01-Oct-18 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM NỘI DUNG CƠ SỞ LÝ THUYẾT SẮC KÝ SẮC KÝ KHÍ - GC SẮC KÝ LỎNG HiỆU NĂNG CAO -HPLC 01-Oct-18 Chương SẮC KÝ KHÍ GAS CHROMATOGRAPHY CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.1 GIỚI THIỆU 2.2 CÁC THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA MÁY SẮC KÝ KHÍ 2.3 ỨNG DỤNG 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.1 GiỚi THIỆU Mobile phase Mobile phase Stationary phase CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ Cơ chế tách sắc ký khí CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ SẮC KÝ ĐỒ DẦU BẠC HÀ α-Pinene β-Pinene Sabinene Myrcene Α- Terpinene ILimonene 1,8 – Cineole Cis – Ocimene Γ- Terpinene 10 ParaCymene 11 Terpinene 10 para – Cymene.11 Terpinolene 12 3Octanol.13I-Octen-3-ol 14 Trans Sabinene hydrae 15 I-.Menthone 16 Menthonfuran 17d- Isomenthone 18 β- Bourbonene 19 Linalool 20 Menthyl acetate 21 Neomenthol 22 Terpinen -4-ol 23 βCaryophyllene 24 I – Menthol.25 Pulegone 26 Α-Terpineol 27 Germacrene- D 28 Piperitone 29 Viridiflorol 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2 CÁC THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA MÁY SẮC KÝ KHÍ 2.2.1 Pha động 2.2.2 Cột 2.2.3 Hệ tiêm mẫu 2.2.4 Chương trình nhiệt độ cột 2.2.5 Đầu dò sắc ký khí CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.1 Pha động (khí mang) Nhiệm vụ - Đưa mẫu qua cột -Cung cấp mẫu phù hợp với đầu dò để đo thành phần mẫu Độ tinh khiết: cao Tốc độ - Cột nhồi : 25-150ml/ phút - Cột mao quản : – 25 ml/phút[2] 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.2 Cột Hình 2.5 Sơ đồ mặt cắt ngang cột nhồi (a) cột mao quản [1] CƠ SỞ LÝ THUYẾT SẮC KÝ 2.2.2 Cột Mô tả cột nhồi Mô tả hạt nhồi GSC GLC 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.2 Cột Cột nhồi Typical example of a packed column for gas chromatography This column is made from stainless steel and is m long with an internal diameter of 3.2 mm The packing material in this column has a particle diameter of 149–177 µm CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.2 Cột Cột mao quản Cột mao quản sắc ký khí Chiều dài 30m, đường kính 247µm Bề mặt cột mao quản phủ lớp pha lỏng 0,25 µm 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.2 Cột Cột mao quản Ưu : số đĩa lý thuyết /m nhiều cột dài Nhược : tiêm vào thể tích mẫu nhỏ, 10-2 µl đường kính bé hơn, lớp phim mỏng Phân loại WCOT (wall-coated opentubular column) Cột mao quản đầu tiên, ống, bề mặt bên phủ lớp film mỏng pha lỏng PLOT (porous-layer opentubular column) chứa lớp xốp chất hấp phụ rắn SCOT (support - coated open tubular column ) chứa lớp hấp phụ chất rắn (ví dụ Celite) phủ pha lỏng CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.2 Cột Pha tĩnh cho GLC 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.3 Hệ tiêm mẫu Yêu cầu Tất thành phần mẫu phải hóa Chất phân tích phải nồng độ thích hợp mẫu tiêm vào Quá trình vật lý tiêm mẫu vào vào hệ thống không làm giảm chất lượng q trình tách CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.3 Hệ tiêm mẫu Chuẩn bị mẫu hóa Điều kiện mẫu tiêm vào: Các thành phần mẫu phải hóa Một chất tan có khả hóa lưu cột tiếp tục rửa giải suốt q trình phân tích mẫu tiếp sau Một chất khó hóa ngưng tụ đầu cột, làm giảm hiệu cột Cần thiết tách chất phân tích dễ bay mẫu khỏi thành phần không bay 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.3 Hệ tiêm mẫu Chuẩn bị mẫu hóa Kỹ thuật chiết Chiết lỏng – lỏng Chiết pha rắn Vi chiết pha rắn Purge-and trap (Sục bẫy khí) Headspace sampling Phân hủy nhiệt Chuyển đổi hóa học thành chất hóa CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.3 Hệ tiêm mẫu Chuẩn bị mẫu hóa Kỹ thuật chiết Chiết lỏng – lỏng Chiết lỏng – lỏng chất phân tích khỏi mẫu nước vào methylene chloride dung mội hữu khác 10 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.4 Chương trình nhiệt độ cột Kiểm sốt nhiệt độ cột có tính định để đạt q trình tách tốt sắc ký khí Vì ngun nhân mà cột phải đặt lò cột Tách đẳng nhiệt: Duy trì cột nhiệt độ cố định Chương trình nhiệt độ : Thay đổi nhiệt độ cột trình tách CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.5 Đầu dò sắc ký khí Đặc điểm Đầu dò lý tưởng + Giới hạn phát thấp + Đáp ứng tuyến tính khoảng nồng độ chất phân tích rộng để việc định lượng dễ dàng + Nhạy với tất chất phân tích chọn lọc với loại đặc biệt chất phân tích + Khơng bị ảnh hưởng thay đổi tốc độ dòng nhiệt độ 24 01-Oct-18 Đặc tính số detector GC CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.5 Đầu dò sắc ký khí Đầu dò dẫn nhiệt TCD ( thermal conductivity detector) Sử dụng rộng rãi, đặc biệt cho cột nhồi chất phân tích vơ H2O, CO, CO2 H2 Nguyên tắc : TCD đo dẫn nhiệt chất phân tích khí mang so sánh với độ dẫn nhiệt khí mang tinh khiết 25 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.5 Đầu dò sắc ký khí Đầu dò dẫn nhiệt TCD ( thermal conductivity detector) CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.5 Đầu dò sắc ký khí Đầu dò dẫn nhiệt TCD ( thermal conductivity detector) 26 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.5 Đầu dò sắc ký khí Đầu dò dẫn nhiệt TCD ( thermal conductivity detector) Ưu điểm: + Bởi tất chất phân tích ảnh hưởng đến độ dẫn nhiệt pha động, nên đầu dò TCD đầu dò phổ qt, + Khoảng đáp ứng tuyến tính rộng + Khơng phân hủy chất phân tích Nhược điểm : độ nhạy thấp với hầu hết chất phân tích Độ dẫn nhiệt loại khí khác tương đối so với khí Helium 27 01-Oct-18 Các lưu ý sử dụng detector TCD • Nhiệt độ detector cao, độ nhạy giảm -> cần trì nhiệt độ thấp nhất, đảm bảo mẫu không bị ngưng tụ • Sự thay đổi nhiệt độ ảnh hưởng mạnh đến kết đo • Filament bật có khí • Độ nhậy tỷ lệ nghịch với dòng khí mang + Ref (detector nhậy nồng độ) • Khí xy, acid, halogenated làm giảm tuổi thọ filament • Tránh luyện cột nối vào detector • Khi khởi động máy GC, tăng nhiệt độ detector trước tăng nhiệt độ lò • Khi tháo cột, thiết phải tắt detector chờ nguội • Nếu đầu thoát TCD nối dài, phải ý tránh bị tắc CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.5 Đầu dò sắc ký khí Đầu dò ion hóa lửa FID (flame ionization detector) Nguyên tắc : Đốt cháy hợp chất hữu lửa air / H2 tạo lửa chứa e cation hữu CHO+ Áp điện chừng 300 volt qua lửa tạo dòng nhỏ chừng 10–9 to 10–12 amps Khuếch đại tín hiệu, dòng điện cho tín hiệu phân tích 28 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.5 Đầu dò sắc ký khí Đầu dò ion hóa lửa FID (flame ionization detector) Ưu điểm + Hầu hết nguyên tử Cacbon, ngoại trừ C nhóm carbonyl carboxylic, tạo tín hiệu, nên đầu dò FID đầu dò phổ biến hợp chất hữu + Hầu hết chất vơ nhiều khí H2O; CO2 không phát với đầu dò FID nên FID đầu dò hữu hiệu phân tích mẫu mơi trường khí nước + Rất nhạy, Giới hạn phát nhỏ 10-11g ( 50ppb) đáp ứng tuyến tính rộng CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.5 Đầu dò sắc ký khí Đầu dò ion hóa lửa FID (flame ionization detector) Nhược điểm: + Không đáp ứng với chất vô (H2O, CO2, H2S…) chúng khơng cháy + Nhiệt độ giới hạn 4000C + Phá hủy mẫu, hệ thống đa cấp, FID luôn sử dụng sau + Tín hiệu detector bị ảnh hưởng dị nguyên tố O, S halogen có mặt hydrocacbon 29 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.5 Đầu dò sắc ký khí Đầu dò bắt điện tử (electron capture detector (ECD) Khi chất tan có độ âm điện cao rửa giải khỏi cột, bắt e dòng giảm, sinh tín hiệu CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.5 Đầu dò sắc ký khí Đầu dò bắt điện tử (electron capture detector (ECD) Ưu nhược điểm - ECD chọn lọc với chất tan có nhóm chức có độ âm điện cao, halogien nhóm nitro, tương đối nhạy amines, alcohols, and hydrocarbons - giới hạn phát xuất sắc, - Khoảng tuyến tính đầu dò ECD khơng rộng, its linear range extends over only about two orders of magnitude 30 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.5 Đầu dò sắc ký khí Phổ khối lượng Một máy phổ khối thiết bị ion hóa phân tử khí, phân mảnh chúng thành ion nhỏ Bởi ion có tỷ lệ khối lượng/ điện tích khác nên tách chúng khỏi điện trường từ trường Tín hiệu tương ứng với ion thể số vạch (peak) có cường độ khác tập hợp thành đồ thị gọi phổ khối Phổ khối chứa thơng tin định tính định lượng chất phân tích CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.5 Đầu dò sắc ký khí Phổ khối lượng Phổ khối toluen Ion phân tử đánh dấu màu xanh lục (m/z= 92), ion mảnh xanh dương (m/z= 91) đỏ (m/z= 65) Chiều cao peak phổ khối tỷ lệ với lượng toluen máy quang phổ mảnh định danh toluen 31 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.5 Đầu dò sắc ký khí Phổ khối lượng Sơ đồ khối thiết bị sắc ký khí kết nối khối phổ (GC–MS) Dòng chảy từ cột vào nguồn ion theo cách loại trừ hầu hết khí mang Trong buồng ion hóa phân tử lại – hổn hợp khí mang, dung mơi chất tan- chịu ion hóa phân mảnh Bộ phân tích khối lượng tách ion theo tỷ lệ khối lượng/ điện tích Một đầu dò đếm ion thể phổ khối CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.5 Đầu dò sắc ký khí Phổ khối lượng số chọn lựa để tạo sắc ký đồ sử dụng máy phổ khối đầu dò: Phương pháp phổ biến quét liên tục tồn phổ khối báo cáo tín hiệu tổng tất ion đến detector lần quét Việc quét cung cấp phát cho tất chất phân tích Có thể đạt mức độ chọn lọc cách kiểm soát số tỷ lệ m/z đặc trưng Quá trình gọi kiểm sốt ion chọn lọc 32 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.5 Đầu dò sắc ký khí Phổ khối lượng Ưu điểm + Giới hạn phát xuất sắc, 25fg đến 100pg, (1 femtogram = 0.001 picogram, 1pg=10-12 g) với khoảng tuyến tính 105 orders of magnitude + Bởi phổ khối chất rửa giải cột ghi liên tục, nên kiểm tra phổ khối thời điểm Đây ưu điểm đặc biệt GC-MS: Có thể định danh thành phần hổn hợp CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.3 ỨNG DỤNG 2.3.1 Định tính Xác định thành phần hổn hợp sắc ký - So sánh thời gian lưu tR chất phân tích với tR chất chuẩn đối chiếu điều kiện sắc ký - So sánh sắc ký đồ mẫu phân tích với sắc ký đồ mẫu phân tích cho thêm vào chuẩn đối chiếu Peak ứng với chất cho thêm vào có chiều cao peak tăng lên - Dựa thời gian lưu chất tách sắc ký khí để định tính thường khơng cho kết tin cậy Để có kết xác cần phải kết nối máy sắc ký khí với máy quang phổ hồng ngoại hoắc khối phổ Dựa vào thư viện phổ lưu máy IR MS để so sánh nhận diện chất phân tích 33 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.3 ỨNG DỤNG 2.3.2 Định lượng CƠ SỞ TÍNH TỐN: diện tích peak tỷ lệ với nồng độ chất phân tích tiêm vào cột Diện tích peak xác định tay tự động phần mềm 2.3.2.1 Chuẩn hóa diện tích 2.3.2.2 Chuẩn hóa diện tích với hệ số đáp ứng 2.3.2.3 Ngoại chuẩn 2.3.2.4 Kỹ thuật nội chuẩn 2.3.2.5 Thêm chuẩn CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.3 ỨNG DỤNG 2.3.2 Định lượng 2.3.2.1 Chuẩn hóa diện tích Chuẩn hóa diện tích phép tính % với giả định % diện tích peak với % khối lượng Hàm lượng % X chất phân tích % Diện tích X % 𝐷𝑖ệ𝑛 𝑡í𝑐ℎ 𝑋 = [ 𝐴 ] × 100 ∑ 𝐴 34 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.3 ỨNG DỤNG 2.3.2 Định lượng 2.3.2.2 Chuẩn hóa diện tích với hệ số đáp ứng 𝑓 =𝑓 × 𝐴 𝐴 ×( 𝑊 ) 𝑊 Khi tiêm vào máy sắc ký mẫu chưa biết, diện tích peak đo nhân hệ số Sau đó, tỷ lệ phần trăm tính 𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 % 𝑋 = (𝐴 𝑓 ) × 100 ∑ (𝐴 𝑓 ) CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.3 ỨNG DỤNG 2.3.2 Định lượng 2.3.2.3 Ngoại chuẩn Kỹ thuật so sánh chuẩn Nguyên tắc : Tiêm mẫu chuẩn vào máy có diện tích peak (S) ứng với nồng độ C S=kC  K=S/C Tiêm mẫu xác định vào máy sắc ký có diện tích peak Sx  Cx=Sx/K 35 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.3 ỨNG DỤNG 2.3.2 Định lượng 2.3.2.3 Ngoại chuẩn Kỹ thuật đường chuẩn Nguyên tắc Dựng dãy chuẩn, tiêm vào máy sắc ký có diện tích peak Si tương ứng với nồng độ Ci chất phân tích mẫu thứ i Thiết lập mối tương quan S=f(Ci) phương trình hồi quy tuyến tính Thực tương tự mẫu , có tín hiệu Sx Thế giá trị Sx vào phương trình hồi quy Cx CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.3 ỨNG DỤNG 2.3.2 Định lượng 2.3.2.4 Kỹ thuật nội chuẩn Nội chuẩn chuẩn cho vào mẫu chuẩn chất chuẩn khác, chất chuẩn gọi nội chuẩn tỷ lệ tín hiệu chất phân tích tín hiệu nội chuẩn khơng bị ảnh hưởng có sai số q trình (ví dụ định mức khơng xác, hay số ml mẫu lấy khơng lặp lại) 36 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.3 ỨNG DỤNG 2.3.2 Định lượng 2.3.2.4 Kỹ thuật nội chuẩn Nội chuẩn chuẩn Dung dịch có chất phân tích A nồng độ CA ; SA nội chuẩn có nồng độ CIS ; SIS SA = kACA SIS =kISCIS 𝑆 𝑘 𝐶 𝐶 = =𝐾× 𝑆 𝑘 𝐶 𝐶 𝑆 𝑘 𝐶 𝐶 = =𝐾× 𝑆 𝑘 𝐶 𝐶 Cx CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.3 ỨNG DỤNG 2.3.2 Định lượng 2.3.2.4 Kỹ thuật nội chuẩn Nội chuẩn chuẩn Yêu cầu nội chuẩn - Được rửa giải gần peak chất phân tích - Phân giải tốt với peak chất phân tích - Tương tự mặt hoá học với chất phân tích, khơng phải chất phân tích khơng phản ứng với thành phần mẫu - Giống chuẩn, phải có độ tinh khiết cao - Nội chuẩn thêm vào mẫu với nồng độ tương tự nồng độ chất phân tích trước lúc tạo dẫn xuất hoá học trước phản ứng, có trường hợp thêm nội chuẩn vào trước đo mẫu 37 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.3 ỨNG DỤNG 2.3.2 Định lượng So sánh thêm chuẩn 2.3.2.4 Kỹ thuật thêm chuẩn Mẫu 𝐶 × 𝑉 𝑉 𝑆 𝑆 Mẫu + chuẩn thêm 𝐶 × 𝑉 +𝐶 𝑉 =𝑘 𝐶 × = 𝑘 (𝐶 × 𝑉 +𝐶 𝑉 × 𝑉 𝑉 𝑉 𝑉 × 𝑉 ) 𝑉 Thiết lập tỷ lệ tính nồng độ chất phân tích 38 ... GiỚi THIỆU Mobile phase Mobile phase Stationary phase CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ Cơ chế tách sắc ký khí CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ SẮC KÝ ĐỒ DẦU BẠC HÀ α-Pinene β-Pinene Sabinene Myrcene...01-Oct-18 Chương SẮC KÝ KHÍ GAS CHROMATOGRAPHY CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.1 GIỚI THIỆU 2.2 CÁC THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA MÁY SẮC KÝ KHÍ 2.3 ỨNG DỤNG 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.1 GiỚi THIỆU Mobile... 01-Oct-18 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2 CÁC THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA MÁY SẮC KÝ KHÍ 2.2.1 Pha động 2.2.2 Cột 2.2.3 Hệ tiêm mẫu 2.2.4 Chương trình nhiệt độ cột 2.2.5 Đầu dò sắc ký khí CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 2.2.1