HỘI THẢO DUYÊN HẢI VÀ ĐỒNG BẮC BẮC BỘ Chuyên đề: ĐIỆN DI ADN TRÊN GEL AGAROSE VÀ ỨNG DỤNG \ MỤC LỤC PHẦN I MỞ ĐẦU I Lý chọn đề tài II Mục đích đề tài III Đối tượng, phạm vi áp dụng PHẦN II NỘI DUNG A TÓM LƯỢC LÝ THUYẾT CƠ BẢN CHƯƠNG ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC, CHỨC NĂNG CỦA ADN .5 I Cấu trúc chức ADN Cấu trúc hóa học đơn phân ADN Cấu trúc chuỗi polynucleotide Cấu trúc không gian ADN Chức ADN II Cấu trúc chức gen .8 Khái niệm gen Cấu trúc chung gen cấu trúc III Các loại ADN ADN độc (single - copy ADN) ADN lặp (repetitive ADN) 10 CHƯƠNG ĐIỆN DI ADN TRÊN GEL AGAROSE 11 I Giới thiệu chung điện di 11 Khái niệm 11 Nguyên tắc hoạt động 11 Các loại điện di gel 12 II Sử dụng enzym giới hạn điện di để phân tích ADN 13 Khái niệm enzyme giới hạn 13 Phân loại enzyme giới hạn 14 III Điện di ADN gen agarose 16 Giới thiệu gel agarose 16 Phương pháp điện di ADN gel agarose .16 CHƯƠNG III ỨNG DỤNG CỦA ĐIỆN DI ADN TRÊN GEL AGAROSE .20 I Ứng dụng điện di để xác định kích thước, đặc điểm phân tử ADN 20 II Điện di để tinh thu nhận mẫu 21 III Ứng dụng điện di cho Southern Blot 21 IV Ứng dụng điện di để phân tích sản phẩm PCR .22 V Ứng dụng điện di để phân tích ADN tiểu vệ tinh vi vệ tinh 24 B CÂU HỎI VẬN DỤNG 26 I CÂU HỎI TỰ LUẬN 26 II CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM 38 PHẦN III KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHẦN I MỞ ĐẦU I Lý chọn đề tài Trong vòng 20 năm trở lại đây, sinh học phân tử công nghệ gen phát triển mạnh mẽ đem lại thành tựu vĩ đại cho khoa học công nghệ cuối kỉ 20 đầu kỉ 21, phân tích ADN ARN gen người Từ đó, sinh học phân tử trở thành cơng cụ đắc lực cho nhiều lĩnh vực khoa học khác như: khảo cổ học, nhân chủng học, di truyền y học đặc biệt giám định vụ án hình Có nhiều phương pháp khác sử dụng để phân tích ADN ARN, điện di gel phương pháp sử dụng phổ biến nhờ ưu điểm nhanh tương đối đơn giản Điện di kỹ thuật dùng để phân tách để tinh đại phân tử đặc biệt acid nucleic protein sở kích thước khối lượng, điện tích cấu hình chúng Trong loại điện di ADN gel điện di ADN gel agarose công cụ sử dụng rộng rãi quan trọng để phân tích phân tử sinh học Agarose gel loại gel thông dụng nhất, phần thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách đoạn ADN có kích thước khoảng 0.5 – 20 kb Kỹ thuật đơn giản thực nhanh Hơn nữa, vị trí ADN gel xác định trực tiếp: băng ADN gel nhuộm nồng độ thấp thuốc nhuộm huỳnh quang phát ánh sáng tử ngoại Phương pháp ứng dụng vào nhiều mục đích khác kiểm tra huyết thống, chẩn đoán bệnh di truyền, gây đột biến điểm, phân tích mẫu ADN cổ, xác định kiểu gene đột biến, so sánh mức độ biểu gene Với vai trò quan trọng nên đề thi học sinh giỏi cấp thường có phần câu hỏi điện di Vì với mong muốn nâng cao chất lượng học sinh giỏi, cung cấp cho giáo viên học sinh nguồn tư liệu để tham khảo, giảng dạy, học tập quan trọng hết hoàn thiện kiến thức thân phần phân tích ADN phương pháp điện di, chọn nội dung “Điện di ADN gel agarose ứng dụng” làm đề tài nghiên cứu II Mục đích đề tài - Nghiên cứu số vấn đề chung cấu trúc chứa ADN - Nghiên cứu phương pháp điện di ADN gel agarose ứng dụng - Định hướng tư cho học sinh số tập vận dụng III Đối tượng, phạm vi áp dụng - Giáo viên học sinh lớp chuyên sinh - Giáo viên học sinh lớp không chuyên, yêu thích mơn sinh học PHẦN II NỘI DUNG A TÓM LƯỢC LÝ THUYẾT CƠ BẢN CHƯƠNG ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC, CHỨC NĂNG CỦA ADN I Cấu trúc chức ADN Axit deoxyribonucleic (ADN) polyme có phân tử lượng lớn, có mặt tất tế bào sống ADN tập trung chủ yếu nhiễm sắc thể nhân tế bào, ngồi có số lượng nhỏ nằm ty thể lục lạp - ADN nhân Số lượng ADN không thay đổi nhân tế bào lồi Cấu trúc hóa học đơn phân ADN a b Hình Bốn loại base ADN (a) cấu trúc nucleotide - dAMP (b) Phân tử ADN cấu tạo từ đơn phân nucleotide Mỗi nucleotide có thành phần bản: (1) đường pentose deoxyribose; (2) nhóm phosphate (3) bốn loại base nitơ Hai loại base cytosine (X) thymine (T) có cấu trúc vòng đơn carbon nitrogen gọi pyrimidine Hai loại base adenine (A) guanine (G) có cấu trúc vòng kép (hình 1a) Tên loại base dùng để đặt tên cho nucleotide Khi bazơ nitơ liên kết với phân tử đường pentose liên kết β-glycoside tạo thành nucleoside Liên kết β-glycoside hình thành nguyên tử carbon thứ (C 1') đường pentose với nguyên tử thứ (N9) bazơ purine với nguyên tử thứ (N1) bazơ pyrimidine Đồng thời gốc đường pentose nối với nhóm phosphate nguyên tử carbon thứ năm (C5') liên kết phosphomonoester để tạo thành nucleotit hồn chỉnh (hình 1b) Do có chứa gốc photphat nên nucleotide thường có tính acid mạnh tan nước Các nucleoside monophosphate xem axit tên gọi phản ảnh Vì vậy, nucleotit có mang điện tích âm Cấu trúc chuỗi polynucleotide Các nucleotide ADN nối với mối liên kết cộng hố trị có tên liên kết 3',5'-phosphodiester gốc đường nucleotide với nhóm phosphate nucleotide kế tiếp, tạo thành chuỗi polynucleotide Vì vậy, chuỗi kéo dài theo chiều 5'→3' (đầu 5' mang nhóm phosphate tự đầu 3' chứa nhóm -OH tự do) Chúng có khung vững gồm gốc đường phosphate xếp luân phiên nhau, base nằm bên Trình tự base đọc theo chiều xác định 5'→3' Đây cấu trúc hoá học sơ cấp ADN (hình 2) Hình Cấu trúc chuỗi polynucleotide ADN Cấu trúc không gian ADN Năm 1953, J Watson F Crick: tổng hợp số liệu phân tích hóa học tán xạ tia X, để xây dựng nên mơ hình cấu trúc phân tử ADN Theo mơ hình này, phân tử ADN có đặc trưng chủ yếu cấu trúc khơng gian sau: - ADN gồm hai chuỗi đối song song (antiparallel) mạch có chiều 3' - 5' mạch có chiều 5'– 3’, uốn quanh trục trung tâm theo chiều xoắn phải, với đường kính 20A o (1angstrom = 10-10m) gờm nhiều vòng xoắn lặp lại cách đặn chiều cao vòng xoắn 34Ao, ứng với 10 cặp base (base pair, viết tắt bp) - Các khung đường-phosphate phân bố mặt chuỗi xoắn base nằm bên trong; chúng xếp mặt phẳng song song với thẳng góc với trục phân tử, với khoảng cách trung bình 3,4Ao - Hai sợi đơn gắn bó với mối liên kết hydro (vốn lực hóa học yếu) hình thành cặp base đối diện theo nguyên tắc bổ sung "một purine - pyrimidine" Cụ thể là, ADN tồn hai kiểu kết cặp base đặc thù A-T (với hai liên kết hydro) G-C (với ba liên kết hydro) Hình Cấu trúc khơng gian ADN theo mơ hình J Watson F Crick - Tính chất bổ sung theo cặp base dẫn đến base hai sợi đơn chuỗi xoắn kép Vì vậy, ADN sợi kép có: A = T G = C (quy luật Chargaff); nghĩa (A+G) = (T+C) hay tỷ số (A+G)/ (T+X) = 1, tỉ lệ (A+T)/ (G+X) đặc thù cho lồi Ngồi mơ hình J.Oatxơn, F.Cric nói đến người ta phát dạng dạng A, C, D, Z mơ hình khác với dạng B (theo J.Watson, F.Crick) vài số: số cặp nuclêôtit chu kỳ xoắn, đường kính, chiều xoắn Ở số loài virut thể ăn khuẩn ADN gồm mạch pôlinuclêôtit ADN vi khuẩn, ADN lạp thể, ti thể lại có dạng vòng khép kín Chức ADN ADN có chức năng: vừa lưu giữ bảo quản thông tin di truyền vừa truyền thông tin di truyền qua hệ a ADN lưu giữ bảo quản thông tin di truyền – Thông tin di truyền tức thông tin cấu trúc phân tử prôtêin mã hóa ADN dạng trình tự ba nulêơtit nhau, trình tự qui định trình tự xếp axit amin phân tử prôtêin tổng hợp – Mỗi đoạn phân tử ADN mang thông tin qui định cấu trúc loại prơtêin gọi gen cấu trúc Bình thường, gen cấu trúc chứa khoảng từ 600 đến 1500 cặp nuclêôtit b ADN truyền thông tin di truyền qua hệ – ADN có khả tự nhân đôi phân li Sự nhân đôi phân li ADN kết hợp với nhân đôi phân li nhiễm sắc thể phân bào chế giúp truyền thông tin di truyền từ tế bào sang tế bào khác, từ hệ thể sang hệ thể khác – ADN có khả mã tổng hợp ARN qua điều khiển giải mã tổng hợp prơtêin Prơtêin tổng hợp tương tác với mơi trường thể tính trạng thể II Cấu trúc chức gen Nhiễm sắc thể chứa ADN cấu trúc mang gen Gen truyền từ bố mẹ sang xem đơn vị di truyền, ảnh hưởng lên cấu trúc chức thể Khái niệm gen Gen đoạn xác định phân tử ADN (một số virut ARN) có chức di truyền định – chuỗi pôlipeptit hay phân tử ARN Ở tế bào nhân thực gen nằm NST nhân tế bào có gen nằm bào quan tế bào chất Cấu trúc chung gen cấu trúc Hình Cấu trúc chung gen cấu trúc - Mỗi gen mã hóa cho prơtêin điển hình gờm vùng trình tự nuclêơtit: + Vùng điều hòa nằm đầu 3' mạch mã gốc gen mang tín hiệu khởi động kiểm sốt phiên mã + Vùng mã hóa mang thơng tin mã hóa cho axit amin + Vùng kết thúc nằm đầu 5' mạch mã gốc gen, mang tín hiệu kết thúc phiên mã Vùng mã hóa có cấu trúc phân mảnh không phân mảnh tùy thuộc vào sinh vật Các gen sinh vật nhân sơ có vùng mã hóa liên tục Phần lớn gen sinh vật nhân thực có vùng mã hóa khơng liên tục Xen kẽ đoạn mã hóa axit amin (exon) đoạn khơng mã hóa axit amin (intron) Các gen gọi gen phân mảnh Số lượng exon intron gen khác khác Ở sinh vật nhân sơ có vùng mã hóa liên tục (gen khơng phân mảnh) Ở sinh vật nhân thực có vùng mã hóa khơng liên tục: xen kẽ đoạn mã hóa axit amin (exơn) đoạn khơng mã hóa axit amin (intron) Vì vậy, gen gọi gen phân mảnh a b Hình Gen khơng phân mảnh sinh vật nhân sơ (a) gen gen phân mảnh sinh vật nhân thực (b) Cấu trúc intron exon gene đặc điểm để phân biệt ADN sinh vật eukaryote prokaryote Các intron chiếm phần lớn cấu trúc hầu hết gene thể eukaryote Các đoạn intron enzyme cắt cách xác khỏi phân tử mARN trước chúng khỏi nhân tế bào Vị trí cắt enzyme xác định đoạn ADN gọi đoạn đờng (consensus sequences) (đoạn có tên thấy phổ biến tất thể eukaryote) nằm cạnh đoạn exon (hình 5) III Các loại ADN Mặc dù ADN mang thông tin mã hóa cho protein thực tế có 5% số tỷ cặp nucleotide genome người thực làm chức này, lại phần lớn vật liệu di truyền chưa biết chức Người ta chia ADN thành loại ADN độc ADN lặp ADN độc (single - copy ADN) ADN độc chiếm khoảng 45% genome gờm gene mã hố cho protein Các đoạn ADN loại thấy lần (hoặc vài lần) genome Tuy nhiên phần mã hóa cho protein chiếm phần nhỏ loại ADN mà thơi, phần lớn lại intron đoạn ADN nằm xen gene ADN lặp (repetitive ADN) ADN lặp chiếm 55% lại genome, đoạn ADN lặp lặp lại lên tới hàng nghìn lần genome, có loại chính: * ADN vệ tinh (satellite ADN): Loại ADN chiếm khoảng 10% genome tập trung số vùng định NST, chúng xếp nối nhau, ADN vệ tinh chia thành loại nhỏ: - ADN vệ tinh alpha: có kích thước 171bp, lặp lặp lại nhiều lần với chiều dài hàng triệu bp Loại thấy cạnh tâm động NST - ADN tiểu vệ tinh (minisatellite ADN): Đó trình tự base lõi lặp lại có kích thước từ 14 500 bp, lặp lặp lại với chiều dài thay đổi từ 1.000 base (1 KB) đến 30.000 base (30 KB) Các tiểu vệ tinh diện rải rác nhiều vị trí gen, tiểu vệ tinh đa vị trí; hay có vị trí gen, tiểu vệ tinh đơn vị trí - ADN vi vệ tinh (microsatellite ADN): Là trình tự có có kích thước nhỏ từ - 13 bp, lặp lại nhiều lần (từ 10 đến 60 lần) với tổng chiều dài 1000 base Do kích thước nhỏ nên trình tự gọi STRs (Short TADNem Repeats, trình tự lặp lại) Hai loại ADN tiểu vi vệ tinh có khác lớn chiều dài người với người khác điều làm chúng trở nên hữu ích việc lập đồ gene ADN tiểu vệ tinh vi vệ tinh gặp với tần số trung bình 2kb genome chúng chiếm khoảng 3% genome * ADN lặp lại rải rác: Loại ADN chiếm khoảng 45% genome, gồm loại: - Các yếu tố rải rác có kích thước ngắn (SINEs: short interspersed elements): kích thước từ 90 đến 500bp - Các yếu tố rải rác có kích thước dài (LINEs: long interspersed elements): kích thước 7.000bp Các trình tự base lặp lại khơng mang mã có ý nghĩa chức Cũng trình tự base có ý nghĩa chức (gọi gen), trình tự base lặp lại di truyền từ cha mẹ sang theo quy luật di truyền Tuy nhiên khác với gen, khó tìm thấy khác biệt trình tự base gen cá nhân, có nhiều trình tự base lặp lại giúp giúp phân biệt cá nhân với nhân khác, thế, giúp tìm xem họ có quan hệ huyết thống với hay khơng Các trình tự base lặp lại gọi dấu vân tay ADN 10 b Quan sát kết điện di hình 22C kết hợp với kết phân tích câu a: người III1 mang NST 13, phân tích locut Z thấy người phải lấy NST từ mẹ NST từ bố Từ suy kiểu gen bố (II1), mẹ (II2) (III1, III2) sau: Bố (II1) EE HI KM Locut X Locut Y Locut Z Mẹ (II2) EF II LN Con (III1) EEF III KML Con (III2) EE HI KL Do hai người III1 III2 phả hệ di truyền alen từ bố mẹ lôcut X, Y Z sau: Locut X Locut Y Locut Z Bố (EE) Mẹ (EF) Bố (HI) Mẹ (II) Bố (KM) Mẹ (LN) Người III1 nhận giao tử EE F II I KM L Người III2 nhận giao tử E E H I K L c Xét locut Z: người III1 nhận alen (K M) từ bố (II1) => rối loạn phân ly cặp NST 13 giảm phân người bố II1 0,2 Xét locut Y: bố (II1) dị hợp HI, người III1 nhận alen I từ bố => rối loạn phân ly NST xảy kỳ sau giảm phân II bố II1 Vậy: - Rối loạn phân bào xảy kỳ sau giảm phân II người bố II1; - Đã xảy trao đổi chéo lôcut Y Z kỳ đầu giảm phân I, làm hốn đổi vị trí alen K M (do lơcut Y gần tâm động) (Vị trí đánh dấu X vị trí xảy trao đổi chéo kỳ đầu giảm phân I) 33 Giao tử bị rối loạn phân ly NST thụ tinh với giao tử bình thường, tạo mắc bệnh Câu Một nhân vật nam tiếng bị kiện bố đứa trẻ Việc phân tích locut VNTR1 VNTR2 bị cáo (kí hiệu D), người mẹ (M) đứa trẻ (B) phương pháp phóng xạ tự chụp thu hình bên Mỗi locut VNTR có alen Ở locut VNTR1, tần số alen 1, 2, tương ứng quần thể 0,2; 0,4; 0,3 0,1 Ở locut VNTR2, tần số alen 1, 2, 0,1; 0,1; 0,2 0,6 a Ảnh phóng xạ tự chụp nêu người D bố đứa trẻ B hay sai? Giải thích b Xác suất trung bình để người đàn ơng khác quần thể bố đứa trẻ B bao nhiêu? Trả lời a Đúng Vì Theo kết điện di gen VNTR1: Bé “B” mang hai alen gen mà mẹ “M” khơng có alen gười đàn ơng “D” có alen Tương tự kết điện di gen VNTR2, kết cho thấy bé “B” mang hai alen gen VNTR2 mà mẹ “M” khơng có alen gười đàn ông “D” có alen Từ kết luận người D có khả cao bố đứa trẻ B b Xác suất trung bình để người đàn ơng khác quần thể bố đứa trẻ B 0,24 Giải thích: 34 ... 16 Giới thiệu gel agarose 16 Phương pháp điện di ADN gel agarose .16 CHƯƠNG III ỨNG DỤNG CỦA ĐIỆN DI ADN TRÊN GEL AGAROSE .20 I Ứng dụng điện di để xác định kích... tích gel số hóa (gel documentation system) Hình 14 Hệ thống máy chụp ảnh điện di Hình 15 Kết điện di gel agarose chụp ánh sáng UV 19 20 CHƯƠNG III ỨNG DỤNG CỦA ĐIỆN DI ADN TRÊN GEL AGAROSE Điện di. .. khối lượng, điện tích cấu hình chúng Trong loại điện di ADN gel điện di ADN gel agarose công cụ sử dụng rộng rãi quan trọng để phân tích phân tử sinh học Agarose gel loại gel thông dụng nhất,