CHUYÊN ĐỀ: MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA SINH HỌC PHÂN TỬ MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Hiện nay, di truyền học đã, tiếp tục đ ược nghiên c ứu ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khoa học thực tiễn Trong ứng dụng di truyền học, theo tôi, ứng dụng Sinh học phân t r ất đa d ạng, phong phú có nhiều mẻ, đại Việc lựa chọn biên t ập nội dung cần thiết, ứng dụng quan trọng, có tính m ới c ập nhật, vừa cập nhật với nghiên cứu mới, vừa tiếp cận với yêu cầu đề thi học sinh giỏi cấp, giúp h ọc sinh có nhìn t quát hơn, tiếp cận sâu với kiến thức di truy ền phân t nói riêng di truyền học nói chung Với lý đó, tơi viết chun đề: “ Một số ứng dụng Sinh học phân tử” nhằm hướng học sinh tiếp cận ứng dụng quan trọng nghiên cứu, nghiên cứu tiếp tục nghiên cứu sở ứng dụng hiểu biết Sinh học phân tử Mục đích đề tài Đề tài đề cập đến ứng dụng quan trọng đã, ti ếp t ục nghiên cứu di truyền học phân tử Vì vậy, tơi viết đề tài trước hết để giúp thống kê cách đầy đủ, logic v ới n ội dung giảng dạy; sau để chia sẻ với h ọc sinh không ch ỉ ki ến th ức v ề ứng dụng di truyền học phân tử mà hướng nghiên cứu, tìm tòi phát triển nội dung học PHẦN NỘI DUNG I LAI PHÂN TỬ Lai phân tử gì? Khi phân tử ADN mạch đôi đun lên nhiệt độ v ượt q “nhiệt độ nóng chảy” (Tm) hai mạch tách rời phá v ỡ liên kết hidro nối liền hai mạch Nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột bắt c ặp khơng x ảy Lúc phân tử ADN tồn môi trường dạng mạch đ ơn d ưới cấu hình vơ trật tự Ngược lại, sau hai mạch tách rời, nhiệt độ đ ược làm gi ảm t t cộng với điều kiện thích hợp, chúng bắt cặp trở lại Hiện tượng gọi lai phân tử Hai mạch ADN có nguồn gốc khác có trình tự nucleotit bổ trợ liên kết với điều kiện phù hợp (về nhiệt độ, đ ộ pH, nồng độ muối đệm) để tạo nên phân tử ADN Hiện tượng liên kết xảy hai mạch ADN với nhau, hai mạch ARN ADN ARN Phân tử axit nucleic s ợi kép hình thành gọi phân tử lai trình kết c ặp gi ữa baz thuộc hai mạch đơn axit nucleic có nguồn gốc khác theo nguyên t ắc bổ sung gọi trình lai phân tử Các phương pháp lai phân tử ứng dụng 2.1 Phương pháp Southern blot Phương pháp Southern blot cho phép nghiên cứu ADN c gen, ki ểm tra kết chuyển gen kiểm tra có mặt gen gen tế bào Quy trình: - Tách ADN gen tế bào - Sử dụng enzyme cắt gi ới hạn đ ể cắt phân t ADN thành nh ững đoạn nhỏ, điện di gel agarose để tách đoạn có kích th ước khác - Gây biến tính ADN gel b ằng dung d ịch NaOH-0,5M, sau đó, chuyển ADN từ gel sang màng lai Trong trình chuy ển, v ị trí ADN phải giữ nguyên - ADN cố đ ịnh màng đ ược lai v ới m ẫu dò có đánh d ấu phóng xạ, nhiệt độ 65°C thời gian lai khoảng 3- Sau trình lai ng ười ta rửa màng lai để loại bỏ mẫu dò không bắt cặp chuyên bi ệt v ới ADN cố định màng lai - Dùng kĩ thuật phóng x t ự ghi đ ể đ ịnh v ị phân t lai Trong kĩ thuật này, người ta đặt phim nhạy cảm với tia xạ áp sát vào màng lai Các phân tử lai có đánh dấu phóng xạ tác động lên phim k ết qu ả thể qua chấm đen phim * Các ứng dụng quan trọng Sourthern blot: - Lập đồ giới hạn gen - Phát đa dạng trình tự m ột gen ch ủng hay cá thể khác qua so sánh đồ giới hạn chúng - Phát đột biến đoạn, đột biến điểm hay tái t ổ h ợp gen chúng làm thay đổi đồ giới hạn 2.2 Phương pháp Northern blot Phương pháp lai Northern blot phương pháp lai ARN c tế bào v ới mẫu dò ADN Về nguyên tắc giống lai Southern blot, tiến hành sau: ARN (đã làm biến tính) phân tích theo kích th ước nh ện di gel agarose có chứa chất làm biến tính Các chất làm biến tính có tác dụng ngăn cản hình thành cấu trúc bậc hai ARN sau biến tính Và đó, khơng cản trở di chuyển nh tách c ARN gel Sau đó, ARN chuyển lên màng lai Nh ững ARN c ố định màng lai đem lai với mẫu dò ADN có đánh dấu phóng xạ đ ể t ạo phân tử lai ARN-ADN Các phân tử lai phát nh kĩ thuật phóng x t ự ghi * Ứng dụng: - Phát có mặt mARN mẫu khác - Phân tích biểu gen hai mẫu - Phát virus ARN 2.3 Lai chỗ Lai chỗ phương pháp lai phân t ử, đó, trình t ự axit nucleic c ần tìm nằm tế bào hay mơ Lai chỗ cho phép nghiên cứu axit nucleic mà không c ần qua giai đo ạn tách chiết chúng khỏi mô, tế bào Các ứng dụng kiểu lai r ất đa dạng từ kĩ thuật định vị gen nhiễm sắc thể, phát dòng vi khuẩn tái tổ hợp phương pháp tạo dòng đến việc nghiên c ứu m ột mARN chuyên biệt tế bào mơ Phương pháp tốn h ơn lai Southern blot, mẫu dò đánh dấu huỳnh quang thay cho m ẫu dò đánh dấu phóng xạ Tùy loại tế bào mơ có th ể th ực hi ện phương pháp lai chỗ khác * Ứng dụng: - Lai tế bào mô: thường sử dụng để phát mARN Các loại mARN hoạt động giai đoạn khác trình phát triển tế bào thể Lai tế bào mô nhằm nghiên cứu giai đo ạn hoạt động mARN, từ đó, tìm hiểu hoạt động gen, mối liên quan phiên mã giải mã, định vị gen cần nghiên cứu nhiễm sắc thể - Lai NST: Phương pháp cung cấp thơng tin xác v ề v ị trí phân bố trình tự ADN cần tìm nhiễm sắc th ể nh m ột mẫu dò chuyên biệt - Lai khuẩn lạc: Phương pháp s dụng đ ể phát hi ện dòng vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp cần tìm ngân hàng gen Ngân hàng gen trải mặt thạch hộp petri Sau khuẩn lạc đạt kích thước định, người ta thu lấy dấu ấn chúng cách áp màng lai mặt thạch Mỗi khuẩn lạc để lại vài tế bào vi khu ẩn màng lai Sau xử lí màng lai NaOH để làm v ỡ tế bào vi khuẩn làm biến tính ADN Kết phóng xạ tự ghi dấu ấn cho phép xác định dòng vi khuẩn cần tìm hộp pectri ban đầu Dòng đ ược thu nhận phân tích II PCR PCR gì? PCR chữ viết tắt cụm từ Polymerase Chain Reaction, Ph ản ứng chuỗi trùng hợp "phản ứng khuếch đại gen" PCR kỹ thu ật phổ biến sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo nhiều sao) đoạn ADN mà không cần sử dụng sinh vật sống nh E coli hay nấm men Trong thực tiễn, PCR dùng để khuếch đại đoạn DNA ngắn, xác định phần; khuếch đại đoạn ADN vùng gennom trình tự nu đầu đoạn ADN bi ết Đó có th ể gen đơn, hay phần gen Trái với sinh vật sống, quy trình PCR copy mảnh ADN ngắn, lên đến 10kb Một vài ph ương pháp copy mảnh kích thuớc lên đến 40kb nhiều so v ới nhiễm sắc thể ADN tế bào eukaryote – ví dụ tế bào người ch ứa tỉ cặp base PCR cần nhiều thành phần, gồm: - ADN mẫu ch ứa mảnh DNA cần khuếch đại - C ặp m ồi (primer), đ ể xác đ ịnh ểm b đầu kết thúc vùng cần khuếch đại - ADN-polymerase xúc tác cho vi ệc nhân lên ADN - Nucleotides (ví d ụ dNTP) nguyên li ệu cho ADN-polymerase để xây dựng ADN - Dung d ịch đ ệm, cung c ấp mơi tr ường hóa học cho ADN-polymerase Phản ứng PCR thực chu kỳ nhiệt Đây máy đun nóng làm nguội ống phản ứng nhiệt độ xác cho phản ứng Đoạn mồi: Là đoạn ADN cần khuếch đại xác định mồi chọn lọc Mồi đoạn ngắn, sợi ADN nhân tạo – không 50 (th ường 18-25) nucleotides phù hợp cách xác điểm bắt đầu kết thúc ADN cần khuếch đại Nó gắn chặt với ADN mẫu nh ững ểm khởi đầu kết thúc, nơi mà ADN-polymerase nối bắt đầu trình tổng hợp sợi ADN Chiều dài tốt đoạn mồi từ 20-40 nucleotide với nhiệt độ biến tính khoảng từ 60 – 75 °C Quy trình PCR Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ Mỗi chu kỳ g ồm 2-3 giai đo ạn biến đổi nhiệt độ (thường 3) Nhiệt độ th ời gian th ực c chu kỳ phụ thuộc vào nhiều yếu tố Những yếu tố gồm enzyme tổng hợp ADN, nồng độ ion hóa trị hai, dNTPs dùng ph ản ứng, nhi ệt đ ộ nóng chảy (Tm) mồi - Giai đoạn 1- Biến tính: Nhiệt độ tăng lên 92-96 °C đ ể tách hai s ợi ADN Trước chu kỳ 1, ADN thường biến tính đến th ời gian m chuỗi đ ể đảm bảo mẫu DNA mồi phân tách hồn tồn dạng sợi đơn - Giai đoạn 2- Gắn mồi: Sau sợi ADN tách ra, nhi ệt đ ộ đ ược h thấp xuống để mồi gắn vào sợi ADN đơn Nhiệt độ giai đoạn phụ thuộc vào đoạn mồi thường thấp nhiệt độ biến tính 50 °C (4555 °C) Sử dụng sai nhiệt độ giai đoạn dẫn đến vi ệc đo ạn m ồi khơng gắn hồn tồn vào ADN mẫu, hay gắn cách tùy tiện - Giai đoạn 3- Kéo dài: Hỗn hợp ADN m ồi đ ược ủ v ới enzim Taq polymerase loại dNTP Enzim bắt đầu bám vào hoạt động dọc theo sợi ADN Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc ADN-polymerase Thời gian b ước phụ thuộc vào ADN-polymerase chiều dài mạch ADN cần khuếch đại Sản phẩm PCR nhận biết kích th ước chúng qua việc sử dụng điện di gel agarose Kết đoạn ADN nhỏ h ơn di chuyển nhanh đoạn lớn qua gel từ cực âm đến c ực d ương Kích thước sản phẩm PCR xác định việc so sánh v ới thang ADN, thang có chứa ADN biết trước kích th ước, n ằm gel Tối ưu hoá PCR Do PCR nhạy, nên phải tránh nhiễm DNA khác có phòng thí nghiệm (vi khuẩn, virus, ADN, ) Vì mẫu ADN, h ỗn h ợp ph ản ứng quy trình ADN, phản ứng phân tích sản phẩm, nên đ ược th ực khu vực riêng biệt Ở giai đoạn chuẩn bị hỗn h ợp phản ứng, ph ải chuẩn bị phòng riêng biệt với đèn UV Phải sử dụng găng tay cho bước PCR thay pipet Thuốc th dùng PCR ph ải chuẩn bị riêng biệt dùng cho mục đích Các m ẫu ph ải giữ riêng biệt với mẫu ADN khác Phản ứng có kiểm sốt (ki ểm sốt bên trong), ngoại trừ ADN khn mẫu, phải th ực hiện, đ ể kiểm tra nhiễm bẩn Những ứng dụng PCR – Xác định đoạn trình tự cần nghiên cứu – Phát đột biến – Nghiên cứu q trình tiến hố phân tử – Phục hồi gen tồn hàng triệu năm – Chọn giống vật nuôi, trồng – Lựa chọn cặp cha mẹ chủng thời gian ngắn – Xác định loài mới, loài đặc hữu ph ưng pháp di truy ền phân tử – Y học – Khoa học hình – Chuẩn đốn xác bệnh nhiễm trùng từ vi khuẩn, n ấm, virus – Chuẩn đoán sớm bệnh gây ung th ư, bệnh di truy ền – Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm – Là kỹ thuật cho kỹ thuật khác như: RAPD, SSR… 4.1 Vân tay di truyền (Finger print) Vân tay di truyền kỹ thuật pháp y sử dụng đ ể xác đ ịnh m ột người cách so sánh ADN người với mẫu có, ví d ụ nh ư, m ẫu máu thu từ trường vụ án so sánh di truyền v ới mẫu máu người tình nghi Có thể cần lượng nhỏ ADN thu từ máu, tinh dịch, nước bọt, tóc Về lý thuyết cần m ột mạch ADN đ ơn đ ủ ADN tất sinh vật giống S ự khác cá thể lồi trình tự cặp base Có hàng t ỉ cặp base ADN cá nhân, trình tự base người khác 10 liên kết xảy hai mạch ADN với nhau, hai mạch ARN ADN ARN b Những nhân tố ảnh hưởng tới lai phân tử: - Thành phần bazơ nitơ phân tử ADN - Độ dài phân tử ADN - Nồng độ ADN thời gian phản ứng - Các điểm bắt cặp sai lệch - Môi trường phản ứng: nhiệt độ, ion,… Câu 2: Cơ chế khuếch đại ADN PCR có khác biệt so v ới c th ể? Đáp án: - Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho helicase - Kết hợp với enzyme ADN polymerase chịu nhiệt (Taq ADN polymerase) để tổng hợp ADN môi trường thích hợp - Hệ thống điều nhiệt thích hợp với đoạn mồi thiết kế chuyên biệt, chủ động Câu 3: Cho biết ưu, nhược điểm PCR khuếch đại gen, cách kh ắc ph ục nhược điểm? Đáp án: * Ưu điểm: 35 - Tốc độ cao - Đơn giản: + Chỉ cần lượng nhỏ ADN để làm việc + ADN hoàn chỉnh không b ị h h ại + Không c ần ph ải có trình t ự c vùng ADN h ướng đ ến đ ể khuếch đại → trình tự hai bên gene quan tâm → đột biến gen vùng quan tâm không ảnh hưởng đến s ự khuếch đại → đ ột biến chép phân tích * Nhược điểm: - Độ dài chuỗi ADN cần khuếch đại: 200–1000 bp - Tỷ lệ chép sai cao 1/109 nu - Ngoại nhiễm - Không phân biệt tế bào sống hay chết - Quy trình định danh vi khuẩn dựa vào nuôi cấy * Khắc phục: - Tách chiết ADN bảo đảm ADN khuôn tinh khiết - Sử dụng ADN polymerase tốt - Lưu ý sử dụng dụng cụ thí nghiệm cần hạn chế thao tác th ừa th ải Câu 4: Nhiệm vụ Taq ADN polymerase PCR? Nhiệm vụ primer? Tại sau số chu kì định, số lượng sản phẩm PCR b ị giới hạn? Các yếu tố cần điều chỉnh để tối ưu hóa phản ứng PCR? Đáp án: 36 - Taq polymerase (hay Taq) enzyme chịu nhiệt thường dùng phản ứng PCR, hoạt động tối ưu nhiệt độ 72°C Enzyme có vai trò xúc tác cho trình lắp ráp nucleotide A, T, G, C vào mạch ADN tổng hợp theo chiều '→ 3' có mặt ion Mg2+ Enzyme khơng bao gồm hoạt tính exonuclease '→ 5' - Cặp mồi (primer), để xác định điểm bắt đầu kết thúc vùng cần khuếch đại Mồi đoạn ngắn, sợi ADN nhân tạo – không 50 (thường 18-25) nucleotides phù hợp cách xác điểm bắt đ ầu kết thúc ADN cần khuếch đại Nó gắn chặt với ADN mẫu nh ững điểm khởi đầu kết thúc, nơi mà ADN-polymerase nối bắt đ ầu trình tổng hợp sợi ADN - Số chu kì lặp lại phản ứng PCR th ường không 50 m ỗi chu kì thường kéo dài khoảng phút Khi số chu kì l ớn h ơn 50, n ồng đ ộ dNTP, mồi hoạt tính Taq bị suy giảm nghiêm trọng nồng độ sợi khuôn tăng cao Điều ức chế phản ứng PCR - Do PCR nhạy, nên phải tránh ô nhiễm ADN khác có phòng thí nghiệm (vi khuẩn, virus, ADN, ) Vì m ẫu ADN, h ỗn h ợp ph ản ứng quy trình ADN, phản ứng phân tích sản phẩm, nên đ ược th ực khu vực riêng biệt Ở giai đoạn chuẩn bị hỗn h ợp phản ứng, phải chuẩn bị phòng riêng biệt với đèn UV Ph ải sử d ụng găng tay s ạch cho bước PCR thay pipet Thuốc th dùng PCR phải chuẩn bị riêng biệt dùng cho mục đích Các mẫu phải giữ riêng biệt với mẫu ADN khác Phản ứng có kiểm sốt (kiểm sốt bên trong), ngoại trừ ADN khn mẫu, phải thực hiện, để kiểm tra nhiễm bẩn Câu 5: Thế vacxin ADN? Ưu, nhược điểm vacxin ADN gì? 37 Đáp án: Vacxin ADN plasmid kĩ thuật chứa gen mã hóa cho protein kháng nguyên đặc trưng vi sinh vật Các plasmid tiêm (thường vào cơ) đưa gen trực tiếp vào số tế bào hấp thu tế bào lân cận nơi kim tiêm đưa vào Ngồi ra, plasmid có th ể đưa vào súng bắn gen (các viên đạn vàng bọc ADN plasmid) cách đẩy plasmid vào tế bào gần bề m ặt c thể, thường da màng nhầy Khi vào bên tế bào, vài plasmid tái tổ hợp vào nhân gen điều hòa b ởi m ột promoter mạnh eukaryote, tế bào tổng hợp kháng nguyên mã hóa plasmid * Ưu điểm: - Có thể thiết kế vacxin đa giá (Trên plasmid g ắn nhiều gen mã hóa trộn nhiều loại plasmid có chứa ADN mã hóa cho lo ại protein khác Hỗn hợp vacxin ADN không bị ảnh h ưởng l ẫn nhau, nh đơn giản hóa tiến trình tiêm chủng) - Trình diện kháng nguyên MHC I MHC II - Đáp ứng miễn dịch tập trung vào kháng nguyên quan tâm - Không cần tổng hợp protein - Thời gian “nhớ ” dài, không cần tiêm nh ắc lại * Nhược điểm: - Không áp dụng cho vi sinh vật có nguồn gốc gây bệnh khơng ph ải kháng nguyên protein - Nguy sáp nhập vào ADN tế bào chủ dẫn đến đột biến gen 38 - Có khả gây phản ứng miễn dịch chống lại ADN (tự miễn) - Đưa vacxin ADN vào thể, phân bố ADN vacxin tế bào không đạt mức tối đa Câu 6: Kháng thể tái tổ hợp gì? Ưu điểm kháng th ể đ ơn dòng tái t ổ h ợp so với kháng thể đơn dòng thơng thường? Đáp án: Kháng thể tái tổ hợp (Recombinant antibodies – rAbs) loại kháng th ể tạo phòng thí nghiệm, sử dụng công nghệ ADN tái tổ h ợp, tách biệt hồn tồn với kiểm sốt hệ miễn dịch Các gen kháng th ể phân lập chèn vào ADN plasmid trung gian Sau đó, chúng đ ược đưa vào tế bào vật chủ để biểu hiện, như: vi khuẩn, nấm men, dòng tế bào động vật có vú * Ưu điểm kháng thể tái tổ hợp: - Cần lượng kháng nguyên tinh để sản xuất - Rút ngắn thời gian sản xuất (chỉ cần vài tuần) - Có thể tổng hợp dựa vào kháng nguyên nào, bao gồm: kháng nguyên người có độ bảo tồn cao, tác nhân không gây đáp ứng miễn dịch, kể phân tử độc tố - Không gây phản ứng mẫn cảm bất lợi - Có thể tạo nhiều dạng như: đoạn “cánh tay” kháng th ể (Fab fragments), đoạn vùng biến đổi đơn (scFv, ch ỉ mang nh ất m ột ví trí gắn kháng ngun), đơi (dimeric scFv); biểu 39 loại vật chủ như: tế bào E coli, tế bào động vật có vú, n ấm men, n ấm m ốc, tế bào côn trùng tế bào thực vật - Dễ dàng hòa tan với thuốc độc tố, nên có th ể đ ược dùng trị liệu - Không cần dùng đến tế bào lympho B chúng khơng ổn định, d ễ bị gen kháng thể, dễ chết lấy khỏi mơi trường đơng lạnh Kháng thể đơn dòng tái tổ hợp tạo cách phân lập gen kháng thể riêng lẻ Chỉ cần có gen kháng thể dễ dàng tạo đ ược lượng lớn kháng thể tương ứng - Kháng thể đơn dòng tái tổ hợp mã hóa trình t ự gen, th ế có độ tin cậy cao tạo nhiều - Dễ dàng thực tối ưu hóa, tối ưu hóa lực, kỹ thu ật sinh học phân tử PCR tạo lỗi ngẫu nhiên (error – prone PCR), đ ột biến gen trực tiếp (site-directed mutagenesis) - Có thể sản xuất với khối lượng lớn mà không c ần đ ến tế bào động vật, vượt qua vấn đề đạo đ ức Câu 7: Thực chất liệu pháp gen gì? Gen trị liệu gì? Đáp án: Liệu pháp gen thực chất phương pháp chữa bệnh gen Trong đó, gen trị liệu là: - Các gen hoạt động bình th ường (gen lành) đưa vào tế bào để thay gen hỏng, gen chức năng, khôi ph ục hoạt động bình thường tế bào sống thể 40 - Là nh ững gen có kh ả mã hóa m ột protein đặc hiệu đưa vào tế bào sống tạo nên loại protein đặc hi ệu Các protein đặc hiệu ức chế hoạt động gen khác t ế bào, kìm hãm khả phân chia tế bào gây chết tế bào b ị bệnh - Nh ững gen đ ưa vào t ế bào ho ạt đ ộng đ ồng thời với gen bệnh (gen bị đột biến tế bào) làm hạn chế tác động gen bệnh hỗ trợ, bù đắp cho gen bị hỏng - Gen li ệu pháp gen b ất ho ạt đ ược đ ưa vào tế bào thay cho gen lành đó, nhằm hạn chế sản ph ẩm không cần thiết gen lành tạo cho tế bào trạng thái m ới, có tác dụng chống lại bệnh tật - Gen tr ị li ệu có th ể nh ững đo ạn oligonucleotide có tác dụng kìm hãm hoạt động gen bị hỏng, bị đột biến tế bào Câu 8: Có thể sử dụng liệu pháp gen điều trị AIDS nh th ế nào? Đáp án: - Sử dụng vector liệu pháp để chuyển gen trị liệu vào tế bào nh ằm hạn chế khả xâm nhiễm tái của HIV Trong tr ường h ợp người ta sử dụng hai loại vector: viral virus (adenovirus, AAV HIV1), non-viral virus (oligonucleotide, polycation, liposome ) - Kích hoạt hệ thống gen tế bào, tăng cường miễn dịch chống phát triển HIV/AIDS - Sử dụng gen tự sát ced biến đổi, làm cho tế bào bị chết có HIV xâm nhiễm Khi HIV xâm nhiễm tế bào, liệu pháp đưa gen tự 41 sát (ced) thymidin kinase (TK) phối hợp sử dụng thuốc chống virus ganciclovir (GCV), tạo thành phức hợp ganciclovir-phosphate Ganciclovirphosphate ức chế hoạt động enzyme DNA polymerase, làm cho trình tái gen tế bào bị ngừng, phân chia tế bào bị gián đoạn, tế bào co lại chết dần Tế bào nhiễm HIV bị chết, h ạn ch ế kh ả lây lan HIV thể - Tạo DNA vaccine phòng chống nhiễm HIV Câu 9: Cơng nghệ gen ứng dụng tạo giống v ật nuôi, trồng? Đáp án: Gồm: - Công nghệ chỉnh sửa gen: Công nghệ chỉnh sửa gen cho phép cắt bỏ bổ sung đoạn trình tự ADN (gồm đến nhiều nucleotids đến vài gen), thay đổi trình tự nucleotids thay nucleotids ADN vị trí xác định nhiễm sắc thể hệ gen - Công nghệ bất hoạt gen (RNAi): Công nghệ cho phép gây bất hoạt (Knock out) làm giảm hoạt hóa (Knock down) gen thể sống giống cây, giống mục đích người Câu 10: a Chọn lọc ưu lai ứng dụng công nghệ gen có ưu ểm so v ới chọn lọc ưu lai phép lai? b Thế thị ADN? Chỉ thị ADN có ưu điểm so với th ị hình thái sinh hóa? Ứng dụng thị ADN? 42 Đáp án: a Việc chọn lọc ưu lai phép lai di truy ền kinh ển đòi h ỏi nhiều thời gian công sức Ngày nay, thị phân t đ ược dùng để chọn lọc tính trạng mong muốn Sự khơng phân li độc lập c m ột tính trạng mong muốn với thị phân tử di truyền cho phép sử d ụng ch ỉ thị để sàng lọc cá thể có ưu lai Ưu điểm cách chọn tính trạng khơng thiết phải thể bên ngồi mà có th ể chọn lọc b Chỉ thị ADN thay đổi phân tử ADN chia thành nhiều loại dựa khác phương pháp kỹ thuật xác định s ự đa hình Các thị ADN sử dụng rộng rãi số lượng thị không h ạn chế Chỉ thị ADN hình thành từ loại đột biến ADN khác nh thay (đột biến điểm), xếp lại (thêm vào bớt nucleotide) sai sót chép đoạn DNA lặp lại liền kề Các ch ỉ th ị ADN thường nằm vùng không phiên mã * Ưu điểm: Khác với thị hình thái sinh hóa, th ị ADN không giới hạn số lượng, không ảnh hưởng yếu tố môi trường giai đoạn phát triển * Ứng dụng: Chỉ thị ADN sử dụng nhiều nghiên cứu quan hệ di truyền, phát sinh chủng loại phân loại phân t ử; l ập đ liên kết di truyền, nhận biết gen; chọn giống bao gồm đánh giá đa dạng di truyền, nhận biết giống, chọn lọc tính trạng kháng bệnh, chống chịu điều kiện bất lợi môi trường, suất phẩm chất giống Câu 11: 43 Ứng dụng liệu pháp gen điều trị ung th cách nào? Đáp án: Bằng kỹ thuật vi tiêm, người ta đưa th ẳng vào gi ữa kh ối u vector mang gen trị liệu tương ứng, để ức chế tiêu diệt tế bào ung th Trong liệu pháp gen điều trị ung thư người ta sử dụng nhiều loại vect liệu pháp khác retrovirus, adenovirus plasmid Liệu pháp gen ều trị ung thư cách tác động trực tiếp vào khối u, th ực theo nhiều phương thức khác nhau: - Ức chế phát triển khối u cách th ực liệu pháp ex vivo in vivo với viral vector mang gen liệu pháp nh p53, pRb - Kích hoạt tế bào chết theo chương trình cách: sử dụng gen liệu pháp BAX tăng cường gây kích hoạt chết theo chương trình, sử dụng gen BCL-2 để ngăn chặn phản ứng chống apoptosis (antiapoptosis) Trường hợp apoptosis tế bào co lại, tách khỏi tế bào xung quanh, gen ced hoạt hóa làm cho tế bào teo d ần chết - Thực liệu pháp thay gen nh ằm ph ục hồi protein b ị h ỏng, phục hồi khả miễn dịch tế bào - Sử dụng liệu pháp antisense để kìm hãm hoạt động oncogen, ức chế tác dụng sản phẩm oncogen - Hạn chế phát triển khối u vi tiêm protein tiền apoptosis protein BAX (sản phẩm gen BAX) interferon (TNF), kết hợp sử dụng xạ trị điều trị hóa chất - Sử dụng gen tự sát sản phẩm đ ể tiêm th ẳng vào kh ối u 44 - Biện pháp tác động trực tiếp vào tế bào ung th bao vây thành mạch (anti-angiogenic) Đây biện pháp chặn mối liên hệ m ặt dinh dưỡng tế bào ung thư, làm cho tế bào ung thư thiếu dinh d ưỡng chết MỘT SỐ CÂU HỎI THI HSG QG: Câu 1: Nêu giải thích đặc điểm thể truyền dùng để chuy ển gen từ tế bào nhân thực sang tế bào vi khuẩn nhằm mục đích nhân dòng gen (Đề thi HSG Quốc gia năm 2012) Câu 2: Trong công nghệ tạo động vật chuyển gen, gen chuy ển đ ược g ắn vào vị trí (locut) NST tế bào động vật Bằng cách có th ể t ạo động vật đồng hợp gen chuyển? (Đề thi HSG Quốc gia năm 2015) Câu 3: Dựa sở khoa học mà người ta tiến hành lai phân t ử? Nêu giải thích ứng dụng thực tiễn lai phân tử (Đề thi chọn HSG Quốc gia năm 2011) PHẦN KẾT LUẬN Những vấn đề quan trọng đề tài - Đề tài đề cập đến nhóm ứng dụng quan tr ọng nh ất c Sinh h ọc phân tử - Với nhóm ứng dụng phân tích cụ th ể ứng dụng đâu? ứng dụng nào? ứng dụng cách nào? dựa sở nào? 45 Đồng thời, số nhóm ứng dụng, có phân tích, so sánh ưu – nhược điểm với ứng dụng khác lĩnh v ực nghiên cứu Trong đó, đề tài giới thiệu vấn đề h ướng nghiên cứu - Đề tài xây dựng số câu hỏi để củng c ố, ch ốt ki ến th ức c ần ti ếp cận học sinh; đồng thời có nêu câu hỏi thi học sinh gi ỏi Qu ốc gia năm gần kiến thức có liên quan đến nội dung đề tài giúp học sinh có hướng nghiên cứu học cách phù hợp Đề xuất, kiến nghị Nội dung trình bày đề tài tổng h ợp ch ỉ s ự nghiên cứu, tìm hiểu đúc rút kinh nghiệm giảng dạy cá nhân người viết góp ý số đồng nghiệp; nhiều mang tính chủ quan chưa thật hồn thiện Kính mong góp ý q th ầy đ ể n ội dung đề tài đầy đủ hồn thiện Xin trân trọng cảm ơn! TĨM TẮT CÁC ĐỀ MỤC PHẦN MỞ ĐẦU PHẦN NỘI DUNG I LAI PHÂN TỬ Lai phân tử gì? 46 Các phương pháp lai phân tử ứng dụng 2.1 Phương pháp Southern blot 2.2 Phương pháp Northern blot 2.3 Lai chỗ II PCR PCR gì? Quy trình PCR Tối ưu hố PCR Những ứng dụng PCR 4.1 Vân tay di truyền (Finger print) 4.2 Kiểm tra huyết thống 4.3 Chẩn đoán bệnh di truyền 4.4 Tách dòng gene 4.5 Gây đột biến định hướng 4.6 Phân tích mẫu ADN cổ III SẢN XUẤT VACXIN TÁI TỔ HỢP Nhận dạng tạo dòng kháng ngun có tiềm vacxin Sản xuất vacxin IV SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC Sản xuất kháng sinh Sản xuất hoocmon 2.1 Hormone sinh trưởng người (human growth hormone-HGH) 2.2 Somatostatin 47 Sản xuất kháng thể đơn dòng 3.1 Sản xuất kháng thể đơn dòng cơng nghệ ADN tái t ổ h ợp bi ểu Phage 3.2 Kháng thể đơn dòng nghiên cứu Sinh-Y 3.3 Kháng thể đơn dòng chẩn đốn điều trị bệnh Sản xuất insulin Sản xuất interferon Sản xuất interleukin V LIỆU PHÁP GEN Các loại liệu pháp gen 1.1 Liệu pháp soma 1.2 Liệu pháp gen tế bào mầm Các ứng dụng liệu pháp gen chữa bệnh 2.1 Bệnh thiếu hụt miễn dịch phối hợp trầm trọng (severe combined immuno deficiency-SCID) 2.1.1 Liệu pháp gen chữa bệnh ADA-SCID 2.1.2 Liệu pháp gen chữa bệnh X-SCID 2.2 Bệnh ung thư 2.3 Bệnh thiếu máu hồng cầu liềm 2.3.1 Vector liệu pháp sử dụng điều trị bệnh SCA 2.3.2 Các bước điều trị bệnh SCA liệu pháp gen 48 2.4 Bệnh xơ nang 2.5 Hội chứng AIDS VI CHUYỂN GEN TẠO CÁC ĐỘNG, THỰC VẬT CÓ NĂNG SUẤT, CH ẤT LƯỢNG CAO VII CHỌN LỌC ƯU THẾ LAI 49 ... với kiến thức di truy ền phân t nói riêng di truyền học nói chung Với lý đó, tơi viết chuyên đề: “ Một số ứng dụng Sinh học phân tử” nhằm hướng học sinh tiếp cận ứng dụng quan trọng nghiên cứu,... ĐẦU Lý chọn đề tài Hiện nay, di truyền học đã, tiếp tục đ ược nghiên c ứu ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khoa học thực tiễn Trong ứng dụng di truyền học, theo tôi, ứng dụng Sinh học phân t r ất... tục nghiên cứu sở ứng dụng hiểu biết Sinh học phân tử Mục đích đề tài Đề tài đề cập đến ứng dụng quan trọng đã, ti ếp t ục nghiên cứu di truyền học phân tử Vì vậy, tơi viết đề tài trước hết để