), 1007 - 1009 16 Lentz SR, Sadler JE (1991) Inhibition of thrombomodulin surface expression and protein C activation by the thrombogenic agent homocystein J Clin Invest(88), 1906 - 1914 17 Fryer RHet et al (1993) Homocystein a risk factor for premature vascular disease and thrombisis induces tissue factor activity in endothelial cell Arterioscler Thromb Basic Biol(13), 1327 - 1333 18 Kumar A, Kumar P, Prasad M et all (2015) Association of C677T polymorphism in the methylenetetrahydrofolate reductase gene (MTHFR gene) with ischemic stroke: a meta-analysis Neurol Res(7), 568 - 577 19 Bhargava S, Ali A, Parakh R et all (2012) Higher incidence of C677T polymorphism of the MTHFR gene in North Indian patients with vascular disease Vascular, 20(2), 88 - 95 20 Yadav U, Kumar P, Yadav SK et all (2015) Polymorphisms in folate metabolism genes as maternal risk factor for neural tube defects: an updated meta-analysis Metab Brain Dis, 30(1), - 24 21 Linnebank M, Homberger A, Nowak-Goettl U et al (2000) Linkage disequilibrium of the common mutation 677C→T and 1298A→C of the human methylenetetrahydrofolate reductase gene as proven by the novel polymorphisms 129C→T, 1068C→T Eur J Ped, 159, 472 - 473 22 Rosenberg N, Murata M, Ikeda Y et al (2002) The frequent 5,10methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism is associated with a common haplotype in Whites, Japanese, and Africans Am J Hum Genet, 70, 758 - 762 23 Frosst P, Blom H.J, Milos R et al (1995) A candidate genetic risk factor for vasc ular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase Nat Genet., 10, 111 - 113 24 Goyette P, Frosst P, Rosenblatt DS et al (1995) Seven novel mutations in the methylenetetrahydrofolate reductase gene and genotype/phenotype correlations in severe MTHFR deficiency Am J Hum Genet, 56, 1052 - 1059 25 Goyette P, Christensen B, Rosenblatt DS et al (1996) Severe and mild mutations in cis for the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene, and description of novel mutations in MTHFR Am J Hum Genet, 59, 1268 - 1275 26 Viel A, Dall'Agnese L, Simone F et al (1997) Loss of heterozygosity at the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase locus in human ovarian carcinomas Br J Cancer, 75, 1105 - 1110 27 Weisberg I, Tran P, Christensen B et al (1998) A second genetic polymorphism in methylenetrahydrofolate reductase (MTHFR) associated with decreased enzyme activity Mol Genet Metabol, 64, 169 - 172 28 Rady PL, Szucs S, Grady J et al (2002) Genetic polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and methionine synthase reductase (MTRR) in ethnic populations in Texas: A report of a novel MTHFR polymorphic site, G1793A Am J Med Genet, 107, 162 - 168 29 Botto LD, Yang Q (2000) 5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase gene variants and congenital anomalies: a HuGE review Am J Epidemiol (151), 862 - 877 30 Wilcken B, Bamforth F, Li Z et al (2003) Geographical and ethnix variation of the 677T>C allene of 5, 10 meththylenetetrahydrofolat reductase (MTHFR): findings from over 7000 newborns from 16 areas worldwide J Med Genet, 40, 619 - 625 31 Schneider J A, Rees D C, Liu Y T et al (1998) Worldwide distribution of a common MTHFR mutation Am J Hum Genet, 62, 1258 - 1260 32 Sadewa A H, Sunarti, Sutomo R et al (2002) The C677T mutation in he MTHFR gene among the indonesia Javanese populoation Kobe J Med Sci., 8, 137 - 144 33 Hegete R A, Tully C., Young T K et al (1997) 677T mutation of MTHFR and cardiovascular disease in Canada Inuit Lancet, 349, 1221 1222 34 Laura Di Renzo, Luigi Tonino Marsella, Francesca Sarlo et all (2014) C677T gên polymorphism ò MTHFR and metabolic syndrome: response to dietary intervention Journal ò translational medecine, 12, 329 - 348 35 Boyi Yang, Shujun Fan, Xueyan Zhi et all (2014) Associations ò MTHFR C677T and MTRR A66G gen polymorphisms with metabolic sydrome: A case control study in Northern China Int J Mol Sci, 15, 21687 - 21702 36 Nevin llhan, Mehmet Kucuksu, Dilara Kaman et all (2008) The 677 C/T MTHFR Polymorphism is Associated with Essential Hypertension, Coronary Artery Disease, and Higher Homocysteine Levels Archives of Medical Research, 39(1), 125 - 130 37 R F Franco, A G Araújo, J F Guerreiro et all (2013) Analysis of the 677 C→T Mutation of the Methylenetetrahydrofolate Reductase Gene in Different Ethnic Group Thrombosis and Haemostasis, 79(1), 119 - 121 38 Santosh Kumar Gupta, Jyoti Kotwal, Atul Kotwal (2010) Role ò homocystein and MTHFR C677T gene polymorphism as risk factors for coronary artery disease in young Indians Indian J Med Res, 135, 506 - 512 39 Frosst P, Blom HJ, Milos R et al (1995) A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase Nat Genet., 10(1), 111 - 113 40 Makiko Maeda, Isamu Yamamoto, Masakatsu Fukuda et al (2003) MTHFR Gene Polymorphism as a Risk Factor for Diabetic Retinopathy in Type Diabetic Patients Without Serum Creatinine Elevation Diabetes Care, 26(2), 547 - 548 41 Vlad Shpichinetsky, Itamar Raz, Yechiel Friedlander et al (2000) The Association between Two Common Mutations C677T and A1298C in Human Methylenetetrahydrofolate Reductase Gene and the Risk for Diabetic Nephropathy in Type II Diabetic Patients J Nutr., 130, 2493 2497 42 Tạ Thành Văn ((2010)) PCR số kỹ thuật sinh học phân tử, Nhà xuất y học, 28-119 PHỤ LỤC I MẪU BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU Mã bệnh án……………………Mã số bệnh nhân……………………… Có Khơng Đã ký giấy đồng ý tham gia Họ tên người tham gia nghiên cứu (Nếu không, kết thúc) Địa Điện thoại liên lạc └─┴─┴─└─┴─└─┴─└─┴─┴─┴─┘ C THÔNG TIN VỀ BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU C1 Giới Nam Nữ C2 Ngày tháng năm sinh Ngày/tháng/năm  //  C3 Dân tộc Kinh Khác D THÔNG TIN VỀ TIỀN SỬ, TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG VÀ BỆNH ĐTĐ D1 D2 D3 D4.1 Tiền sử gia đình có người Có mắc đái tháo đường Không Tiền sử sinh ≥ 4kg (với nữ) Có Khơng Tiền sử chẩn đoán đái tháo đường thai nghén (với nữ) Tiền sử hút thuốc Có Khơng Có Không  //  D4.2 Thời điểm chẩn đốn D5 Tiền sử có rối loạn Lipid máu Có Khơng Tiền sử mắc bệnh tăng huyết áp Có Khơng D6 D7 Tiền sử mắc bệnh lý khác Có Khơng  Cơn đau thắt ngực  Suy tim  Thối hóa khớp gối  Lỗng xương  Loãng xương  Suy thận  Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính  Bệnh tuyến giáp D8 (ghi rõ ) Dùng thuốc: Thuốc đái tháo đường  Thuốc viên  Thuốc tiêm, liều D9 Cân nặng (kg) , D11 Vòng mơng (cm) D13 Chiều cao (cm) D15 Đo vòng cổ chân P D17 D19 lý  Khác ………………  Thuốc tiêm + viên D10 Vòng eo (cm) , , D12 BMI , D14 Huyết áp (mmHg), , D16 Đo vòng cổ chân T , Lần 1: Lực bóp tay T , D18 Lần 2: Lực bóp tay T , Lần 1: Lực bóp tay P , Lần 2: Lực bóp tay P , Thời gian 4m nhanh theo D20 vạch kẻ sẵn an toàn (giây) , Số lần đứng lên ngồi xuống phút ( lần ) , , nghỉ E CÁC THĂM DÒ CẬN LÂM SÀNG E1 Glucose , E2 HbA1c (%)  ,   E3 Triglycerid (mmol/l) , E4 CholesterolTP (mmol/l)  ,   E5 LDL – chol (mmol/l) , E6 HDL – chol (mmol/l)  ,   E7 ALT (UI/l) , E8 AST (UI/l)  ,   E9 Creatinin (µmol/l) , E10 Ure (mmol/l)  ,   E11 CRP , E12 BC niệu  ,   E13 Microabumin niệu , E14 Protein niệu (g/l)  ,   E15 Hồng cầu (T/l) , E16 BC (G/l) Hb(g/l) , NEUT (%)  ,    ,   E17 Tiểu cầu(G/l) , E18  ,   E19 Điện tâm đồ E20 Siêu âm tim E21 Chụp XQ tim phổi E22 Siêu âm bụng E23 Siêu âm tuyến giáp E24 L Arm E26 , E25 R Arm , L Leg , E27 R Leg , E28 BMD , E29 % Fat , E30 T Score , E31 Z Score , PHỤ LỤC II Quy trình tách DNA DNA tách từ tế bào bạch cầu sử dụng Kit OMEGA: Lấy 300ul máu, sau bổ sung thêm 900ul Cell Lysis Solution => Mix Ủ 10 phút nhiệt độ phòng Ly tâm 14500 rcf 30 giây Loại bỏ dịch Bổ sung 300ul Nuclei Lysis Solution => Mix Bổ sung 100ul Protein Precipitation Solution Vortex 20 giây Ly tâm 16000 rcf phút Chuyển sịch sang ống eppendorf có chứa 300ul Isopropanol => Mix Ly tâm 16000 rcf 10 phút 10.Loại bỏ dịch Bổ sung 300ul ethanol 70% 11.Ly tâm 16000 rcf phút => Loại bỏ dịch 12.Làm khô mẫu 15 phút máy hút chân không 13.Bổ sung 100ul nước 3D/ DNA Rehydration Solution Ủ 65°C 4°C qua đêm ... mối liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677T với số biến chứng tim mạch bệnh nhân đái tháo đường type 2 với hai mục tiêu: Xác định tỷ lệ đa hình kiểu gen MTHFR C677T bệnh nhân ĐTĐ type Xác định số. .. .24 2. 1.3 Đánh giá biến chứng đái tháo đường 24 2. 2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 25 2. 2.1 Thời gian nghiên cứu 25 2. 2 .2 Địa điểm nghiên cứu 25 2. 3 Thiết kế nghiên. .. Xác định số liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677T với số biến chứng bệnh nhân ĐTĐ type 3 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đái tháo đường type 1.1.1 Định nghĩa Theo TCYTTG 20 02: Đái tháo đường (ĐTĐ)