VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM pu VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nguyễn Thị Mai Hương PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG ĐỘT BIẾN GEN ATP7B TRONG CÁC THÀNH VIÊN GIA ĐÌNH BỆNH NHÂN WILSON LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2018 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG ĐỘT BIẾN GEN ATP7B TRONG CÁC THÀNH VIÊN GIA ĐÌNH BỆNH NHÂN WILSON Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS TS Tạ Thành Văn Trường Đại học Y Hà Nội GS TS Phan Văn Chi Viện Công nghệ sinh học Lời cảm ơn Nghiên cứu thực hỗ trợ, giúp đỡ nhiều người Tôi xin trân trọng cảm ơn luôn ghi nhớ! Lời cảm ơn sâu sắc tơi xin gửi đến tồn bệnh nhân Wilson gia đình họ Nếu khơng có hợp tác nhiệt tình họ, tơi khơng thể hồn thành nghiên cứu Tơi xin trân trọng cảm ơn hai người thầy: GS.TS Tạ Thành Văn, Trường Đại học Y Hà Nội GS.TS Phan Văn Chi, Viện Công nghệ sinh học hướng dẫn, bảo cho thời gian qua Tôi vô biết ơn PGS.TS Trần Vân Khánh, Trường đại học Y Hà Nội giúp đỡ góp ý tận tình cho tơi q trình thực luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến vị lãnh đạo Bệnh viện Nhi Trung Ương anh, chị đồng nghiệp, đặc biệt TS.BS Nguyễn Phạm Anh Hoa, Trưởng Khoa Gan-Mật tạo điều kiện giúp đỡ q trình nghiên cứu Tơi thực xúc động tự hào hỗ trợ nhiệt tình, động viên, chia sẻ lãnh đạo đồng nghiệp Khoa Di truyền Sinh học phân tử, nơi tơi cơng tác, để tơi hồn thành nhiệm vụ nghiên cứu tôi! Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô anh, chị Viện Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu hệ gen giúp đỡ chặng đường qua Bố, mẹ mang đến với sống, dõi theo, cổ vũ hỗ trợ! Tôi xin dành tặng kết nhỏ bé tới bố mẹ tôi! Tôi vô cảm ơn chia sẻ, giúp đỡ em tôi, người bạn dành cho Họ động lực để luôn cố gắng không ngừng Chồng người thân yêu bên cạnh tôi, động viên yêu thương vô bờ bến! Đặc biệt, muốn chia sẻ niềm vui với thiên thần nhỏ gia đình tơi, lý để sống tốt ngày Vì con, tơi nguyện cố gắng để làm điều có ý nghĩa với gia đình, với sống đặc biệt với bệnh nhân Nguyễn Thị Mai Hương i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết phối hợp với số đồng nghiệp khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chun ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày 29 tháng 06 năm 2018 Tác giả Nguyễn Thị Mai Hương ii MỤC LỤC 1.1 1.2 1.3 MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Lịch sử nghiên cứu bệnh Wilson 1.1.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.1.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam Dịch tễ học phân loại bệnh Wilson 1.2.1 Dịch tễ học 1.2.2 Phân loại bệnh Cơ sở di truyền phân tử bệnh Wilson 1.3.1 Vị trí, cấu trúc phân tử gen ATP7B 1.3.2 Cấu trúc chức protein ATP7B 1.3.3 Đặc điểm đột biến gen ATP7B 11 1.4 Cơ chế bệnh sinh bệnh Wilson 14 1.5 Đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng, tiêu chuẩn chẩn đoán, điều trị bệnh Wilson 18 1.6 1.7 1.5.1 Đặc điểm lâm sàng 18 1.5.2 Đặc điểm cận lâm sàng, tiêu chuẩn chẩn đoán điều trị 23 bệnh Wilson Phát người mang gen ATP7B bị đột biến chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson 26 1.6.1 Phát người mang gen ATP7B bị đột biến 26 1.6.2 Chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson 27 Các kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng chẩn đoán xác định bệnh Wilson 28 1.7.1 Giải trình tự gen phương pháp Sanger 28 1.7.2 Một số phương pháp khác dùng phát đột 29 biến gen ATP7B 1.7.3 Phương pháp phân tích đột biến 31 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 2.2 2.3 Đối tượng nghiên cứu 33 2.1.1 Nhóm bệnh nhân thành viên gia đình 33 2.1.2 Nhóm chẩn đốn trước sinh 33 2.1.3 Tiêu chuẩn lựa chọn 33 2.1.4 Tiêu chuẩn loại trừ 35 Hóa chất thiết bị 36 2.2.1 Hóa chất 36 2.2.2 Thiết bị loại tiêu hao 38 Phương pháp nghiên cứu 38 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 38 2.3.2 Xây dựng phả hệ thu thập mẫu 38 2.3.3 Phương pháp sử dụng phát đột biến gen ATP7B 42 cho bệnh nhân Wilson thành viên gia đình 2.3.4 Phương pháp sử dụng chẩn đoán trước sinh cho thai nhi 47 2.4 Đạo đức nghiên cứu 49 2.5 Thời gian địa điểm nghiên cứu 49 2.6 Sơ đồ nghiên cứu 49 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 51 3.1 Kết xác định đột biến gen ATP7B cho thành viên gia đình bệnh nhân Wilson 51 3.2 3.1.1 Phát đột biến gen ATP7B cho 78 bệnh nhân Wilson 51 3.1.2 Xác định đột biến gen ATP7B cho thành viên gia đình 74 bệnh nhên Wilson Chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson 88 3.2.1 Kết tách DNA tổng số từ dòng tế bào ối PCR 88 3.2.2 Kết chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson 89 CHƯƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ 93 4.1 4.2 Phát đột biến gen ATP7B cho thành viên gia đình 96 bệnh nhân Wilson 4.1.1 Đặc điểm đột biến gen ATP7B 78 bệnh nhân Wilson 96 4.1.2 Ý nghĩa sàng lọc đột biến cho thành viên gia đình bệnh nhân Wilson 109 Ý nghĩa chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson 119 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 122 NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 124 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 125 TÀI LIỆU THAM KHẢO 131 PHỤ LỤC Phụ lục Danh sách bệnh nhân, kết tách DNA tổng sổ phân tích đột biến gen 78 bệnh nhân thành viên 55 phả hệ Phụ lục Danh sách kiểu gen 78 bệnh nhân Wilson 16 Phụ lục Hình ảnh điện di sản phẩm PCR 21 exon gen ATP7B 21 Phụ lục Trình tự đột biến gen bệnh nhân có đột biến IVS20+4A>G 22 Phụ lục Bảng mã di truyền viết tắt acid amin 23 Phụ lục Phả hệ trình tự đột biến gen phả hệ phát sớm người mắc bệnh Wilson chưa có biểu lâm sàng 24 Phụ lục Kết sàng lọc đột biến đích cho thành viên gia đình bệnh nhân mã số WBW120501 30 Phụ lục Kết tách DNA mẫu dịch ối sau nuôi cấy 32 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên đầy đủ Nghĩa tiếng việt ARMS Amplification refractory mutation Hệ thống đột biến chịu nhiệt system nhân ATOX1 Antioxidant protein ATP Adenosine triphosphate ATP7A ATPase copper transporting alpha ATP vận chuyển đồng, chuyển đồng, chuỗi alpha ATP7B ATPase copper transporting beta ATP vận chuỗi beta bp base pair Cặp bazơ cDNA complementary DNA DNA bổ sung CTR1 Copper transporter Chất vận chuyển đồng cs Cộng Cu Đồng DNA Desoxyribonucleic acid ddNTP Dideoxynucleotide triphosphate dNTP Deoxynucleotide triphosphate EtBr Ethidium bromide h hour kb kilo base kDa kilo Dalton KF Kayser-Fleischer MDD Maximum dependence Phụ thuộc tối đa mơ hình Decompositon Model phân hủy Multiplex Ligat on-dependent Kỹ thuật khuếch đại đa mồi Probe Amplification dựa vào phản ứng nối Markov Model Mơ hình Markov MLPA MM vi MM/MM Missense mutation/ Missense Đột biến sai nghĩa/Đột biến mutation sai nghĩa mRNA messenger RNA RNA thông tin MRI Magnetic resonance imaging Chụp cộng hưởng từ RNA Ribonucleic acid NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp RFLP Restricted fragment length Đa hình đột dài đoạn cắt giới polymorphism hạn Servere mutation/Servere Đột biến nghiêm trọng/Đột mutation biến nghiêm trọn Servere mutation/Missense Đột biến nghiêm trọng/Đột mutation biên sai nghĩa SNPs Single nucleotide polymorphisms Đa hình nucleotid đơn TGE Thr-Gly-Glu TGEA Thr-Gly-Glu-Ala TM Transmembrane Xuyên màng UTR Untranslated region Vùng không dịch mã WMM Weight Matrix Model Mơ hình ma trận trọng lượng SM/SM SM/MM vii 37 WBW160605 Vũ Thị L S105X/I1148T 1998 Nam Định 38 WBW160606 Phạm Thị Ngọc Ph I1148T/P1273Q 2007 Hải Dương 39 WBW160608 Lê Văn A IVS14-2A>G/IVS14-2A>G 2006 Hải Dương 40 WBW160609 Nguyễn Như H S105X/c.2169del13 2003 Hà Nội 41 WBW160610S2 Kiều Thị Thu Tr P992L/P992L 2001 Hà Nội 42 WBW160704 Nguyễn Tiến S S105X/S105X 2010 Hà Nội 43 WBW160706 Phạm Anh T -/- 2003 Hà Nội 44 WBW160707 Bùi Văn Đ P992L/D1027H 2005 Hải Dương 45 WBW170808 Hoàng Khánh L S105X/S105X 2000 Hải Phòng 46 WBW160710 Hồng Duy H S105X/S105X 2008 Ninh Bình 47 WBW160713 Nguyễn Anh T S105X/I1148T 2004 Sơn La 48 WBW160714 Hồng Thị M S105X/L902P 2003 Thái Bình 49 WBW160719 Nguyễn Anh V S105X/P1245S 1993 Hà Nội 50 WBW160801 Phạm Quang Đ V176SfsX28/P1052L 2009 Hà Nội 51 WBW160802 Hoàng Tùng K S105X/S105X 2008 Hà Nội 52 WBW160805 Phạm Thị Hải Y S105X/E1173K 2004 Tuyên Quang 53 WBW160901 Tòng Thị B L1371P/L1371P 2004 Sơn La 54 WBW160903 Bùi Quang Đ S105X/R778L 2003 Quảng Ninh 55 WBW120601 Hà Mạnh T S105X/I1148T 1994 Hưng Yên 56 WBW160904 Lê Sỹ Qu L902P/P1273Q 2012 Quảng Ninh 18 57 WBW161101 Nguyễn Thị Hương Th IVS14-2A>G/IVS14-2A>G 2002 Hải Dương 58 PWBW161101 Nguyễn Thị Th IVS14-2A>G/IVS14-2A>G 1999 Nam Định 59 PWBW161103 Đặng Thị Kim Ng S105X/I1148T 2009 Nghệ An 60 WBW161103 Đỗ Xuân H S105X/S105X 2001 Hà Nam 61 WBW170102 Nguyễn Thị Đức Đ R778L/D1027H 2005 Thanh Hóa 62 WBW161202 Nguyễn Thị Thu Th K1010T/L1371P 2003 Phú Thọ 63 WBW170301 Nguyễn Thị Phương M P1273Q/L1371P 2002 Thanh Hóa 64 WBW170303 Nguyễn Đức Yến Nh R778L/R778L 2006 Hà Nội 65 PWBW170306F Nguyễn Minh T IVS6+3A>G/M769HfsX26 1990 Nam Định 66 WBW170605 Phạm Tiến Qu L1371P/L1371P 2007 Hà Nam 67 WBW170703 Dương Văn L S105X/T850I 2006 Hưng Yên 68 WBW170702 Đồn Xn Tr M769HfsX26/T850I 2006 Ninh Bình 69 WBW170704 Đoàn Văn C S105X/P868PfsX5 2007 Quảng Ninh 70 WBW170802 Nguyễn Đức M S105X/T850I 2006 Hà Nội 71 WBW170807 Bùi Thế H T850I/D1027H 1990 Hà Nội 72 WBW170806 Vũ Thùy L T850I/D1027H 2005 Hà Nội 73 WBW160701 Triệu Minh Qu -/- 2003 Hà Nội 74 WBW170901 Nguyễn Thị Ngọc A S105X/S105X 2007 Vĩnh Phúc 75 WBW171005 Phạm Quang T S105X/S105X 2003 Hải Dương 76 WBW171101 Phạm Đức A S105X/S105X 2003 Vĩnh Phúc 19 77 WBW171104 Nguyễn Minh Kh S105X/S105X 2003 Vĩnh Phúc 78 WBW171105 Lương Thị Thu H S105X/V176SfsX28 2005 Yên Bái Ghi chú: (-) Không phát đột biến; chữ đậm: Đột biến 20 Phụ lục 03 Hình ảnh nh điện di sản phẩm PCR 21 exon gen ATP7B Nhận xét: Kết điện di sản phẩm PCR hình cho thấy, y, tồn b 21 exon gen ATP7B đượcc khuếch khu đại thành công, exon đượcc thể th băng đặc hiệu, sáng, sắcc nét kích thước thư tương ứng với tính tốn lý thuyết thuy 21 Phụ lục 04 Trình tự độtt biến bi gen bệnh nhân có đột biến IVS20+4A>G Bệnh nhân mã số WBW160503 có đột đ biến dị hợp tử: (1) độtt biến bi dị hợp tử S105X exon làm thay đổi đ nucleotid C vị trí c.314 cDNA c gen ATP7B thành nulceotid A khiến cho ba TCG G mã hóa Serine (S) thứ th 105 chuyển thành ba TAG G mã hóa acid amin kết thúc (X); (2) độtt biến bi dị hợp tử IVS20+4A>G intron 20 làm thay đổi nucleotid A vị trí c.4124+4 (xi chiều chi nucleotid kể từ exon 20) thành nucleotid G 22 Phụ lục 05 Bảng mã di truyền viết tắt acid amin 23 Phụ lục 06 Phả hệ trình tự độtt biến bi gen phả hệ phát sớ ớm người mắc bệnh nh Wilson chưa có bi biểu lâm sàng Gia đình bệnh nh nhân mã số WBW120601 Phả hệệ gia đình bệnh nhân mã số WBW120601 ? Nam mang gen bệnh b Nữ mang gen bệnh Nam bị bệnh Nữ Bệnh nhân biểu hiệện triệu chứng Chưa đượcc phân tích gen/ Ca sàng lọcc chưa có biểu bi lâm chưa có biểu hiệện bệnh sàng Nhận xét: Phả hệ có m người gái mắc bệnh Wilson (III.2) (III tử vong năm 2007; bệnh nh nhân mã số s WBW120601(III.3) bị bệnh đ có biểu bệnh, em trai út củaa bệnh b nhân (III4) (mã số WBW161001B) chưa có biểu bi lâm sàng Bố, mẹ bệnh nh nhân ngư người mang gen bệnh, chị gái lớn n (III.1) (III khơng có đột biến 24 Trình tự gen c gia đình bệnh nhân mã số WBW120601 Nhận xét: bố bệnh nh nhân (II.1) bị đột biến dị hợp tử I1148T, mẹ m bệnh nhân (II.2) bị đột biến dị hợp p tử t S105X Cả anh em trai bệnh nhân (III.2)) bị b đột biến đột biến dị hợp tử kép S105X I1148T 25 Gia đình bệnh nh nhân mã số WBW160610 Phả hệệ gia đình bệnh nhân mã số WBW16061 0610 ? Nam mang gen bệnh b Nữ mang gen bệnh Nam bị bệnh Nữ Chưa đượcc phân tích gen/ chưa có biểu nb bệnh Bệnh nhân biểu n triệu tri chứng Ca sàng lọcc chưa có biểu bi lâm sàng 26 Trình tự gen gia đình bệnh nhân mã số WBW160610 WBW16 27 Gia đình bệnh nh nhân mã ssố PWBW160402S Phả hệ ccủa gia đình bệnh nhân mã số PWBW160402S 402S ? Nam mang gen bệnh b Nữ mang gen bệnh Nam bị bệnh Nữ Chưa đượcc phân tích gen/ chưa có biểu nb bệnh Bệnh nhân biểu n triệu tri chứng Ca sàng lọc chưa có biểểu lâm sàng 28 Trình tự đột biếến gen gia đình bệnh nhân mã số PWBW160 WBW160402S 29 Phụ lục 07 Kết sàng lọcc đ đột biến đích cho thành viên gia đình đ bệnh nhân mã số WBW120501 30 31 Phụ lục 08 Kết tách DNA tổng số mẫu dịch ối sau nuôi cấy Mã số Hàm lượng DNA (ng/µl) Độ tinh (OD260/280nm) AFW160501 78 1,87 AFW151105 145 1,90 AFW150804 137 1,85 32 ... đột biến gen ATP7B cho thành viên gia đình bệnh nhân Wilson 51 3.2 3.1.1 Phát đột biến gen ATP7B cho 78 bệnh nhân Wilson 51 3.1.2 Xác định đột biến gen ATP7B cho thành viên gia đình... gen ATP7B cho thành viên gia đình 96 bệnh nhân Wilson 4.1.1 Đặc điểm đột biến gen ATP7B 78 bệnh nhân Wilson 96 4.1.2 Ý nghĩa sàng lọc đột biến cho thành viên gia đình bệnh nhân Wilson. .. đột biến gen ATP7B vai trò phát người mang gen bệnh Wilson Nếu bệnh nhân Wilson chẩn đốn theo thang điểm Leipzig người mang gen bệnh phát họ khơng có biểu lâm sàng bất thường xét nghiệm sinh hóa