BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TRONG CAO CHIẾT LÁ ĐẮNG (VEMONIA AMYGDALINA DEL) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn :Th.S NGUYỄN THỊ THU HƢƠNG Sinh viên thực : TỪ CÔNG TÍNH MSSV: 1311100768 Lớp: 13DSH05 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án nghiên cứu riêng đƣợc thực sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dƣới hƣớng dẫn ThS Nguyễn Thị Thu Hƣơng Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan TP Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên Từ Cơng Tính Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh, q thầy giảng dạy Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trƣờng tất thầy cô truyền dạy kiến thức quý báu cho em suốt năm học vừa qua Qua em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Nguyễn Thị Thu Hƣơng, ngƣời định hƣớng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp Bên cạnh em xin cảm ơn thầy Phòng Thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trƣờng anh chị, bạn bè nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình ln bên cạnh, động viên lúc khó khăn, nản lòng suốt thời gian học tập, nghiên cứu nhƣ sống Tp Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên Từ Cơng Tính Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu đắng 1.1.1 Nguồn gốc Cây đắng thuộc họ Cúc (Asteraceae) họ lớn phổ biến rộng rãi nay, bao gồm 1000 chi 20,000 loài, phân bố khắp nƣớc giới Cây đắng sống đƣợc nhiều mơi trƣờng khác Ở nƣớc ta, có 125 chi 350 loài, phân bố rộng rãi từ vùng ven biển đến vùng núi cao tới 3000 m so với mặt biển [1] 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Đặc điểm phân bố 1.1.4 Tính chất dược lý đắng 1.2 Tổng quan hợp chất thứ cấp có khả kháng khuẩn thực vật 1.2.1 Alkaloid 1.2.2 Flavonoid 1.2.3 Steroid 12 1.2.4 Tanin 13 1.3 Các phƣơng pháp tách chiết hợp chất từ thực vật 16 1.3.1 Định nghĩa tách chiết hợp chất hợp chất từ thực vật 16 1.3.2 Các phương pháp tách chiết cao từ thực vật 17 1.3.3 Phương pháp tách chiết cao số chất từ thực vật 24 1.4 Cơ sở khoa học kháng khuẩn hợp chất thứ cấp có thực vật 26 1.4.1 Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn 26 1.4.2 Cơ chế kháng khuẩn số hợp chất thực vật 26 1.4.3 Tình hình nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn thực vật giới Việt Nam 28 1.4.4 Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibitory concentration - MIC) cao chiết thực vật 29 i Đồ án tốt nghiệp 1.5 Các nhóm vi khuẩn gây hại phổ biến ngƣời 30 1.5.1 Nhóm Escherichia coli 30 1.5.2 Nhóm Samonella 32 1.5.3 Bacillus sppp 34 1.5.4 Staphylococcus arueus 35 1.5.5 Nhóm Listeria spp 36 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 38 2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 38 2.1.2 Thời gian nghiên cứu 38 2.2 Vật liệu nghiên cứu 38 2.2.1 Nguồn mẫu 38 2.2.2 Vi sinh vật thị 38 2.2.3 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 39 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 40 2.3.1 Phương pháp xử lí nguồn mẫu 40 2.3.2 Phương pháp bảo quản giữ giống vi sinh vật 40 2.3.3 Phương pháp pha loãng mẫu 40 2.3.4 Phương pháp tăng sinh vi sinh vật thị 41 2.3.5 Phương pháp tách chiết thu nhận cao thực vật 41 2.3.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn từ cao chiết thực vật 42 2.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 42 2.3.8 Phƣơng pháp xử lí số liệu 43 2.4 Bố trí thí nghiệm 43 2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi cao từ đắng 45 2.4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng dung mơi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn cao chiết từ đắng 46 2.4.3 Thí nghiệm 3: xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 47 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 3.1 Kết hiệu suất thu hồi cao chiết dung môi khác từ đắng 49 ii Đồ án tốt nghiệp 3.2 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết từ đắng 50 3.2.1 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết nhóm E coli 50 3.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết dung môi khác Bacillus Cereus 52 3.2.3 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết loại dung mơi nhóm Salmonella 54 3.2.4 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết dung môi S Aureus 56 3.2.5 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết dung mơi khác nhóm Listeria monocytogenes 58 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61 Kết luận 61 Kiến nghị 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC A Kết thu hồi cao chiết từ đắng PHỤ LỤC B 1.1 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết nhóm E Coli2 1.2 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết dung môi khác Bacillus Cereus 1.3 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết loại dung mơi nhóm Salmonella 1.4 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết dung môi S Aureus 1.5 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết dung môi khác nhóm Listeria monocytogenes PHỤ LỤC C Kết xử lý số liệu đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nhóm vi khuẩn 1.1 Kết xử lý số liệu S.Aurius 1.2 Kết xử lý số liệu B Cereus 1.3 Kết xử lý số liệu Samonella 1.4 Kết xử lý số liệu E Coli 10 iii Đồ án tốt nghiệp 1.5 Kết xử lý số liệu Listeria monocytogenes 11 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT - NB: Nutrient Broth - NA: Nutrient Agar - EMB: Eosin Methylene Blue Agar - XLD: Xylose Lysine Desoxycholate Agar - DMSO: dimethylsulfoxid v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết khảo sát hoạt tính kháng E.coli cao chiết dung môi 50 Bảng 3.2 Kết khảo sát hoạt tính kháng Bacillus cereus cao chiết dung môi 52 Bảng 3.3 Kết khảo sát hoạt tính kháng Salmonella cao chiết dung mơi 54 Bảng 3.4 Kết khảo sát hoạt tính kháng S.aureus cao chiết dung môi 56 Bảng 3.5 Kết khảo sát hoạt tính kháng Listeria monocytogenes cao chiết dung môi 58 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây đắng Hình 1.2 Công thức phân tử Enpherine Hình 1.3 Một số Eucoflavonoid 10 Hình 1.4 Cấu tạo Isoflavon rotenoid 10 Hình 1.5 Cấu tạo Calophyllolid 11 Hình 1.7 Cấu tạo Steroid 12 Hình 1.8 Cấu tạo Tanin 13 Hình 1.9 Cấu tạo Acid digallic Acid trigallic 14 Hình 1.10 Cấu tạo penta-O-galloyl-glucose 15 Hình 1.11 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt 18 Hình 1.12 Bộ chiết Soxhlet 20 Hình 1.13 Máy chiết Kumagawa 21 Hình 1.14 Bộ lôi nƣớc 21 Hình 1.15 Sơ đồ hệ thống chiết siêu tới hạn 23 Hình 1.16 Cột chiết pha rắn 24 Hình 1.17 Cơ chế kháng khuẩn 28 Hình 1.18 Hình vi khuẩn Escherichia coli 31 Hình 1.19 Hình vi khuẩn Salmonella 33 Hình 1.19 Hình vi khuẩn Bacullus spp 34 Hình 1.20 Hình vi khuẩn Staphylococcus arueus 35 Hình 1.21 Hình vi khuẩn Listeria monocytogenes 36 Hình 2.1 Hình ảnh Lá đắng 38 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 44 Hình 2.4 Mẫu ngâm dung mơi 45 Hình 2.4 Sơ đồ đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết 46 Hình 2.6 Sơ đồ xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 47 Hình 3.1 Hiệu suất thu hồi cao chiết dung môi khác từ Lá đắng 49 Hình 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết nhóm E.coli 51 vii Đồ án tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận - Tách chiết thu hồi đƣợc cao chiết nƣớc, ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 90% từ đắng Trong cao chiết ethanol 70% cho hiệu suất cao lớn (12,3 ± 1,1) - Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết loại dung môi khác từ đắng vi sinh vật thị cho thấy cao chiết ethanol 70% thể hoạt tính kháng khuẩn mạnh - Từ kết xác định số MIC nhận thấy giá trị MIC cao chiết ethanol 70% có giá trị dao động từ 50 – 100 mg/ml Kiến nghị - Xác định số nồng độ ức chế tối thiểu cao chiết ethanol 70% nồng độ chia nhỏ - Thử nghiệm độc lực cao chiết ethanol 70% mơ hình chuột - Thử nghiệm khả ức chế với chủng vi khuẩn cao chiết ethanol 70% mơ hình chuột - Sản xuất trà Lá Đắng dƣới dạng túi lọc 61 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [ Hoàng Thị Sáu, Phân loại học thực vật.: NXB giáo dục Việt Nam, 2012 [ R.H.F Manske, the alkaloid – chemistry and Physiology, volume XIV, 1] 2] Academic Press – New York – London, 1973 [ 3] NAM Cây Lá Đắng - Vernonia Amygdalina (2016, Apr.) Y DƢỢC VIỆT [Online] http://ydvn.net/contents/view/11998.cay-la-dang-vernonia- amygdalina.html [ Phan Đình Châu, sở kỹ thuật tổng hợp hóa dược, tài liệu giảng dạy 4] sau.: Đại học trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội., 1997 [ Ngô Văn Thụ ,., 1978 [ G P Moss., “Nomenclature of Steroids (Recommendations 1989)” 5] 6] Pure & Appl Chem.61 (10): 1783–1822., 1989 [ Nguyễn Thị Kim Ngân, "“Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid 7] hoạt tính chống oxy hóa sen nelumbo nucifera”," Trƣờng Đại học Công nghệ TP HCM, TP Hồ Chí Minh., Đồ án tốt nghiệp 2015 [ Nguyen Thi Huong, "Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bƣớc đầu xác 8] định thành phần hóa học số cao chiết từ Eupatorium sp," Trƣờng Đại học Cơng Nghệ Tp.HCM, Hồ Chí Minh, Đồ án tốt nghiệp 2015 [ Tiểu luận môn học hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học (2015, 9] May) 123doc [Online] http://123doc.org/document/2699012-nhom-hop-chatflavonoid-tong-quan- hoat-tinh-sinh-hoc-cac-phuong-phap-chiet-suat-va-ung- dung.htm?page=7 [ Đại cƣơng chiết pha rắn ứng dụng chiết pha rắn (2013, Aug.) tai 10] lieu com [Online] http://tai-lieu.com/tai-lieu/dai-cuong-chiet-pha-ran-va-ung- 62 Đồ án tốt nghiệp dung-cua-chiet-pha- ran-566/ [ Giới thiệu số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật- Dƣơng Văn Hợp, 11] Nguyễn Lân Dũng (2007, Mar.) vietsciences [Online] http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/kythuatbaoquanvisinhvat.ht m [ Phạm Minh Nhựt, Thực hành vi sinh đại cương.: Trƣờng Đại học Công 12] Nghệ Tp HCM, 2013 [ Lê Ngọc Thuỳ Trang, "Phân lập khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến khả 13] sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn Lactobacillus plantarum," Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp.HCM , Khố luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Cơng nghệ Sinh học 2013 [ Nguyễn Thƣợng Đông Đặng Quang Chung, Kỹ thuật chiết xuất dược 14] liệu.: NXB Khoa học kỹ thuật, 2008 Tiểu luận môn học hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học 123doc [Trực tuyến] 2015 flavonoid-tong-quan- http://123doc.org/document/2699012-nhom-hop-chathoat-tinh-sinh-hoc-cac-phuong-phap-chiet-suat-va-ung- dung.htm?page=7 10 Đại cƣơng chiết pha rắn ứng dụng chiết pha rắn tai lieu com [Trực tuyến] 2013 http://tai-lieu.com/tai-lieu/dai-cuong-chiet-pha-ran-va-ungdung-cua-chiet-pha- ran-566/ Tài liệu nước R.H.F Manske the alkaloid – chemistry and Physiology, volume XIV, Academic Press – New York – London : s.n., 1973 G P Moss “Nomenclature of Steroids (Recommendations 1989)” Pure & Appl Chem.61 (10): 1783–1822 1989 63 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A Kết thu hồi cao chiết từ đắng Dung môi Hiệu suất ( % ) Nước 18 Ethanol 50 % 22 Ethanol 70 % 25 Ethanol 90 % 19 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết dung mơi khác nhóm vi khuẩn 1.1 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết nhóm E Coli Dung mơi Lần Lần Lần Mean lặp lại lặp lại lặp lại Nƣớc 12 10 10.3 ETHANOL 50% 12 13 10 11.6 ETHANOL 70% 14 11 12 12.3 ETHANOL 90% 10 12 11 11 KHÁNG SINH 32 34 35 33.6 Hình Đƣờng kính vòng ức chế vi khuẩn E.coli cao chiết đắng từ dung môi khác Đồ án tốt nghiệp 1.2 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết dung mơi khác Bacillus Cereus Dung môi Lần Lần Lần lặp lại lặp lại lặp lại Mean Nƣớc 10 11 10 ETHANOL 50% 11 13 10 11.3 ETHANOL 70% 13 11 11 11.6 RTHANOL 90% 13 12 11 12 DOI CHUNG 24 28 23 25 Hình Đƣờng kính vòng ức chế vi khuẩn B Cereus cao chiết đắng từ dung môi khác Đồ án tốt nghiệp 1.3 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết loại dung mơi nhóm Salmonella Dung mơi Lần Lần Lần Mean lặp lại lặp lại lặp lại Nƣớc 13 11 10 11.3 ETHANOL 50% 13 10 11 11.3 ETHANOL 70% 12 14 11 12.3 RTHANOL 90% 10 13 12 11.6 DOI CHUNG 29 25 22 25.3 Hình Đƣờng kính vòng ức chế vi khuẩn Samonella cao chiết đắng từ dung môi khác Đồ án tốt nghiệp 1.4 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết dung môi S Aureus Dung môi Lần Lần Lần lặp lại lặp lại lặp lại Mean Nƣớc 10 10 9,7 ETHANOL 50% 12 10 11 11 ETHANOL 70% 11 12 11 11,3 ETHANOL 90% 10 11 10 11 KHÁNG SINH 32 31 29 30.6 Hình Đƣờng kính vòng ức chế vi khuẩn S Aureus cao chiết đắng từ dung môi khác Đồ án tốt nghiệp 1.5 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết dung mơi khác nhóm Listeria monocytogenes Dung môi Lần Lần Lần lặp lại lặp lại lặp lại Mean Nƣớc 10 11 10 ETHANOL 50% 10 14 11 11.7 ETHANOL 70% 11 14 12 12.3 ETHANOL 90% 12 12 10 11.3 KHÁNG SINH 31 29 32 30.6 Hình Đƣờng kính vòng ức chế vi khuẩn L monocytogenes cao chiết đắng từ dung môi khác Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C Kết xử lý số liệu đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nhóm vi khuẩn 1.1 Kết xử lý số liệu S.Aurius Đồ án tốt nghiệp 1.2 Kết xử lý số liệu B Cereus Đồ án tốt nghiệp 1.3 Kết xử lý số liệu Samonella Đồ án tốt nghiệp 1.4 Kết xử lý số liệu E Coli 10 Đồ án tốt nghiệp 1.5 Kết xử lý số liệu Listeria monocytogenes 11 Đồ án tốt nghiệp ... nhận dịch chiết lá đắng kỹ thuật chiết ngâm dầm ethanol 50%, 70%, 90% nƣớc - Đánh giá hiệu suất thu hồi cao từ lá đắng - Khảo sát khả kháng khuẩn cao chiết từ lá đắng chủng vi khuẩn - Khảo sát nồng... nhận dịch chiết lá đắng kỹ thuật chiết ngâm dầm ethanol 50%, 70%, 90% nƣớc - Đánh giá hiệu suất thu hồi cao từ lá đắng - Khảo sát khả kháng khuẩn cao chiết từ lá đắng chủng vi khuẩn - Khảo sát nồng... 3.1 Kết khảo sát hoạt tính kháng E.coli cao chiết dung môi 50 Bảng 3.2 Kết khảo sát hoạt tính kháng Bacillus cereus cao chiết dung môi 52 Bảng 3.3 Kết khảo sát hoạt tính kháng Salmonella