ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUỲNH THỊ THIỆP Tên đề tài: NGHIÊN CỨU DNA BARCODE CHO MỘT SỐ VẬT NI CỦA VIỆT NAM KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên ngành: Cơng nghệ sinh học Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2014 - 2019 Thái Nguyên, năm 2019 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUỲNH THỊ THIỆP Tên đề tài: NGHIÊN CỨU DNA BARCODE CHO MỘT SỐ VẬT NI CỦA VIỆT NAM KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học Lớp: K47- CNSH Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2014 - 2019 Giảng viên hướng dẫn: TS Phạm Bằng Phương Thái Nguyên, năm 2019 i LỜI CẢM ƠN Lời em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực Phẩm, tồn thể q thầy giáo khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực Phẩm giảng dạy, hướng dẫn em ngày hôm Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Phạm Bằng Phương người thầy trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ em, toàn thể thầy cô Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm động viên giúp đỡ chúng em trình học tập thực đề tài tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn cán bộ, anh chị bạn làm việc Viện khoa học sống – ĐH Thái Nguyên giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm, kỹ tạo điều kiện để đề tài “Nghiên cứu xây dựng DNA barcode cho số vật ni Việt Nam” hồn thành tiến độ có kết tốt Mặc dù có nhiều cố gắng để hồn thiện tốt luận văn tốt nghiệp, trình thực khơng thể tránh thiếu sót định Vì vậy, em mong góp ý thầy, giáo bạn để khóa luận em hoàn chỉnh Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 04 tháng 06 năm 2019 Sinh viên Huỳnh Thị Thiệp ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Các mẫu thí nghiệm phục vụ q trình nghiên cứu 20 Bảng 3.2 Trình tự mồi cho phản ứng PCR 21 Bảng 3.3 Danh mục thiết bị sử dụng 21 Bảng 3.4 Danh mục loại hóa chất sử dụng 22 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng PCR 24 Bảng 4.1: Kết đo độ tinh DNA 26 Bảng 4.2 Vị trí sai khác trình tự nucleotide thị COI mẫu nghiên cứu mẫu công bố NCBI 32 Bảng 4.3 Hệ số tương đồng phân tích trình tự gen COI mẫu dê nghiên cứu với trình tự cơng bố NCBI 33 Bảng 4.4 Vị trí sai khác trình tự nucleotide thị COI mẫu nghiên cứu mẫu công bố NCBI 36 Bảng 4.5 Hệ số tương đồng phân tích trình tự gen COI mẫu nghiên cứu với trình tự cơng bố NCBI 37 Bảng 4.6 Vị trí sai khác trình tự nucleotide thị COI mẫu B nghiên cứu mẫu công bố NCBI 40 Bảng 4.7 Hệ số tương đồng phân tích trình tự gen COI mẫu nghiên cứu với trình tự công bố NCBI 41 iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Lợn Landrace Hình 2.2 Bò Vàng Hình 2.3: Dê Cỏ Ninh Bình Hình 4.1 Kết tách chiết DNA tổng số mẫu mô tai 26 Hình 4.2a Kết PCR thị COI mẫu DH1, DH2,DN1, DN2 27 Hình 4.2b Kết PCR thị COI mẫu B, L 27 Hình 4.3: Kết giải trình tự thị COI mẫu nghiên cứu theo giái trị QV 29 Hình 4.4: Kết BLAST thị COI Mẫu DH1 với thị COI Capra hircus công bố NCBI 30 Hình 4.5 So sánh vị trí sai khác trình tự nucleotide thị COI mẫu nghiên cứu với thị COI cơng bố NCBI 31 Hình 4.6: Kết BLAST thị COI Mẫu DH1 với thị COI Gallus gallus công bố NCBI 34 Hình 4.7: Kết BLAST thị COI mẫu L với thị COI Sus scrofa công bố NCBI 35 Hình 4.8 So sánh vị trí sai khác trình tự nucleotide thị COI mẫu L nghiên cứu với thị COI cơng bố NCBI 36 Hình 4.9 Kết so sánh khác loài 38 Hình 4.10: Kết BLAST thị COI Mẫu B với thị COI Bos taurus công bố NCBI 39 Hình 4.11 So sánh vị trí sai khác trình tự nucleotide thị COI mẫu B nghiên cứu với thị COI cơng bố NCBI 40 Hình 4.12: Kết so sánh trình tự khác lồi 42 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ, thuật ngữ viết tắt Nghĩa đầy đủ từ, thuật ngữ BLAST Basic Local Alignment Search Tool Bp Base pair – cặp bazơ nitơ COI Cytochrome C oxidase Subutnit I Cytb Cytochrome b dATP DeoxyAdenine Triphosphate dCTP DeoxyCytosine Triphosphate ddATP DideoxyAdenine Triphosphate ddCTP DideoxyCytosine Triphosphate ddGTP DideoxyGuanine Triphosphate ddNTP Dideoxynucleotide Triphosphate ddTTP DideoxyThymine Triphosphate dGTP DeoxyGuanine Triphosphate DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate dTTP DeoxyThymine Triphosphate EDTA Etilendiamin tetraaxetic acit GPS Global Positioning System ITS Internal Transcribed Spacer Kb Kilo base – Kilo bazo nito matK Maturase K NCBI Nation Cetrer for Biotechnology Information (trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ sinh học) PCR Polymerase Chain Recation QV Quality value RPM Revolutions Per Minute SDS Sodium Dodecyl Sulfate v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv MỤC LỤC v Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Một số đối tượng vật nuôi phổ biến Việt Nam 2.1.1 Tổng quan lợn 2.1.2 Tổng quan bò vàng 2.1.3 Tổng quan dê 2.2 Cơ sở khoa học đề tài 2.2.1 Công nghệ mã vạch DNA 2.3 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 11 vi 2.4 Phương pháp điện di DNA gel agarose 12 2.5 Kỹ thuật PCR 13 2.6 Phương pháp xác định trình tự nucleotide 14 2.7 Tình hình nghiên cứu DNA mã vạch ngồi nước 15 2.7.1 Tình hình nghiên cứu giới 15 2.7.2 Tình hình nghiên cứu nước 17 Phần ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 20 3.2 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 21 3.2.1 Thiết bị nghiên cứu 21 3.2.2 Hóa chất 22 3.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 22 3.4 Nội dung nghiên cứu 23 3.5 Phương pháp nghiên cứu 23 3.5.1 Phương pháp lấy mẫu 23 3.5.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 23 3.5.3 Phương pháp PCR 24 3.5.4 Phương pháp xác định trình tự nucleotide 25 3.5.5 Phân tích liệu 25 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Kết tách DNA tổng số 26 vii 4.2 Kết PCR khuếch đại thị COI 27 4.3 Kết phân tích thị DNA bacoding 28 4.3.1 Kết phân tích chất lượng giải trình tự 28 4.4 Kết so sánh, phân tích thị COI mẫu nghiên cứu 30 4.4.1 Chỉ thị COI mẫu dê 30 4.4.2 Chỉ thị COI mẫu lợn 34 4.4.3 Chỉ thị COI mẫu bò 38 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngành chăn nuôi Việt Nam phận quan trọng cấu thành nông nghiệp phận quan trọng kinh tế Việt Nam Tình hình chăn ni phản ánh thực trạng sử dụng, khai thác, chế biến tiêu thụ sản phẩm động vật Các sản phẩm từ vật nuôi nguồn cung cấp thực phẩm với tỷ trọng cao, chất lượng tốt giá trị dinh dưỡng lớn cho người, sản phẩm phụ da, mỡ, thịt nguồn cung cấp cho ngành công nghiệp chế biến khác Đồng thời phụ phẩm ngành chăn nuôi nguồn cung cấp phân bón hữu cho trồng trọt Để phục vụ nhu cầu ngày lớn xã hội, việc chọn lọc phát triển giống vật nuôi ngày trọng Trên giới có nhiều nghiên cứu việc chọn lọc, xác định giống vật nuôi thị phân tử, có nghiên cứu phương pháp “DNA barcode” (mã vạch DNA) Đây phương pháp xác định nhanh chóng cho thể sinh vật tới cấp độ loài Về nguyên tắc mã vạch DNA sử dụng trình tự DNA ngắn nằm genome sinh vật chuỗi ký tự giúp phân biệt hai loài sinh vật với Phương pháp ví tương tự máy quét siêu thị đọc hai mã vạch hai sản phẩm khác mà nhìn bên ngồi chúng giống Như vậy, phương pháp mã vạch DNA phương pháp định danh xác định giống vật ni tới cấp độ lồi Những nghiên cứu mã vạch DNA sở vững đáng tin cậy cho nghiên cứu phân loại dựa hình thái, phát triển tất yếu có tính kế thừa từ nghiên cứu phân loại học trước 41 Tiếp tục tiến hành phân tích mức độ tương đồng mức độ sai khác mẫu bò nghiên cứu mẫu công bố NCBI phần mềm MEGAX phiên 7.0 (bảng 4.6) Bảng 4.7 Hệ số tương đồng phân tích trình tự gen COI mẫu nghiên cứu với trình tự công bố NCBI Từ bảng hệ số tương đồng cho thấy, vùng gen COI bò có tính bảo thủ cao Hệ số tương đồng mẫu nghiên cứu mẫu công bố NCBI dao động từ 99,99-100% hệ số sai khác dao động khoảng từ 0-0,01% 4.4.1.2 Kết so sánh, phân tích khác lồi Để khẳng định thị COI mẫu B khuếch đại có lồi Bos taurus Chúng tơi tiến hành so sánh trình tự COI mẫu bò nghiên cứu với trình tự số lồi khác Gallus gallus, Sus scrofa, Canis familiaris công bố NCBI 42 Hình 4.12: Kết so sánh trình tự khác lồi Kết cho thấy khơng có trình tự khác lồi có mức độ tương đồng đáng kể tìm thấy sở liệu Biết chiều dài trình tự tra cứu gồm 253 nucleotide, cho kết BLAST tốt so sánh với trình tự lồi nucleotide có thành phần khơng đồng Vì kết luận trình tự đoạn gen COI mẫu giải trình tự có lồi Bos taurus mà khơng có lồi khác Cặp mồi “Primer CF1b” “Primer CR1b” cặp đặc hiệu với đoạn gen COI loài Bos taurus 43 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Đã tách chiết DNA tổng số mẫu nghiên cứu gồm: Mẫu tai bò, mẫu tai lợn 04 mẫu tai dê - Đã khuếch đại thị COI mẫu mô bò, lợn, dê phương pháp PCR - Đã giải trình tự thành cơng gen COI 03 lồi vật ni phổ biến Việt Nam bò, lợn, dê - Đã có sở khẳng đị`được trình tự gen COI nghiên cứu có tình đặc hiệu lồi, DNA barcode cho lồi vật ni bò, lợn, dê Việt Nam - Đã so sánh, đánh giá tính tương đồng cao trình tự DNA barcode nghiên cứu với trình tự lồi sở liệu - Khẳng định DNA barcode bò lợn khơng có tương đồng đáng kể với trình tự khác lồi DNA barcode dê có mức tương đồng thấp với trình tự gen loài khác sở liệu 5.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu xây dựng DNA barcode cho tất loài động thực vật Việt Nam Xây dựng DNA barcode cho loài động vật quý có nguy tuyệt chủng Xây dựng DNA barcode cho loài gây bệnh trồng 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO I.Tài liệu tham khảo tiếng việt Dương Văn Tăng ,Vũ Đình Duy, Trần Thị Việt Thanh(2014) “Đánh giá khả sử dụng mã vạch COI việc định loại động vật bảo tàng thiên nhiên Việt Nam”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 12(4): 631-638 Khuất Hữu Thanh (2006), Cơ sở kỹ thuật di truyền kỹ thuật gen, NXB khoa học kĩ thuật Hà Nội, Hà Nội Khuất Hữu Thanh (2012), Cơ sở Di Truyền Phân Tử Kỹ Thuật Gen, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Phương Thảo Dương Thúy Yên (2015), “So sánh đặc điểm hình thái DNA mã vạch hai lồi cá bống trân Butis butis Butis humeralis”, Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ Phạm Thị Trang Nhung Dương Thúy Yên (2014), “Đánh giá đa dạng di truyền dòng cá rơ đồng thị phân tử RAPD ISSR”, Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ Trần Thị Việt Thanh, Vũ Đình Duy, Nguyễn Minh Tâm (2015), "Sử dụng mã vạch DNA (DNA barcodes) việc xác định mẫu chim bảo tàng thiên nhiên việt Nam", Tạp chí sinh học, 37(4), 429-436 Trần Trang Nhung (2005), Giáo trình ni dê, NXB Nơng Nghiệp, Hà Nội II.Tài liệu tham khảo tiếng anh Aron J Fazekas Maria L Kuzmina, Steven G Newmaster, Peter M Hollingsworth (2012), "DNA barcoding Methods for Land Plant" Emre Keskin, Sevan Agdamar, Ali Serhan Tarkan (2012), “DNA barcoding common non-native freshwater fish species in Turkey: Low genetic diversity but high population structuring”, Mitochondrial DNA 45 10 Hugo J de Boer, Abderrahim Ouarghidi, Gary Martin, Abdelaziz Abbad, Anneleen Kool (2014), “DNA Barcoding Reveals Limited Accuracy of Identifications Based on Folk Taxonomy”, Plos one 9(1):e84291 11 Joana Costa et al Bruna Campos, Joana S Amaral, M.Eugénia Nunes, M.Beatriz P.P Oliveira, Isabel Mafra (2015), " HRM analysis targeting ITS1 and matK loci as potential DNA mini-barcodes for the authentication of Hypericum perforatum and Hypericum androsaemum in herbal infusions ", Food control 12 Locke SA, Al-Nasiri FS, Caffara M, Drago F, Kalbe M, Lapierre AR, McLauhlin JD, Nie P, Overstreet RM, Souza GT, Takemoto RM, Marcogliese DJ (2015), “Diversity, specificity and speciation in larval Diplostomiidae (Platyhelminthes: Digenea) in the eyes of freshwater fish, as revealed by DNA barcodes”, Int J Parasitol, 45(13):841-55 13 Locke SA, McLaughlin JD, Dayanandan S, Marcogliese DJ (2010), “Diversity and specificity in Diplostomum spp, metacercariae in freshwater fishes revealed by cytochrome c oxidase I and internal transcribed spacer sequences”, Int J Parasitol, 40(3): 333-343 14 Mariana L Lyra, Célio F B Haddad, Ana Maria L de Azeredo-Espin (2016), “Meeting the challenge of DNA barcoding Neotropical amphibians: polymerase chain reaction optimization and new COI primers”, Molecular Ecology Resources 15 Paul D N Hebert, Alina Cywinska, Shelley L Balland Jeremy R deWaard (2003), “Biological identifications through DNA barcodes”, The Royal Society 270 313-321 16 R N Mishra and D Joshi "Jiao Gu Lan (2011), "Gynostemma pentaphyllum: The Chinese Rasayan- Current Research Scenario", 46 International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences: 470228 17 Shilin Chen, et al (2010), “Validation of the ITS2 Region as a Novel DNA Barcode for Identifying Medicinal Plant Species”, PloS One 5(1):e8613 18 Techen, Parveen, Pan, Khan (2014) "DNA barcoding of medicinal plant material for identification", Curr Opin Biotechnol 25: 103-110 III Tài liệu trang web 19 http://www.khuyennongvn.gov.vn/vi-VN/hoat-dong-khuyennong/chuyen-giao-tbkt/giai-phap-phat-trien-chan-nuoi-gia-suc-o-cactinh-mien-nui-phia-bac-mo-rong-dien-tich-trong-co_t114c30n12928 20 http://heogiongnguyentam.com/heo-duc-noc-lon-duc/duc-landrace 21 https://nongnghiep.vn/su-tro-lai-dong-mau-thuan-chung-cua-ga-miapost203680.html 22 https://sinhhocvietnam.com/ma-vach-dna-dna-barcode-va-huong-nghiencuu-ung-dung-o-viet-nam/ PHỤ LỤC Hình 1: Kết giải trình tự thị COI mẫu DH1 Hình 2: Kết giải trình tự thị COI mẫu DH2 Hình 3: Kết giải trình tự thị COI mẫu DN1 Hình 4: Kết giải trình tự thị COI mẫu DN2 Hình 5: Kết giải trình tự thị COI mẫu B Hình 6: Kết giải trình tự thị COI mẫu L ... tài Nghiên cứu DNA barcode cho số vật nuôi Việt Nam 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Xây dựng DNA barcode cho số vật nuôi Việt Nam 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Nhân gen COI số vật ni: Bò,... ni: Bò, lợn, dê - Giải trình tự gen COI - Xây dựng sở liệu DNA barcode cho số vật nuôi Việt Nam - Đánh giá so sánh sở liệu DNA barcode vật nuôi Việt Nam với sở liệu quốc tế 1.3 Ý nghĩa khoa học... chị bạn làm việc Viện khoa học sống – ĐH Thái Nguyên giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm, kỹ tạo điều kiện để đề tài Nghiên cứu xây dựng DNA barcode cho số vật nuôi Việt Nam hồn thành tiến độ có kết