NTTU-NCKH-05 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2016 - 2017 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CALOPHYLLOLID TRONG CHẾ PHẨM DẦU MÙ U BẰNG HPLC Số hợp đồng: 2017.01.46 Chủ nhiệm đề tài: ThS.DS Nguyễn Hoàng Thảo My Đơn vị công tác: Khoa Dược Thời gian thực hiện: 12 tháng Luận văn Thạc sĩ Dược học ii Mục lục MỤC LỤC MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC BẢNG vi TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ MÙ U 1.1.1 Sơ lược Mù u 1.1.2 Tổng quan Dầu Mù u 1.1.3 Tổng quan hoạt chất Calophyllolid Dầu Mù u 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ DẦU MÙ U 10 1.2.1 Các nghiên cứu tiêu chuẩn kiểm nghiệm Dầu Mù u 10 1.2.2 Phương pháp định lượng hoạt chất Dầu Mù u 11 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 12 2.1.1 Nguyên liệu 12 2.1.2 Hóa chất – Dung môi 12 2.1.3 Trang thiết bị 12 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.2.1 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 13 2.2.2 Khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình phân tích 15 2.2.3 Thẩm định quy trình phân tích 15 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 17 3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT CALOPHYLLOLID TỪ DẦU MÙ U 17 3.1.1 Kết khảo sát dung môi chiết calophylloid từ dầu Mù U 17 3.1.2 Chiết cắn courmarin từ dầu Mù u 18 3.1.3 Xử lý mẫu kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) 19 3.1.4 Khảo sát điều kiện sắc ký 20 Luận văn Thạc sĩ Dược học iii Mục lục 3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT TÍNH PHÙ HỢP HỆ THỐNG 23 3.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 24 3.3.1 Tính đặc hiệu 24 3.3.2 Tính tuyến tính 25 3.3.3 Độ lặp lại 26 3.3.4 Độ 27 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 Luận văn Thạc sĩ Dược học iv Danh mục từ viết tắt DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ACN Acetonitril C Nồng độ CĐC Chất đối chiếu DCM Dicloromethan dd Dung dịch DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV MeOH Methanol EtOH Ethanol H Chiều cao pic HL Hàm lượng HPLC High Performance Liquid Chromatography M Khối lượng N Số đĩa lý thuyết PA Purity angel PDA Photodiode array PT Purity threshold - ppm RS Độ phân giải S Diện tích pic SKC Sắc ký cột SKĐ Sắc ký đồ SKLM TLC Thin layer chromatography tR Thời gian lưu UV Định lượng Calophyllolide dầu Mù u HPLC - Nguyễn Hoảng Thảo My Luận văn Thạc sĩ Dược học Danh mục hình ảnh v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Một số sản phẩm từ Dầu Mù u .8 Hình 1.2 Cơng thức khai triển Calophyllolid Hình 1.3 Phản ứng mở vòng lacton Calophyllolid Hình 2.1 Mẫu dầu Mù u nguyên liệu 12 Hình 2.2 Cột chiết pha rắn (SPE ) cột sắc ký HPLC 13 Hình 2.3 Hình minh họa q trình “Thẩm định quy trình phân tích” 16 Hình 3.1 Kết khảo sát dung mơi chiết calophyllolid từ dầu Mù u 17 Hình 3.2 SKĐ mẫu thử Dầu Mù u với phương pháp chiết cắn courmarin qua tỉ lệ dung môi methanol – nước 18 Hình 3.3 Mẫu chuẩn trước sau xử lý qua SPE .19 Hình 3.4 SKĐ mẫu dầu Mù u chưa xử lý qua SPE .19 Hình 3.5 SKĐ mẫu dầu Mù u xử lý qua SPE methanol 90% 19 Hình 3.6 SKĐ mẫu Dầu Mù u qua SPE methanol 100% 20 Hình 3.7 Kết khảo sát Dầu Mù u hệ acetonitril – acid acetic (pH 3,0) 21 Hình 3.8 Kết khảo sát Dầu Mù u hệ methanol – acid acetic (pH 3,0) 22 Hình 3.9 Phổ overlay khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình định lượng calophyllolid Dầu Mù u HPLC 23 Hình 3.10 Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu quy trình định lượng calophyllolid Dầu Mù u phương pháp HPLC 25 Hình 3.11 Đường biểu diễn tương quan nồng độ diện tích pic calophyllolid 26 Hình 3.12 SKĐ overlay liệu SKĐ kết Độ lặp lại 27 Định lượng Calophyllolide dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoảng Thảo My Luận văn Thạc sĩ Dược học vi Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Hàm lượng acid béo Dầu Mù u [13] .4 Bảng 1.2: MIC (µg/ml) dầu Mù u số vi khuẩn Bảng 3.1: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình định lượng calophyllolid Dầu Mù u (n=6) .23 Bảng 3.2: Kết thẩm định tính tuyến tính mẫu đối chiếu calophyllolid 25 Bảng 3.3: Kết khảo sát độ lặp lại quy trình định lượng calophyllolid Dầu Mù u phương pháp HPLC (n=6) 26 Bảng 3.4: Kết khảo sát độ .27 Bảng 3.5: Kết thẩm định quy trình định lượng calophyllolid dầu Mù u 28 Định lượng Calophyllolide dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoảng Thảo My Luận văn Thạc sĩ Dược học Lời cam đoan vii TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Sản phẩm đạt Sản phẩm đăng ký thuyết minh 01 quy trình định lượng Calophyllolid 01 quy trình định lượng Calophyllolid trong dầu Mù u phương pháp sắc ký dầu Mù u phương pháp sắc ký lỏng hiệu lỏng hiệu cao cao 01 báo cáo tổng kết đề tài 01 báo cáo tổng kết đề tài 01 báo 01 báo Thời gian đăng ký : từ ngày đến ngày Thời gian nộp báo cáo: ngày Định lượng Calophyllolide dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoảng Thảo My Đặt vấn đề ĐẶT VẤN ĐỀ -Dầu Mù u, nguyên liệu ép từ Mù u (Calophyllum inophyllum Linn., Balsamaria inophyllum Lour.), thuộc họ Bứa (Guttiferae, Cluciasceae) Dầu Mù u nguyên liệu dân gian sử dụng từ thập niên 20 kỷ trước để điều trị bệnh thần kinh tọa Từ năm 1918, nhà khoa học Pháp bắt đầu nghiên cứu tác dụng chỗ da khả làm lành da dược liệu Khoa học đại có nhiều cơng trình chứng minh tác dụng dược lý dầu tính kháng viêm, kháng khuẩn [25], [20], trị sẹo [34],[42] chữa bỏng [18] mau lành vết thương [35], [38], Y học không ngừng phát triển, sản phẩm điều trị vết thương da cải tiến, nguyên liệu dầu Mù u vị thuốc thu hút quan tâm nhà Dược học nước sản phẩm [6], [7], [22], [31] -Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò PDA cho phép định lượng hàm lượng hoạt chất lẫn độ tinh khiết đỉnh sắc ký để xác định xác hàm lượng mẫu phân tích mang lại nhiều ứng dụng ngành phân tích, kiểm nghiệm Việc xác định hàm lượng Calophyllolid dầu Mù u chưa có DĐVN IV hướng nghiên cứu nhiều nhà khoa học chế phẩm dạng dầu Trên sở đó; tơi tiến hành đề tài “Định lượng calophyllolid chế phẩm dầu Mù u HPLC ” nhằm giới thiệu kỹ thuật kiểm nghiệm dạng bào chế cách xử lí mẫu để làm sở cho việc đánh giá, quản lý chất lượng sản phẩm từ dược liệu Mù u Trong đó, đặc biệt trọng việc định lượng với chất đối chiếu marker phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Định lượng Calophyllolide dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoảng Thảo My Tổng quan tài liệu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ MÙ U 1.1.1 Sơ lược Mù u Tên khoa học: Calophyllum inophyllum Linn (Balsamaria inophyllum Lour.), thuộc chi Calophyllum chi lớn họ Bứa (Guttiferae, Cluciasceae) Tên gọi khác: Hồ đồng, Kungtung, Khchyong (Campuchia),YaraboTetihabocu (Nhật Bản), Alexandrian Laurel (Pháp), Dilo (Fiji), Kamanu (Hawail) [1], [3], [9] Mù u phân bố rộng rãi từ Thái Lan, Malaysia đến Lào, Campuchia, Indonesia số đảo Nam Thái Bình Dương số tỉnh miền Nam Trung Quốc, đặc biệt nhiều Ấn Độ Mù u thân mộc , cao đến 20 – 25 m, đường kính trung bình 30 – 35 cm Lá mọc đối, phía cuống lại, đầu tù, phiến dài 10 – 17 cm, gân nhỏ, chạy song song rõ hai mặt Hoa to, thơm, có màu trắng, mọc thành xim hay kẽ đầu cành đặc điểm bật phân biệt Mù u với loại thân mộc khác [5] Tại Việt Nam, dược liệu dân gian phân bố chủ yếu vùng núi thấp miền Bắc, miền Trung đặc biệt khu vực Tây Nam Bộ Khu vực miền Tây Nam Bộ với số tỉnh điển hình như: Tiền Giang, Long An, Bến Tre, Vĩnh Long, Đồng Tháp, Cần Thơ… thường gặp Mù u dọc theo bờ kênh rạch cao vùng cát ven bờ biển [5], [11] 1.1.2 Tổng quan Dầu Mù u Theo chuyên luận Mù u DĐVN IV; dầu Mù u (Oleum calophylii inophylii) định nghĩa dầu ép từ hạt Mù u tinh chế loại bỏ phần “nhựa” với thể chất dầu lỏng, sánh, màu vàng tới vàng sậm, mùi thơm hắc đặc trưng.[14] Các nghiên cứu nước việc ly trích Dầu Mù u từ hạt với phương pháp khác cho hàm lượng hoạt chất thành phần hóa học có khác biệt Năm 2016, Nguyễn Hữu Hiếu cộng khoa Kỹ thuật Hóa học – trường Đại học Bách Khoa TP.HCM tối ưu hóa q trình kỹ thuật lưu chất siêu tới hạn (SCF – CO2) phân tích thành phần hệ thống GC – MS so sánh với phương pháp ép học chiết với ether dầu hỏa.[8] Trước đó, xét quy mơ cơng nghiệp, luận án Đinh Văn Trạch (2013) sâu vào phương pháp ép lạnh học với hệ thống Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hồng Thảo My Tổng quan tài liệu thu hồi dung môi nhằm nâng cao hiệu suất chiết xác định số thành phần kỹ thuật GC – MS HPLC.[21] Nghiên cứu công bố vào tháng 8/2017 Malaysia dùng kỹ thuật chiết siêu âm (Ultrasonic – assisted extraction, gọi tắt UAE) dùng mơ hình Patricelli để đánh giá động học q trình chiết xuất tối ưu hóa quy trình.[36] 1.1.2.1 Thành phần hóa học Từ năm 1985, nghiên cứu Mù u Khoa Dược – Đại học Y Dược TP.HCM PGS.TS Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ cho thấy hạt Mù u chứa 41-51 % dầu thô, hàm lượng dầu béo chất nhựa dầu thô 71,5% 28,5% Các nghiên cứu tiếp nối Khoa Dược năm 2009 xác định rõ thành phần kỹ thuật GC-FID.[13] [17] Bảng 1.1: Hàm lượng acid béo Dầu Mù u [13] Thành phần acid béo Hàm lượng (%) Acid oleic 37,35 Acid linoleic 28,67 Acid palmitic 18,34 Acid stearic 15,32 Hoạt chất hạt Mù u thuộc nhóm 4-phenyl courmarin; hàm lượng courmarin xác định dầu Mù u thô 0,77% ; Dầu Mù u tinh chế 0,5% ; nhựa dư phẩm 0,15% bã phương pháp ép lạnh để chiết xuất dầu 1,75 – 2,13 % Các dẫn xuất courmarin quan trọng biết đến bao gồm: calophyllolid (C25H22O5), inophyllolid (C25H22O5), acid calophyllolid (C25H24O6), acid inophyllolid (C17H22O3)… [12], [13], [14] Theo liệu chuyên mục Mù u “Những thuốc vị thuốc Việt Nam (2007)” chuyên đề dầu Mù u (Tamanu oil) nhóm tác giả A.C.Dweck thành phần hóa học loại dầu Mù u thuộc khu vực Châu Á châu Phi cho thấy Tocopherol Tocotrienol xem chất chống oxi hóa tự nhiên tạo nên ổn định dầu Trong Calophyllum inophyllum L thành phần D-Tocotrienol (236,0 mg/kg), sau C-Tocotrienol với hàm lượng cao (64-130mg/kg) [5], [32] Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My 18 Kết nghiên cứu 3.1.2 Chiết cắn courmarin từ dầu Mù u Cho toàn lượng cắn coumarin chiết từ dầu Mù u (theo Mục 2.2.1) vào bình định mức 10 ml, hồ tan methanol đến vạch (dịch thử DT1), siêu âm 10 phút Lấy xác 500 µl dịch thử DT1 cho vào bình định mức ml, bổ sung methanol đến vạch, thu dịch thử DT2 Tiếp tục pha loãng 10 lần thu dung dịch thử có nồng độ khoảng 20 µg/ml Lọc qua màng lọc milipore 0,45 µm Tỉ lệ 65 : 35 Tỉ lệ 70 : 30 Tỉ lệ 75 : 25 Tỉ lệ 80 : 20 Hình 3.2 SKĐ mẫu thử Dầu Mù u với phương pháp chiết cắn courmarin qua tỉ lệ dung môi methanol – nước Nhận xét: SKĐ Hình 4.2 cho thấy pic calophylloid chưa đạt độ tinh khiết thời gian lưu, mẫu phân tích cần xử lý để loại bớt tạp Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My 19 Kết nghiên cứu 3.1.3 Xử lý mẫu kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) - Mẫu thử: cắn coumarin chiết từ dầu Mù u Tiến hành rửa giải với dung môi tương ứng với phân đoạn (PĐ) sau: PĐ1: nước (1,5 ml x lần) PĐ2 đến PĐ11: 10 ml hỗn hợp methanol – nước theo tỉ lệ tăng dần methanol từ 10% đến 100% (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 100%) Dịch rửa giải 11 PĐ kiểm tra SKLM để xác định PĐ có calophylloid Các SKĐ SKLM cho nhận xét: - Các PĐ đến (tỷ lệ methanol từ 0% đến 50%) không chiết calophyllolid - Từ PĐ  10: chiết calophyllolid - PĐ 11 (100% methanol) bắt đầu xuất vết tạp - Tỷ lệ phục hồi sau xử lý qua SPE thực mẫu đối chiếu: Dựa diện tích mẫu chuẩn calophyllolid trước sau xử lý qua SPE, tỷ lệ phục hồi đạt 99,43% (S pic calophyllolid chưa qua xử lý SPE = 4520858, S pic sau xử lý qua SPE = 4495164) Mẫu chuẩn chưa qua SPE Mẫu chuẩn qua SPE theo quy trình Hình 3.3 Mẫu chuẩn trước sau xử lý qua SPE Hình 3.4 SKĐ mẫu dầu Mù u chưa xử lý qua SPE Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Hình 3.5 SKĐ mẫu dầu Mù u xử lý qua SPE methanol 90% Nguyễn Hồng Thảo My 20 Kết nghiên cứu Hình 3.6 SKĐ mẫu Dầu Mù u qua SPE methanol 100% Quy trình xử lý mẫu hồn chỉnh: - Chiết cắn courmarin: cân xác khoảng g dầu Mù u, thêm 15 ml methanol, khuấy từ 10 phút có gia nhiệt 60 oC (x lần) Để nguội, lọc lấy dịch cồn Gộp chung dịch chiết, thu hồi dung môi đến cắn Hoà tan cắn với 1,5 ml natri carbonat 10%, chuyển tồn lớp natri carbonat vào bình lắng 60 ml, chiết tiếp với 10 ml ether ethylic (x lần) Để yên cho tách lớp, rút gộp chung dịch ether ethylic, rửa nước cất đến trung tính Thu hồi dung mơi đến cắn courmarin tồn phần (≈ 1,0g) - Xử lý qua SPE: Mẫu thử: cắn coumarin Tiến hành rửa giải với 10 ml hỗn hợp methanol – nước (90 : 10) Lượng dịch thu cho vào bình định mức 10 ml; bổ sung dung mơi đến vạch Lấy xác ml dịch thu được, cho vào bình định mức ml, bổ sung dung môi đến vạch Lọc qua màng lọc 0,45 µm tiến hành sắc ký 3.1.4 Khảo sát điều kiện sắc ký Mẫu thử : dầu Mù u thực theo quy trình xử lý mẫu hồn chỉnh Dung dịch acid acetic 0,05% (pH 3,0) phối hợp với methanol acetonitril – nước (65 : 35); (70 : 30); (75 : 25) Kiểu rửa giải: đẳng dòng Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My 21 Kết nghiên cứu Hệ acetonitril - acid acetic (65 : 35) Hệ acetonitril - acid acetic (70 : 30) Hệ acetonitril - acid acetic (75 : 25) Hình 3.7 Kết khảo sát Dầu Mù u hệ acetonitril – acid acetic (pH 3,0) Hệ methanol - acid acetic (65 : 35) Hệ methanol - acid acetic (70 : 30) Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My 22 Kết nghiên cứu Hệ methanol - acid acetic (75 : 25) Hình 3.8 Kết khảo sát Dầu Mù u hệ methanol – acid acetic (pH 3,0) Thực nghiệm ghi nhận thông số sắc ký nhận xét SKĐ để làm sở lựa chọn hệ dung môi phù hợp Kết quả: chọn hệ methanol – acid acetic 0,05% (70 : 30) dựa kết SKĐ thơng số pic sắc kí Dự thảo quy trình: Dung dịch đối chiếu: dung dịch calophyllolid 20 ppm methanol Dung dịch thử: - Cân xác khoảng g dầu Mù u, thêm 15 ml methanol, khuấy từ 10 phút có gia nhiệt 50 oC (x lần) Để nguội, lọc lấy dịch cồn Gộp chung dịch chiết, thu hồi dung mơi đến cắn Hồ tan cắn với 1,5 ml natri carbonat 10%, chuyển toàn lớp natri carbonat vào bình lắng 60 ml, chiết tiếp với 10 ml ether ethylic (x lần) Để yên cho tách lớp, rút gộp chung dịch ether ethylic, rửa nước cất đến trung tính Thu hồi dung môi, thu mẫu thử cắn courmarin toàn phần Mẫu tiếp tục xử lý qua SPE - Mẫu thử: toàn cắn coumarin nạp vào cột SPE - Rửa giải với 10 ml hỗn hợp methanol – nước (90 : 10) Lượng dịch thu cho vào bình định mức 10 ml; bổ sung dung mơi đến vạch Lấy xác ml dịch rửa giải cho vào bình định mức ml, bổ sung dung môi methanol – nước (90 : 10) đến vạch Lọc qua màng lọc 0,45 µm tiến hành sắc ký Với điều kiện dự thảo trên, tiến hành thẩm định quy trình Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký: Inerstil C18 (250 x 4,6 mm; μm) Tốc độ dòng: 1ml/phút Thể tích tiêm mẫu: 10 µl Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My 23 Kết nghiên cứu Nhiệt độ cột 40 oC Bộ phận phát hiện: detector PDA, bước sóng phát hiện: 234 nm Pha động: methanol – acid acetic pH 3,0 (70 : 30) 3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT TÍNH PHÙ HỢP HỆ THỐNG Tiến hành khảo sát tính phù hợp hệ thống: tiêm lần lặp lại mẫu đối chiếu Hình 3.9 Phổ overlay khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình định lượng calophyllolid Dầu Mù u HPLC Bảng 3.1: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình định lượng calophyllolid Dầu Mù u (n=6) Lần TR S (µV x tiêm (phút) giây) K N Độ Hệ số phân giải bất đối (RS ≥ 1,5) PA PT (0,8 < AS 1,5; hệ số bất đối khoảng 0,8 – 1,5 Ngoài ra, RSD% hệ số dung lượng số đĩa lý thuyết 0,998 Phương trình hồi quy: y = 38648 x , R2 = 0,9999 3.3.3 Độ lặp lại Bảng 3.3: Kết khảo sát độ lặp lại quy trình định lượng calophyllolid Dầu Mù u phương pháp HPLC (n=6) KL cân S Lượng Hàm lượng (g) (µVx giây) calophyllolid (g) (%) 2,0008 1030299 0,0066 0,33 TB = 0,3271 % 1,9999 1023083 0,0066 0,33 SD = 0,0062 2,0105 1026100 0,0066 0,33 RSD% = 1,90 2,0114 997966 0,0064 0,32 e = ± 0,0062 2,0174 1002046 0,0065 0,32 Khoảng tin cậy 2,0070 1042742 0,0067 0,33 µ=0,3171±0,0062 (%) Mẫu Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Số liệu thống kê Nguyễn Hồng Thảo My 27 Kết nghiên cứu Hình 3.12 SKĐ overlay liệu SKĐ kết Độ lặp lại Nhận xét: RSD% hàm lượng calophyllolid < 2%., quy trình đạt yêu cầu độ lặp lại 3.3.4 Độ Thực phương pháp thêm chuẩn, cho vào mẫu thử lượng chất đối chiếu tương ứng nồng độ 50; 100 150 % so với nồng độ định lượng Tiến hành sắc ký nồng độ lần Pic calophyllolid phải có tỷ lệ phục hồi từ 98 – 102% Bảng 3.4: Kết khảo sát độ Mức C chuẩn Nồng độ C chuẩn Tỷ lệ KL mẫu S thêm vào mẫu đo tìm thấy phục hồi lượng Lần thử (g) (µVxgiây) (ppm) (ppm) (ppm) (%) 50% 2,0078 1526817 13 39,31 13,04 100,32 2,0194 1529029 13 39,37 12,95 99,59 2,0150 1536405 13 39,56 13,19 101,49 2,0015 2032271 26 52,33 26,14 100,53 2,0005 2035185 26 52,40 26,23 100,87 2,0011 2025112 26 52,14 25,96 99,84 2,0000 2554263 39 65,77 39,60 101,53 2,0017 2552639 39 65,72 39,53 101,37 2,0110 2558078 39 65,86 39,55 101,42 TB 100,77 RSD% 0,74 hàm 100% 150% Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My 28 Kết nghiên cứu Nhận xét: quy trình đạt yêu cầu độ Bảng 3.5: Kết thẩm định quy trình định lượng calophyllolid dầu Mù u Chỉ tiêu Kết Độ đặc hiệu Đáp ứng yêu cầu tính đặc hiệu quy trình định lượng Độ lặp lại RSD% hàm lượng calophyllolid = 1,90 < 2% Tính tuyến tính Phương trình hồi quy: y = 38648 x, R2 = 0,9999 Độ Pic calophyllolid có tỷ lệ phục hồi từ 98 – 102% (RSD% = 0,74) CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ Qua thời gian nghiên cứu, đề tài thu kết theo mục tiêu nghiên cứu Xây dựng thẩm định quy trình định lượng calophyllolid dầu Mù u: - Quy trình định lượng calophyllolid dầu Mù u thực phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký cột sắc ký C18 (250 x 4,6 mm; m), bước sóng phát hiện: 234 nm, nhiệt độ cột: 40 oC, tốc độ dòng: ml/phút pha động hỗn hợp methanol acid acetic 0,05% (70 : 30) - Quy trình thẩm định với tiêu độ đặc hiệu, tính tuyến tính (y = 38648 x , R2 = 0,9999; khoảng nồng độ – 100ppm) , độ lặp lại (RSD% = 1,90) độ (tỷ lệ phục hồi pic calophyllolid từ 98 - 102%, RSD% = 0,74) với thông số sắc ký đạt yêu cầu quy trình định lượng Mức giới hạn calophyllolid dầu Mù u: ≥ 0,25% Nếu có thời gian nghiên cứu dài hơn, đề tài định hướng xây dựng tiêu chuẩn sở hoàn chỉnh cho chế phẩm dầu Mù u nhằm đánh giá tổng quát chất lượng sản phẩm thị trường nói chung nghiên cứu nói riêng Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My Luận văn Thạc sĩ Dược học 29 Phụ lục TÀI LIỆU THAM KHẢO CÁC TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1] Đỗ Huy Bích (2004), Cây thuốc Động Vật làm thuốc Việt Nam (II), Nhà Xuất Khoa học Kỹ Thuật, Hà Nội, pp 305 - 306 2] Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ (1998), "Điểm lại số cơng trình nghiên cứu ứng dụng dầu Mù u", Tổng quan chuyên khảo Y Dược(37/98), pp 10 - 13 3] Võ Văn Chi (1996), Từ điển thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học 4] Trịnh Hoàng Dương, Hà Diệu Ly (2011), "Chiết xuất curcumin từ củ nghệ vàng (Rhizoma Curcuma longa) xây dựng liệu chuẩn curcumin để thiết lập chất chuẩn chiết từ dược liệu", Tạp chí Dược học 424, pp 64 - 66 5] Đỗ Tất Lợi (2007), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học trang 106 - 107 6] Hà Minh Hiển, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Võ Thị Bạch Huệ, Nguyễn Văn Thị, Bùi Thị Thu Thảo (2013), "Nghiên cứu xác định calophyllolid HPLC- DAD ứng dụng kiểm nghiệm dung dịch thuốc từ dược liệu có dầu Mù U", Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc(2/2013), pp 14-18 7] Hà Minh Hiển, Paul WS Heng, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Nguyễn Văn Thị , Võ Thị Bạch Huệ (2011), "Nghiên cứu thiết lập chất đối chiếu calophyllolid dùng kiểm nghiệm nghiên cứu dược liệu Mù U Calophyllum inophyllum L", Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, pp 15-19 8] Nguyễn Hữu Hiếu, Nguyễn Trọng Huy , Trần Thị Minh Thùy (2016), "Tối ưu hóa q trình trích ly Dầu Mù u kỹ thuật lưu chất siêu tới hạn", Tạp chí Hóa học(19/2/2016), pp 82-87 9]Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất trẻ TP HCM, pp 457 10] Nguyễn Vĩnh Niên, Ngơ Phi Hậu (1998), "Tính kháng nấm ngồi da Dầu Mù u", Tổng quan chuyên khảo Y Dược số 37/1998, pp 17-19 11] Nguyễn Duy Cương , Nguyễn Hữu Quỳnh (1999), Từ điển bách khoa Dược học, Nhà xuất Từ điển Bách Khoa, pp 411 12] (1998), "Điểm lại số cơng trình nghiên cứu ứng dụng Dầu Mù u", Tổng quan chuyên khảo Y Dược, số 37/98, pp 2-6 Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My Luận văn Thạc sĩ Dược học 30 Phụ lục (1998), "Một số kết nghiên cứu ban đầu thành 13] phần hóa học Dầu Mù u", Tổng quan chuyên khảo Y Dược số 37/98, pp 10-13 14] (Calophyllum inophyllum)", 1993, pp 43-46 15] Nguyễn Thị Hồng Phúc (2007), Xây dựng quy trình định lượng Calophyllolid dầu Mù u phương pháp sắc kí khí sắc kí lỏng hiệu cao, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Đại học Y Dược Tp.HCM 16] Phạm Ngọc Dung, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Hà Minh Hiển, Nguyễn Văn Thị , Võ Thị Bạch Huệ (2009), "Phân lập số hợp chất phenol từ nhựa Mù U dư phẩm", Tạp chí Dược học 49 (395), pp 30-33 17] Phan Văn Hồ Nam, Nguyễn Thị Nguyên Sinh, Trần Thị Thảo Phước , Võ Thị Bạch Huệ (2009), "Xác định số acid béo dầu Mù u (Calophyllum inophyllum L.) phương pháp sắc kí khí ( GC-FID)", - 13 (1), pp 62-67 18] Phạm Đình Phú (2001), "Nhận xét lâm sàng điều trị tổn thương bỏng Dầu Mù u", Tạp chí Y học thảm họa bỏng 4, pp 64-66 19] Hoàng Lê Trúc Phương (2014), Tinh chế dầu cám gạo thơ tiêu chuẩn hóa dầu cám gạo (Rice bran oil), Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học 20] Bộ Y Tế (2010), Dược Điển Việt Nam IV 21] Đinh Văn Trạch (2013), Tiêu chuẩn hóa Dầu Mù u thơ dầu Mù u tinh chế sản xuất quy mô công nghiệp, Luận án chuyên khoa cấp 2, Đại học Y Dược Tp.HCM 22] Trần Thanh Thạo, Võ Thị Bạch Huệ , Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ (2002), "Phân lập xác định cấu trúc Calophyllolid từ hạt Mù U (Calophullum inophyllum L.) mọc Việt Nam", Tạp chí Dược học(17/9/02), pp 16-18 TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI 23] A.C Dweck , T Meadowsy (2002), "Tamanu (Calophyllum inophyllum) – the African,Asian, Polynesian and Pacific Panacea", International Journal of Cosmetic Science, pp 1-8 Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My Luận văn Thạc sĩ Dược học 31 Phụ lục 24] Ahmad V.U., Ali M.S., Mahmud S., Perveen S., Rizwani G.H (1998), "Antimicrobial studies on fractions and pure compounds of Calophyllum inophyllum Linn Guttiferae", Pak J Pharmacol (15), pp 13-25 25] Seuly Akter, Md.Saddam Hossain, Israt Jahan Bulbul, Yesmin Begum (2017), "Pharmacological study of Medicinal Plant Calophyllum inophyllum L on Swiss Albino Mice in the management of Pain and inflammation", European Journal of Medicinal Plants 18 (2), pp 1-10 26] Bean M.F., Eggleston D.S., Freyer A.J., Haltiwanger R.C., Patil A.D (1993), "The inophyllums, novel inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase isolated from the malaysian tree, Calophyllum inophyllum Linn.", J Med Chem 26 (36), pp 41314138 27] Cruz Alexandre Bella, Cechinel-Filho Valdir, Noldin Vania F Isaias Daniela E B., Pretto Juliana B , Sartori Mara R K (2004), "Antimicrobial Activity of Fractions and Compounds from Calophyllum brasiliense (Clusiaceae/Guttiferae)”", Z Naturforsch.(59c), pp 657-662 28] Zakaira Muhamad Bin, Ilham Zul , et al (2014), "Anti - infalmmatory activity of Calophyllum inophyllum fruits extracts", Procedia Chemistry 13, pp 218-220 29] Gu Yu - Cheng, Huo Chang Hong, Li - Li Geng, Su Xiao Hui, Shi Wing Wen , Zhang Man - Li (2008), "Chemical constituents of the plants of the genus Calophyllum", Chemistry and Biodiversity 5, pp 2579-2608 30] Bohle D.S , Fotie J (2006), "Pharmacological and Biological Activities of Xanthones", Anti - infective Agents in Medicinal Chemistry, pp 15-31 31] David Febrilliant Susanto, Hakun Wirawasista Aparamarta, Setiyo Gunawan (2017), "Identification of phytochemical compounds in Calophyllum inophyllum leaves", Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, pp - 32] Laure Frederic, Bianchini Jean-Pierre, Raharivelomanana (2008), "Screening of anti HIV-1 inophyllum by HPLC - DAD of Calophyllum inophyllum leaf extracts from French Polynesia Island", Analytical Chimica Acta 624, pp 147 - 153 Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My Luận văn Thạc sĩ Dược học 32 Phụ lục 33] Bouchara J-P, Landreau A., Larcher G., Morel C., Richomme P., Tronchin G (2004), "Investigation of the antifungal activity pf caledonixanthone E and other xanthones against Aspergillus fumigatus", Planta Medica.70, pp 569 - 571 34] L.Kalyanaraman, R.M0han Kumar, Peddy Vishweshwar, R.Pichai, S.Narasimhan (2010),"5-methoxy-2,2-dimethyl-6-[(E)-2-methylbut-2-enoyl]-10phenylpyrano[2,3-f]chromen-8-one (Calophyllolid)", Acta Cryst E66 35] Teddy Léguillie, Marylin Lecso-Bornet, et al (2015), "The wound healing and anti - bacterial activity of five ethnomadical Calophyllum inophyllum oils: an alternative therapeutic strategy to treat infected wounds", Plos one 10 (9), pp - 20 36] Faiznur Mohd.Fuad, Khairiah Abd.Karim (2017), "Kinetic study of oil extraction from Calophyllum inophyllum seeds using Ultrasonic - assisted Extraction Technique", Journal of Physical Science 28 (2), pp 57 - 69 37] Ghaguta Naz, Saiqa Ilyas, Zahida Parveen , Sumera Javed (2010), "Chemical analysis of essential oils from Turmeric (Curcuma longa) Rhizome through GCMS", Asian Journal of chemistry 22 (4), pp 3153 - 3158 38] Shanmugapriya , Chen Yang (2016), "Calophyllum inophyllum: A medical Plant with multiple curative values", Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Medical (4), pp 1446 - 1452 39] Leu T., Bianchini J.P., Faure R., Herbette G., Mejer L., Soulet S (2009), "Elastase inhibitors and cancer preventive potential agents from Calophyllum inophyllum grown in French Polynesia", Planta Medica 75 (9), pp 20 40] T.Daveedu, K.Prasad (2014), "Phytochemical examination and anti - solar activity of Calophyllum inophyllum", International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science Research (4), pp 76 - 77 41] Vandana V, Kodanda Rama Rao CH, Somnath G , Babia L (2017), "Synthesis of Calophyllum inophyllum esters as biofuel feed stock", JOJ Material science (2) 42] Sheng Yu, Hui Yan, Li Zhang, Mingqiu Shan, Peidong Chen, Anwei Ding , Sam Fong Yau Li (2017), "A Review on the Phytochemistry, Pharmacology and Pharmacokinetics of Amentoflavon - a naturally occuringBioflavonoid", Molecules 2017 22, pp 1-23 Định lượng calophyllolid dầu Mù u HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My