BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PHAN THỊ THU GIANG øng dụng kỹ thuật Bobs chẩn đoán trớc sinh số hội chứng bất thờng nhiễm sắc thể số hội chứng vi đoạn LUN VN TT NGHIP BÁC SĨ NỘI TRÚ HÀ NỘI – 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PHAN THỊ THU GIANG øng dông kü thuật Bobs chẩn đoán trớc sinh số hội chứng bất thờng nhiễm sắc thể số hội chứng vi đoạn Chuyờn ngnh : Y sinh hc di truyền Mã số : 62720301 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ NỘI TRÚ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Hoàng Thị Ngọc Lan HÀ NỘI - 2016 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BoBs : Bacterial artificial chromosome – on – beads DTBS : Dị tật bẩm sinh DNA : Acid Deoxyribonucleic NST : Nhiễm sắc thể uE3 : βhCG : Beta – Human chronic gonadotropin AFP : Alpha fetoprotein PAPP – A : Pregnancy – associated plasma protein A RAT : Rapid aneuploidy testing PCR : Polymerase chain reaction CGH : Microarray – based comparative genomic hybridization FISH : Fluorescent in stitu hybridization MLPA : Multiplex ligation-dependent probe amplification QF – PCR : Quantitative fluorescent - polymerase chain reaction DGS : DiGeorge Syndrome AS : Angelman Syndrome LGS : Langer – Giedion Syndrome MDS : Miller – Dieker Syndrome PWS : Prader – Willi Syndrome SMS : Smith – Magenis Syndrome WBS : William – Beuren Syndrome WHS : Wolf – Hirschhorn Syndrome Unconjugate Estriol MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN .3 1.1 Một số hội chứng vi đoạn phát kỹ thuật BoBs 1.2 Tầm quan trọng chẩn đoán trước sinh 18 1.3 Đối tượng cần làm chẩn đoán trước sinh 19 1.4 Xét nghiệm trước sinh không xâm lấn .21 1.5 Các phương pháp chẩn đoán trước sinh .24 1.5.1 Chọc hút dịch ối 24 1.5.2 Sinh thiết tua rau 25 1.5.3 Chọc hút máu cuống rốn .25 1.5.4 Sinh thiết mô thai nội soi phôi thai 25 1.6 Những kỹ thuật di truyền áp dụng chẩn đoán trước sinh .26 1.6.1 Phương pháp di truyền học tế bào .26 1.6.2 Chẩn đoán trước sinh phương pháp di truyền tế bào – phân tử, kỹ thuật lai chỗ huỳnh quang 26 1.6.3 Các kỹ thuật di truyền phân tử 27 1.7 Kỹ thuật Bacs-on-Beads .29 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 Đối tượng nghiên cứu 37 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 37 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 38 2.2 Địa điểm nghiên cứu địa điểm phân tích mẫu .38 2.3 Thời gian nghiên cứu 38 2.4 Phương tiện nghiên cứu 38 2.4.1 Dụng cụ .38 2.4.2 Hóa chất 39 2.5 Phương pháp nghiên cứu 39 2.5.1 Thiết kế nghiên cứu .39 2.5.2 Cỡ mẫu nghiên cứu .39 2.6 Kỹ thuật sử dụng 39 2.6.1 Chuẩn bị mẫu DNA .41 2.6.2 Tách chiết DNA 41 2.6.3 Phương pháp định lượng DNA 41 2.6.4 Các bước quy trình thực kỹ thuật BoBs 42 2.7 Phân tích kết 46 2.8 Xử lý phân tích số liệu 48 2.9 Đạo đức nghiên cứu 48 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 49 3.1 Một số đặc điểm sinh học nhóm đối tượng nghiên cứu .49 3.1.1 Tuổi thai phụ .49 3.1.2 Tuổi thai thời điểm chọc hút nước ối .50 3.1.3 Kết siêu âm thai nhóm nghiên cứu 51 3.1.4 Kết sàng lọc huyết mẹ nhóm nghiên cứu 52 3.2 Kết kỹ thuật Bobs 53 3.3 Đánh giá giá trị kỹ thuật BoBs 54 3.3.1 Sự tương đồng kỹ thuật BoBs kỹ thuật di truyền tế bào 54 3.3.2 So sánh kỹ thuật BoBs với kết di truyền tế bào 54 3.3.3 Đối chiếu kết siêu âm thai với trường hợp có kết BOBs bất thường 56 Chương 4: BÀN LUẬN .69 4.1 Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu 69 4.1.1 Tuổi thai phụ .69 4.1.2 Tuổi thai thời điểm chọc hút nước ối .71 4.1.3 Đối chiếu kết siêu âm thai với kết BoBs .72 4.1.4 Đối chiếu kết sàng lọc huyết mẹ với kết BoBs 74 4.2 Đánh giá giá trị kỹ thuật BoBs 76 4.2.1 Sự tương đồng kỹ thuật BoBs kỹ thuật di truyền tế bào 76 4.2.2 So sánh kỹ thuật BoBs với kết di truyền tế bào 77 KẾT LUẬN 86 KIẾN NGHỊ 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Giá trị xét nghiệm NIPT thực kỹ thuật T-MPS 22 Bảng 1.2: So sánh đặc điểm chẩn đoán trước sinh làm phương pháp khác 33 Bảng 2.1 Bảng tính nồng độ DNA cần cho phản ứng Bobs 43 Bảng 2.2 Bảng tính thể tích dung dịch Labeling Mix 44 Bảng 2.3 Bảng tính thể tích dung dịch Hybridization Bead Mix 45 Bảng 2.4 Bảng tính thể tích dung dịch Reporter Mix 46 Bảng 2.5 Các loại đột biến tương ứng với tỷ lệ tín hiệu huỳnh quang 47 Bảng 3.1 Tuổi trung bình thai phụ 49 Bảng 3.2 Tuổi thai thời điểm chọc hút nước ối .50 Bảng 3.3 Đối chiếu kết BoBs với hình ảnh siêu âm thai 51 Bảng 3.4 Đối chiếu kết sàng lọc huyết mẹ với kết BoBs .52 Bảng 3.5 Kết chẩn đoán kỹ thuật BoBs .53 Bảng 3.6 So sánh kỹ thuật BoBs với kết di truyền tế bào .54 Bảng 3.7 Đối chiếu kết siêu âm thai với trường hợp có kết BOBs bất thường 56 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Phân bố thai phụ theo tuổi 49 Biểu đồ 3.2 Sự tương đồng kết di truyền tế bào kỹ thuật BoBs 54 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Đột biến vi đoạn .3 Hình 1.2 Đối với thai phụ trẻ tuổi, khả mang thai mắc hội chứng vi đoạn cao khả mắc hội chứng Down [7] Hình 1.3 Vị trí đoạn NST 22 Hình 1.4: Một số kỹ thuật sử dụng chẩn đoán hội chứng vi đoạn Hình 1.5: Vị trí đoạn NST 13 Hình 1.6 Vùng gen đặc hiệu tương ứng với DNA dị gắn hạt Bead lai 30 Hình 1.7: Nguyên lý kỹ thuật BoBs 31 Hình 1.8: Phân tích kết hệ thống máy Luminex 100/200 32 Hình 2.1 Màn hình hiển thị kết 46, XX 47 Hình 2.2 Kết BoBs với đột biến vi đoạn 47 Hình 3.1: Kết BoBs thai số mắc hội chứng DiGeorge 57 Hình 3.2: Kết di truyền tế bào thai số bình thường .58 Hình 3.3: Kết BoBs thai số mắc chứng Cri du chat 59 Hình 3.4: Kết di truyền tế bào thai số bình thường .60 Hình 3.5: Kết BoBs thai số mắc hôi chứng Down 61 Hình 3.6: Kết di truyền tế bào thai số mắc chứng Down 62 Hình 3.7: Kết BoBs thai số 17 mắc hôi chứng Patau .63 Hình 3.8: Kết di truyền tế bào thai mắc sô 17 hôi chứng Patau chuyển đoạn hòa hợp tâm 64 Hình 3.9: Kết BoBs thai số mắc hôi chứng Edwards 65 Hình 3.10: Kết di truyền tế bào thai số mắc chứng Edwards 66 Hình 3.11: Kết BoBs thai số 16 mắc trisomy phần NST 18 67 Hình 3.12: Kết di truyền tế bào thai số 16 có thêm phần NST số 11 68 Locus gen sử dụng kit 102 ĐẶT VẤN ĐỀ Dị tật bẩm sinh (DTBS) nguyên nhân hàng đầu gây chết chu sinh gây nhiều gánh nặng cho gia đình xã hội Vì vậy, chẩn đốn phát sớm bệnh lý di truyền thời kỳ phơi thai vơ thiết yếu để có biện pháp phịng xử trí kịp thời [1] Việc xác định nguyên nhân di truyền nhiều trường hợp bệnh lý cần thiết để tư vấn di truyền can thiệp, hội chứng vi đoạn với số hội chứng có tỷ lệ gặp phổ biến (DiGeorge 1/4000), thường không liên quan đến tuổi mẹ, triệu chứng gặp đa dạng gây cản trở việc chẩn đoán, gây hội chứng nghiêm trọng chậm phát triển tâm thần Để đáp ứng nhu cầu này, kỹ thuật di truyền không ngừng phát triển Các xét nghiệm di truyền mức độ tế bào (NST), mức độ phân tử, mức độ tế bào phân tử (Fluorescent in stitu hybridization - FISH)[2] Hiện nay, trung tâm di truyền, phương pháp di truyền tế bào QF-PCR (Quantitative fluororescen) hai kỹ thuật sử dụng thường xuyên Karyotype tiêu chuẩn vàng sử dụng để chẩn đoán bất thường NST với khả đánh giá tồn NST tính xác cao Tuy nhiên, không xác định đoạn ngắn trường hợp vi đoạn, nhược điểm mặt thời gian nên kỹ thuật di truyền tế bào hỗ trợ kỹ thuật chẩn đoán nhanh như: QF-PCR, MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification), để chẩn đoán bất thường nhiễm sắc thể (NST) phổ biến 13,18, 21, X, Y CGH để khảo sát toàn gen Các kỹ thuật có nhiều ưu việt khả phát đột biến, hạn chế thời gian khó áp dụng cộng đồng tính phức tạp kỹ thuật giá thành cao[3], [4] 80 nhuộm băng G không phát đột biến Đây trường hợp điển hình mang đột biến đoạn ngồi phạm vi phát phương pháp di truyền tế bào Trong hai trường hợp thai mắc hội chứng Cri du chat, trường hợp có kết siêu âm thai theo dõi dị tật hở ống thần kinh có kết sàng lọc Triple test nguy cao thai mắc hội chứng Down, trường hợp cịn lại hình ảnh siêu âm có dị tật tim nặng hẹp đường thất trái, hẹp van động mạch phổi phải Mặc dù kết sàng lọc trước sinh theo dõi thai có nhiều dị tật kết hợp với kết karyotype bình thường khó khăn cho bác sỹ việc đưa tư vấn cho gia đình Khi chẩn đoán xác định thai mắc hội chứng Cri du chat, ngồi đặc điểm đặc trưng tiếng khóc âm vực cao tiếng mào kêu, trẻ cịn có bất thường hình thái đầu cằm nhỏ, mặt tròn, mắt cách xa nhau, sống mũi thấp, mí mắt có nếp hình rẽ quạt, vấn đề tăng trưởng nhẹ cân sinh, thường tăng trưởng chậm khó cho ăn gặp vấn đề với việc nuốt bú trào ngược thực quản Hơn nữa, hầu hết trẻ chậm phát triển trí tuệ, khó khăn diễn đạt ngơn ngữ, chậm phát triển kỹ vận động Ngoài ra, trẻ khó có khả tập trung (tỷ lệ gần 100%), hiếu động thái (khoảng 25%) [118] [119] Bên cạnh đó, trẻ có bất thường hành vi, tự làm hại thân (đập đầu vào tường, tự đánh, cắn cào cấu) Với chẩn đoán xác định này, bác sỹ đưa tư vấn di truyền cho sản phụ gia đình cách rõ ràng Khi phát bất thường NST mà biết liên quan đến bệnh, hội chứng cự thể có giá trị có tính nhân văn đột biến mà dự báo hậu cho thai phụ gia đình Sự khơng rõ ràng tình trạng dẫn tới khó khăn định giữ hay bỏ thai người mẹ, đơi để lại ám ảnh tâm lý nặng nề lần mang thai bà mẹ 81 Tiếp theo, phân tích mẫu ối cịn lại có khác kết luận hai phương pháp Xét trường hợp thai phụ 26 tuổi, thai 17 tuần chọc ối siêu âm thai có bất thường hệ tim mạch: thơng liên thất, động mạch chủ chờm lên vách liên thất, siêu âm thai lúc 12 tuần có KSSG 2,7mm, thai có nguy cao mắc hội chứng Down 1/71 Khi nuôi cấy ối làm xét nghiệm di truyền tế bào chúng tơi có kết thai có thêm phần NST số 11, karyotyp 46,XY,add(11) Ban đầu đọc kết karyotyp chưa thể đánh giá xác đoạn thêm vào NST số 11 có nguồn gốc từ NST Sau tiến hành kỹ thuật BoBs, kết cho thấy có phát bất thường cặp NST 18 Trisomy phần NST 18q21.1-18q22.2 Như vậy, trường hợp phải dựa vào kết BoBs chẩn đốn thai mắc trisomy phần NST số 18 chúng tơi đưa kết luận cuối Từ tư vấn cho bệnh nhân vấn đề thai nhi gặp phải tiên lượng cho thai mắc trisomy phần NST 18 Điều cho thấy, tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán bất thường NST luc kết kỹ thuật di truyền tế bào có kết cuối ngay, việc chẩn đốn karyotyp phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm người đọc người tiến hành Trong trường hợp này, kỹ thuật BoBs có hạn chế xác định tượng chuyển đoạn nhờ ta khẳng định xác thai mắc trisomy phần NST 18 Do vậy, việc kết hợp hai kỹ thuật với chẩn đoán trước sinh cần thiết để tăng độ xác chẩn đốn Xét trường hợp mẫu ối có bất thường cấu trúc NST có kiểu karyotyp 46,XY,t(2;10)(q37.3;p11.2), 46,XY,der(11)t(3;11)(p21;q24), 46,XY,t(X;1) (p11.2;p36.3), 46,XX,inv(9)(q10;p10), 46,XX,22pstk+ Các mẫu ối chẩn đoán phương pháp di truyền tế bào mà không phát kỹ thuật BoBs Sở dĩ có điều vị trí bị vật liệu di truyền khơng có 82 đầu dò đặc hiệu bao gồm kit Prenatal-BoBs Kit hãng PerkinElmer Khơng có đầu dị đặc hiệu cho NST số 1, 2, 3, 9, 10, 11 số 75 đầu dò đặc hiệu kit Do có số hạn chết chẩn đốn như: phát số bất thường NST tương ứng với vị trí đặc hiệu vây để khảo sát tồn 46 NST khó thực Kết tương đồng với kết Nguyễn Thị Vân Anh cộng (2016) [111] phát mẫu ối có kiểu NST 45,XY,-22,der(9)t(9;22) (p22;q11.1) chẩn đoán phương pháp di truyền tế bào mà không phát kỹ thuật BoBs Theo nghiên cứu Nguyễn Duy Ánh cộng (2017) [115] có trường hợp kết xét nghiệm BoBs trả lời bình thường ni cấy tế bào có kết tam bội (69,XXX) Trong trường hợp thai phụ định chọc ối siêu âm thai nhi có tình trạng chậm phát triển tử cung phát triển bất cân xứng phần thai (đường kính lưỡng đỉnh tương đương 19 tuần chu vi bụng tương đương 16 tuần) Kết BoBs khơng phát tín hiệu bất thường NST 13, 18, 21, X hội chứng vi đoạn Mẫu dịch ối sau tiếp tục xét nghiệm QF – PCR kết có phát bất thường số lượng NST 13, 18, 21 X GVialardet cộng báo cáo trường hợp đa bội 212 mẫu trước sinh không phát BoBs Shaffer cộng trường hợp đa bội không phát 430 mẫu bệnh phẩm Trong đó, 69,XXX xác định nữ bình thường, hai trường hợp 69,XXY Qua cho thấy trường hợp tam bội, thiếu khả phát thêm bớt vùng NST không bao gồm thiết kế sản phẩm, đột biến điểm đơn (point mutation), đảo đoạn chuyển đoạn cân bằng, dị bội toàn hệ NST (ploidy changes), uniparental disomy (UPD) biến thể methylation hạn chế khả chẩn đoán kỹ thuật BoBs Điều cho thấy phương pháp di truyền tế 83 bào có tầm quan trọng định mà kỹ thuật di truyền phân tử dù có nhiều ưu việt chưa thể thay hoàn toàn Bàn luận thêm, chúng tơi muốn nói đến mối liên hệ kết siêu âm thai với kết chẩn đoán trước sinh Bảng 3.7 cho thấy hai trường hợp có dấu hiệu tăng KSSG thơng liên thất phát siêu âm kết chẩn đoán hai kỹ thuật đề thai mắc hội chứng trisomy 21, thai mắc hội chứng trisomy 18 Đây hội chứng gây nhiều bất thường hình thái, điều thể nghiên cứu sàng lọc chẩn đoán trước sinh hội chứng Down Hoàng Thị Ngọc Lan cộng (2006) [120] sử dụng dấu hiệu tăng KSSG để phát thai mắc hội chứng Down với ngưỡng sàng lọc ≥ 3mm tháng đầu có tỷ lệ phát 16,67% Theo Giovanni cs (2005) [78] nghiên cứu 408 thai phụ, tỷ lệ phát thai Down 86,1% với tỷ lệ dương tính giả 13,9% trường hợp có tăng KSSG đơn có kết karyotype bất thường cấu trúc NST Kết phù hợp với nghiên cứu Trần Danh Cường (2011) [73] cho thấy tỷ lệ bất thường NST thai nhi có tăng KSSG 32,4% Trong đó, hội chứng Down chiếm 12,4%, hội chứng Turner chiếm 12%, hội chứng Edwards chiếm 5,6%, bất thường cấu trúc NST chiếm 1,6%, hội chứng Patau chiếm 0,8% 18/20 trường hợp siêu âm phát dị tật hệ tim mạch (thông liên thất, tứ chứng Fallot, theo dõi đứt quai động mạch chủ, ống nhĩ thất hoàn toàn, hẹp đường thất trái, hẹp van động mạch phổi), có loại đột biến khác nhau: trisomy 21, trisomy 18, trisomy 13, trường hợp hội chứng DiGeorge, trường hợp hội chứng Cri du chat Trong trường hợp thai mắc trisomy 18 có bất thường tim hình ảnh siêu âm thai Kết tương tự với kết tác giả Nguyễn Việt Hùng (2006), tác giả Trần Danh Cường Yeo L [121] [122] Trong nghiên cứu dấu hiệu 84 điểm siêu âm chủ yếu hội chứng Edwards dị tật tim, dấu hiệu khác nang đám rối mạch mạc, thoát vị rốn, dị tật hệ thần kinh trung ương Như vậy, kết sàng lọc trước sinh hướng tới hội chứng lệch bội NST, thực tế gặp số đột biến NST khác Kết giải thích hội chứng DiGeorge gây tổn thương nhiều quan phận bất thường hệ tim mạch chiếm 75% Trong hội chứng vi đoạn hội chứng DiGeorge hội chứng phổ biến(1/4000), gây hậu nghiêm trọng, siêu âm có dấu hiệu điểm bất thường hệ tim mạch, bất thường vòm miệng Tuy nhiên, dấu hiệu gặp số bất thường NST khác Hơn nữa, số hội chứng vi đoạn khó phát siêu âm trẻ sinh hội chứng Prader – Willi/Angelma Mặt khác, hội chứng lệch bội NST hội chứng chẩn đoán phương pháp di truyền tế bào, vào kết sàng lọc trước sinh mà định nuôi cấy tế bào hay QF-PCR bỏ sót nhiều trường hợp Vì việc đưa kỹ thuật BoBs vào chẩn đoán trước sinh cần thiết Bảng 3.4 cho thấy, có trường hợp thai phụ phải chọc ối kết sàng lọc huyết cho thấy thai có nguy cao mắc hội chứng Down Tuy nhiên thực tế có trường hợp mắc hội chứng Down thực sự, trường hợp thai mang đột biến chuyển đoạn, thêm đoạn không liên quan đến NST 21 Có trường hợp vừa có kết siêu âm bất thường vừa có kết huyết trả lời thai có nguy cao với hội chứng Down, thai có chẩn đốn 46,XX với kết di truyền tế bào lại chẩn đoán hội chứng Cri-du-chat kỹ thuật BoBs Kết tương đồng với quan điểm sàng lọc huyết mẹ không dành cho hội chứng Down, hội chứng Edwards mà sàng lọc dạng bất thường NST khác Từ thấy rằng, hầu hết kết sàng lọc trước sinh điểm tới hội chứng lệch bội NSTlà hội chứng bất thường NST hay gặp, thực tế chúng tơi cịn gặp số dạng đột biến cấu trúc 85 NST đột biến vi đoạn NST Mặt khác, hội chứng lệch bội NST hồn tồn phát dựa vào phương pháp di truyền tế bào Do đó, vào kết karyptyp hay QF-PCR thiếu sót lớn Hơn nữa, hầu hết hội chứng vi đoạn NST gây tổn thương nhiều quan, phận, đặc biệt chậm phát triển trí tuệ việc phát trước sinh dạng đột biến cần thiết Ngồi ra, kỹ thuật BoBs đánh giá nhiều mẫu bệnh phẩm lần xét nghiệm, thời gian thực nhanh, xác, giá thành phù hợp áp dụng cộng đồng Vì vậy, việc phối kết hợp phương pháp di truyền tế bào kỹ thuật BoBs chẩn đoán trước sinh giúp chẩn đốn nhanh, xác tránh bỏ sót nhiều trường hợp bất thường, giúp thai phụ gia đình có hướng xử trí kịp thời 86 KẾT LUẬN Kết chẩn đoán lệch bội NST đoạn nhỏ NST kỹ thuật Bobs - Phát 20 mẫu bất thường NST, đó: Phát mẫu trisomy 21: 28% Phát mẫu trisomy 18: 20% Phát mẫu trisomy 13: 4% Phát mẫu liên quan đến hội chứng đoạn nhỏ NST: 28%  trường hợp mắc hội chứng DiGeorge: 20%  trường hợp mắc hội chứng Cri du chat: 8% Giá trị kỹ thuật Bobs chẩn đoán trước sinh số hội chứng lệch bội NST đoạn nhỏ NST thai Phối hợp kỹ thuật di truyền tế bào kỹ thuật BoBs, phát tổng số 25/120 mẫu bất thường, đó: - Kết di truyền tế bào kết kỹ thuật BoBs tương đồng với 12/25 trường hợp có bất thường NST chiếm 48%, bao gồm: trường hợp mắc hội chứng trisomy 21, trường hợp mắc trisomy 18, trường hợp mắc hội chứng trisomy 13 - Tỷ lệ bất thường NST phát kỹ thuật BoBs: 80% - Tỷ lệ bất thường NST phát kỹ thuật di truyền tế bào: 72% - Kỹ thuật BoBs phát trường hợp thai mắc hội chứng vi đoạn mà kỹ thuật di truyền tế bào khơng chẩn đốn được, hội chứng DiGeorge hội chứng Cri du chat - Kỹ thuật BoBs phát trường hợp thai mắc trisomy phần NST 18 mà kỹ thuật di truyền tế bào không kết luận - Kỹ thuật BoBs không phát trường hợp tái cấu trúc chuyển đoạn cân bằng, thêm vật liệu di truyền khơng có đầu dị đặc hiệu bị Kit Prenatal-BoBs Kit KIẾN NGHỊ 87 Trên sở kết thu từ nghiên cứu này, xin kiến nghị: Nên đưa kỹ thuật BoBs vào chẩn đoán trước sinh thực song song với phương pháp di truyền tế bào TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Locus gen sử dụng kit CÁC BƯỚC THỰC HIỆN 1.1 Chuẩn bị: Chuẩn bị mẫu ADN: - Sau ADN tách chiết đo kiểm tra nồng độ Nồng độ ADN sử dụng cho xét nghiệm từ 50-100 ng - DNA bảo quản môi trường Tris-EDTA (pH 7.2) - oC năm; -20 oC vòng năm; -70 oC cho năm 1.2 Các bước thực - Quy trình thực với bước chính: + Bước 1: Gắn nhãn DNA: sử dụng enzyme Polymerase để nối nucleotide gắn biotin + Bước 2: Tinh DNA gắn nhãn hóa chất tinh cho sản phẩm PCR + Bước 3: Lai DNA: sản phẩm DNA gắn nhãn lai với hạt BoBs qua đêm + Bước 4: Rửa sản phẩm gắn phân tử huỳnh quang để nhận biết tín hiệu + Bước 5: Sử dụng Luminex 100/200 để đọc tín hiệu BoBsoft để phân tích tín hiệu thành kết Lưu ý: Đưa hóa chất khỏi tủ âm sâu để hóa chất nhiệt độ phịng từ 15 – 30 phút trước sử dụng Đảm bảo hóa chất rã đơng trước sử dụng: Mẫu DNA tinh Random Primer Solution Biotin-dNTP Mix Enzyme Polymerase Đưa hóa chất từ tủ lạnh (2 – oC) để hóa chất nhiệt độ phòng từ 15 – 30 phút trước sử dụng: - Sample Diluent (dung dịch pha loãng) - DNA chứng (nữ) - DNA chứng (nam) Trước sử dụng, lắc (vortex) ly tâm nhanh (spin down) mẫu DNA thực, mẫu DNA chứng hóa chất sử dụng (NGOẠI TRỪ POLYMERASE) Để hóa chất nhiệt độ phòng để đảm bảo độ hòa tan độ đồng tối đa Bước 1: Ghi nhãn DNA (Labeling of Genomic DNA) 1.1.Ghi nhãn đĩa PCR ống PCR 250µL dải ống PCR 1.2.Chuẩn bị phản ứng cho DNA chứng (chứng nam, chứng nữ) Chuyển 50 ng DNA chứng nam chứng nữ vào ống tương đương Thêm Sample Diluent để đủ thể tích ống 24µL 1.3.Chuẩn bị phản ứng cho DNA thực Chuyển 240 ng DNA mẫu thực vào ống tương đương Thêm Sample Diluent để đưa thể tích ống tới 24µL Ghi chú: 24 µL thể tích bắt buộc cho ống mẫu Các mẫu DNA đầu vào với nồng độ 200ng/µL) Nếu nồng độ dải 150 – 200 ng/µL, DNA sử dụng trực tiếp 3.3.Pha lỗng sử dụng dung mơi TE: Thể tích TE cần cho = ((nồng độ đo được/200) x 18.5) – 18.5 µL 3.4.Tạo sơ đồ mẫu cho đĩa thực bước ủ để mẫu đánh dấu với giếng 3.5 Sử dụng bảng sau để chuẩn bị Hybridization Mix cho bước lai ủ Thể tích thừa tính tốn: Hóa chât Thể tích/phản ứng (uL) Hybridization Buffer 11 BACs-on-Beads Mix 1.0 Tổng thể tích Hybridization Mix (uL) Số phản ứng Thể tích cần (uL) 3.6 Đảm bảo Hybridization Buffer đạt nhiệt độ phòng Vortex kỹ lần, lần 10 giây spin down 3.7.Pipette lượng Hybridization Buffer cần thiết vào ống ly tâm 1.5mL Ghi chú: Khi hút dung dịch Hybridization Buffer, hút chậm độ nhớt dung dịch cao 3.8 Vortex BACs-on-Beads Mix kỹ lần, lần 10 giây trước dùng hút lượng thể tích cần thiết vào ống Hybridization Mix 3.9 Ly tâm nhanh Hybridization Mix vortex ký lần, lần 10 giây 3.10 Chuyển 11 uL Hybridization Mix vào giếng sơ đồ bước 3.4 3.11 Chuyển 5µL DNA mẫu tinh vào đáy giếng có chứa Hybridization Mix 3.12 Đậy chặt nắp đĩa cho giếng với nắp thích hợp 3.13.Chuyển đĩa mẫu ủ vào máy TriNEST 52 oC lắc 800 vòng x phút 3.14 Đặt đĩa vào máy PCR biến tính 85 oC phút, hạ nhiệt xuống tới 52 oC 3.15 Khi máy PCR đạt 52 oC, đưa đĩa khỏi máy PCR lần đảm bảo nắp đĩa đóng thật chặt 3.16 Để đĩa nhanh vào máy lắc ủ 52 oC lắc 800 vòng vòng 16 – 20 tiếng 3.17 Lấy túi đá từ tủ lạnh âm sâu để hạ nhiệt máy lắc ủ bước Bước 4: Rửa DNA gắn phân tử báo cáo (DNA Washing and Reporter binding) 4.1.Bật máy Luminex 100/200 để laser hệ thống khởi động trước 30 phút trước sử dụng 4.2 Lấy Wash Buffer từ tủ lạnh 4.3 Bổ sung dung dịch rửa (Wash Buffer 1) cho đủ 125µL cho giếng (nếu sử dụng pipette đa kênh nên lấy thêm lượng dịch cho đủ vào giếng) 4.4 Lấy đĩa ủ lai từ máy lắc ủ (52 oC) cài chế độ 50 oC cho máy lắc ủ 4.5.Tháo nắp giếng cẩn thận nhẹ nhàng Thêm 100uL Wash Buffer vào giếng Hút lên xuống 10 lần nhanh liên tục để trộn dung dịch 4.6 Ủ đĩa 50 oC ủ lắc 1200 vòng x 20 phút 4.7 Chuẩn bị dụng cụ để hạ máy lắc ủ xuống 37 oC 4.8.Trong lúc chờ đợi, lấy Reporter Concentrate, Reporter Diluent, Wash Buffer từ tủ lạnh chuẩn bị Reporter Mix 4.9.Sử dụng bảng sau để tính tốn lượng hóa chất cần thiết: Hóa chât Thể tích/phản ứng (uL) Số phản ứng Thể tích cần (uL) Reporter Concentrate 0.45 Reporter Diluent 112.5 Tổng thể tích Reporter Mix (uL) 4.10 Hút dung dịch Reporter Diluent vào ống thích hợp 4.11 Trộn dung dịch Reporter Concentrate giây, ly tâm nhanh hút lượng dung dịch cần thiết vào ống Reporter Mix Ngay lập tức, gói ống Reporter Mix vào giấy bạc để tránh ánh sáng 4.12.Trộn dung dịch Reporter Mix giây 4.13 Đĩa lọc 0.45um sử dụng cho rửa gắn phân tử Reporter Tạo sơ đồ mẫu đĩa tương tự bước 3.4 4.14.Đậy lại giếng chưa sử dụng đĩa lọc với miếng dán đĩa nhựa 4.15.Tính tốn thể tích dung dịch rửa (Wash Buffer 2) cần thiết để đảm bảo cho giếng có 0.47 mL (thêm thể tích để bù trừ sử dụng pipette đa kênh) 4.16.Thêm 30uL Wash Buffer vào giếng sử dụng đĩa lọc để tạo ẩm cho giếng Không chạm màng đĩa lọc 4.17.Lấy đãi ủ lai khỏi máy lắc ủ (50 oC) Ngay lập tức, cài đặt máy vào chế độ lắc 37 oC Đưa đá tủ âm sâu vào máy lắc ủ, tháo giá đỡ đĩa để hạ nhiệt máy xuống 37 oC Sau đó, chuyển tồn dung dịch giếng đĩa ủ lai sang đĩa lọc tạo ẩm 4.18.Sử dụng hệ hút chân không áp suất 125 mmHg, áp dụng hút giây để hút dung dịch sau chuyển Hút toàn dung dịch giếng dừng lại hết dung dịch 4.19.Thêm 100uL Wash Buffer vào giếng Không chạm màng lọc Lặp lại bước 4.18 4.20.Cho thêm 100uL Wash Buffer vào giếng Không chạm màng lọc Lặp lại bước 4.18 4.21 Lau khô đáy đĩa lọc giấy thấm 4.22 Thêm 100uL Wash Buffer vào giếng Không chạm màng lọc Ghi chú: Đảm bảo máy lắc ủ đạt 37 oC thời điểm Không đợi 15 phút giữ đĩa lọc nhiệt độ phòng bảo khỏi ánh sáng 4.23.Ủ đĩa lọc máy lắc ủ 37 oC 30 phút 4.24 Sau bước ủ với Reporter Mix, sử dụng hút chân không để loại bỏ dung dịch đĩa 4.25 Cho thêm 100uL Wash Buffer vào giếng Lặp lại bước 4.18 4.26 Lau khô đáy đĩa lọc giấy thấm 4.27 Cho thêm 100uL Wash Buffer vào giếng Không chạm màng lọc Ghi chú: Không hút chân không sau bước Đĩa lọc chuyển đọc với hệ thống Luminex 100/200 Nếu bước đo không thực ngay, gói đĩa giấy bạc để bảo vệ khỏi ánh sáng ... tài ? ?Ứng dụng kỹ thuật Bobs để phát số hội chứng lệch bội đoạn nhỏ nhiễm sắc thể thai chẩn đoán trước sinh? ?? với hai mục tiêu: Mô tả số lệch bội đoạn nhỏ NST thai chẩn đoán trước sinh kỹ thuật Bobs. .. giá trị kỹ thuật Bobs chẩn đoán trước sinh số hội chứng lệch bội đoạn nhỏ NST thai 3 Chương TỔNG QUAN 1.1 Một số hội chứng vi đoạn phát kỹ thuật BoBs Đột biến vi đoạn gì? • Đột biến vi đoạn từ... HÀ NỘI PHAN THỊ THU GIANG ứng dụng kỹ thuật Bobs chẩn đoán trớc sinh số hội chứng bất thờng nhiễm sắc thể số hội chứng vi đoạn Chuyờn ngnh : Y sinh học di truyền Mã số : 62720301 LUẬN VĂN TỐT