Đang tải... (xem toàn văn)
DREB3 thuộc về họ gen DREB (dehydration-responsive element binding), họ tác nhân điều hòa phiên mã có vai trò quan trọng ở thực vật. Trong công trình này, nhờ sử dụng các phương pháp nghiên cứu in silico, chúng tôi đã xác định được gen DREB3 của cây quýt. CclDREB3 khá giống với các DREB thuộc phân nhóm A3 của các loài thực vật khác.
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG XÁC ĐỊNH GEN DREB3 CỦA CÂY QUÝT (Citrus clementina) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN SILICO Cao Phi Bằng, Bùi Thị Hải Yến, Nguyễn Thị Ánh Trường Đại học Hùng Vương TÓM TẮT DREB3 thuộc họ gen DREB (dehydration-responsive element binding), họ tác nhân điều hòa phiên mã có vai trò quan trọng thực vật Trong cơng trình này, nhờ sử dụng phương pháp nghiên cứu in silico, xác định gen DREB3 quýt CclDREB3 giống với DREB thuộc phân nhóm A3 lồi thực vật khác Gen có độ dài 1050 pb, mã hóa cho phân tử protein có kích thước 349 amino acid Protein CclDREB3 có tính kiềm yếu với giá trị pI 7,10 Mơ hình cấu trúc 3D cho thấy vùng bảo thủ AP2 CclDREB3 có cấu trúc bậc hai gồm xoắn α ba chuỗi β chạy song song ngược chiều Từ khóa: qt, DREB3, đặc điểm hóa - lí, in silico, mơ hình 3D, xác định gen MỞ ĐẦU Cây quýt (Citrus clementina) thuộc họ Cam (Rutaceae), họ ăn quan trọng giới Quả họ Cam có giá trị dinh dưỡng cao giàu vitamin Diện tích trồng thuộc họ ước đạt 8.785.549 toàn giới, sản lượng ước đạt khoảng 131 triệu (FAOSTAT 2012) Ở Việt Nam, sản lượng hàng năm thuộc họ Cam, quýt đạt 700 nghìn (Thống kê Việt Nam 2012) Do có giá trị cao kinh tế dinh dưỡng, quýt lựa chọn để giải trình tự hệ gen DREB nhóm A3 Arabidopsis, biết đến qua tên gọi ABI4 (protein không mẫn cảm với ABA-4, ABI4) thuộc họ tác nhân điều hòa phiên mã DREB Các protein thuộc họ có chứa vùng gắn ADN tên AP2 (Apetala 2), vùng có khả tương tác đặc hiệu với yếu tố DRE (yếu tố trả lời nước) có trình tự A/GCCGAC vùng khởi động gen thực thi Qua hoạt hóa gen thực thi Nhiều cơng trình nghiên cứu ABI4 tác nhân tham gia vào khả chịu khô hạn ánh sáng cường độ mạnh thực vật ABI4 cảm ứng tác nhân hữu sinh vô sinh Đến lượt ABI4 kiểm sốt biểu gen liên quan tới trả lời với tín hiệu đường, nảy mầm hạt giống Trong nghiên cứu này, chúng tơi hướng tới xác định trình tự gen DREB3 quýt Các đặc trưng vật lý hóa học protein, kết phân tích cấu trúc phả hệ giới thiệu cơng trình PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Cơ sở liệu Trình tự hệ gen quýt lấy từ Wu nnk Trình tự DREB3 Arabidopsis (AtAIB) lấy từ Sakuma nnk 2.2 Xác định gen DREB3 quýt Protein DREB3 Arabidopsis dùng làm khn dò, chương trình TBLASTN 90 KHCN (31) - 2014 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG sử dụng để tìm kiếm gen tương đồng liệu hệ gen quýt với giá trị e-value mức e-5 2.3 Xác định motif bảo thủ Các protein DREB3 Arabidopsis, nho, dương, lúa quýt dãy cách sử dụng phần mềm MEME 2.4 Tạo phả hệ Các trình tự protein DREB3 DREB2 Arabidopsis, nho, dương, lúa DREB3 quýt dãy cách dùng phần mềm MAFFT [4] Cây phả hệ xây dựng từ trình tự protein dãy nhờ phần mềm MEGA5 nhờ sử dụng phương pháp Maximum Likelihood tuân theo tham biến: mẫu Jones-Taylor-Thornton (JTT), liệu xử lý tất vị trí phương pháp Bootstrap với 1.000 lần lặp lại 2.5 Các đặc điểm hóa - lý cấu trúc không gian Các đặc điểm vật lí, hóa học protein nghiên cứu khảo sát nhờ phần mềm ExPASy Cấu trúc không gian phân tử protein xây dựng nhờ sử dụng phần mềm Phyre2 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định gen DREB3 quýt Bảng DREB3 quýt đặc điểm Tên CclDREB3 Locus Ciclev10033578m Kích thước Kích thước Khối lượng gen (pb) protein (aa) phân tử (kDa) 1050 349 37,51 Số lượng Intron pI 7,10 Chương trình TBLASTN sử dụng để tìm gen tương đồng tồn hệ gen qt với khn dò protein AtAIB Arabidopsis (AT2G40220) Bước đầu xác định gen mã hóa cho DREB thuộc nhóm A3 (DREB3) quýt (bảng 1) Kết phân tích motif bảo thủ phần mềm MEME cho thấy, protein suy diễn gen có chứa vùng AP2 (hình 1a) đặc trưng cho protein họ DREB Bên cạnh đó, motif KGGPxN (hình 1b) đặc trưng cho DREB thuộc nhóm A2 A3 có mặt protein DREB3 Trong vùng AP2, amino acid K26 đứng trước motif WLG đặc trưng cho DREB3 Tương tự, amino acid R1 tìm thấy đứng phía trước motif KGGPxN Hình 1: Trình tự vùng bảo thủ AP2 motif KGGPxN xây dựng từ gen DREB3 Arabidopsis, lúa, táo, nho qt Protein dùng làm khn để tìm protein tương đồng lồi khác (orthologs) có sở liệu NCBI, kết trình bày bảng Protein suy diễn có độ tương đồng cao với DREB thuộc nhóm A3 nhiều loài thực vật khác, mức độ tương đồng đạt 75% Phép kiểm tra cho phép khẳng định gen tìm DREB3 KHCN (31) - 2014 91 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG Bảng Các protein tương đồng khác loài gần với DREB3 quýt có sở liệu NCBI Miêu tả NCBI PREDICTED: ethylene-responsive transcription factor ABI4-like [Setaria italica] hypothetical protein SORBIDRAFT_09g016550 [Sorghum bicolor] abscisic acid insensitive 4-1 [Genlisea aurea] Os05g0351200 [Oryza sativa Japonica Group] hypothetical protein OsI_19581 [Oryza sativa Indica Group] hypothetical protein [Oryza sativa Japonica Group] PREDICTED: ethylene-responsive transcription factor ABI4 [Zea mays] PREDICTED: dehydration-responsive element-binding protein 2F-like [Glycine max] PREDICTED: dehydration-responsive element-binding protein 2F-like isoform X2 [Glycine max] PREDICTED: dehydration-responsive element-binding protein 2F-like isoform X1 [Glycine max] Chỉ Chỉ số cực số đại tổng Mức Mức độ Giá trị độ so tương E-value sánh đồng Ký hiệu Genbank 112 112 18% 2E-26 89% XP_004963859.1 111 111 18% 2E-26 89% XP_002440922.1 120 120 20% 2E-29 88% EPS59065.1 113 113 20% 9E-27 84% NP_001174376.1 113 113 20% 9E-27 84% EAY97659.1 113 113 20% 1E-26 84% AAV44075.1 112 112 22% 8E-27 75% XP_008649551.1 113 113 19% 2E-26 75% XP_003535164.2 110 110 19% 3E-26 75% XP_006575245.1 112 112 19% 3E-26 75% XP_003518110.1 3.2 Đặc điểm DREB3 quýt Gen DREB3 quýt gen mã hóa liên tục, với chiều dài 1050 pb Protein suy diễn có kích thước 349 amino acid, tương ứng với khối lượng 37,51 kDa Protein DREB3 qt có tính kiềm yếu, với giá trị pI 7,10 (bảng 1) Những đặc điểm giống với đặc điểm nhiều thành viên thuộc họ DREB loài thực vật khác 3.3 Cấu trúc không gian vùng bảo thủ AP2 DREB3 quýt Cấu trúc không gian vùng bảo thủ AP2 CclDREB3 xây dựng nhờ chương trình Phyre2 (hình 2) Kết vùng có ba chuỗi b xoắn a Cấu trúc xoắn giống với cấu trúc vùng AP2 nhiều protein khác họ DREB, đảm bảo cho DREB có khả tương tác với yếu tố cis Hình 2: Mơ hình 3D cấu trúc bậc hai vùng AP2 CclDREB3 promoter gen đích 92 KHCN (31) - 2014 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG 3.4 Phân tích phả hệ Cây phả hệ thiết lập từ protein DREB2 DREB3 Arabidopsis, lúa, dương, nho DREB3 quýt Phù hợp với kết phân tích motif bảo thủ xếp loại, DREB3 quýt nằm nhánh với DREB3 thực vật khác KẾT LUẬN Trong cơng trình xác định gen DREB3 quýt hệ gen loài Gen mã hóa DREB3 mã hóa liên tục, có chiều dài 1050 pb Protein suy diễn có chiều dài 349 amino acid Protein có độ tương đồng cao với DREB thuộc phân nhóm A3 thực vật khác Hơn nữa, protein có mang vùng bảo thủ AP2 motif KGGPxN nhiều amino acid đặc trưng cho DREB thuộc phân nhóm A3 Riêng vùng AP2 có cấu trúc bậc hai gồm chuỗi b xoắn a Kết bước đầu có ý nghĩa quan trọng, mở đường cho việc nghiên cứu chức DREB3 lồi Hình 3: Cây phả hệ xây dựng từ DREB2 DREB3 Lời cảm ơn Cơng trình hồn thành với hỗ trợ kinh phí từ chương trình nghiên cứu khoa học Trường Đại học Hùng Vương Tài liệu tham khảo Bailey TL, Williams N, Misleh C, Li WW 2006 MEME: discovering and analyzing DNA and protein sequence motifs Nucleic acids research 34:W369-W73 Foyer CH, Kerchev PI, Hancock RD 2012 The ABA-INSENSITIVE-4 (ABI4) transcription factor links redox, hormone and sugar signaling pathways Plant Signal Behav 7:276-81 Gasteiger E, Gattiker A, Hoogland C, Ivanyi I, Appel RD, Bairoch A 2003 ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis Nucleic Acids Res 31:3784-8 Katoh K, Standley DM 2013 MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability Mol Biol Evol 30:772-80 Kelley LA, Sternberg MJ 2009 Protein structure prediction on the Web: a case study using the Phyre server Nat Protoc 4:363-71 Liu Y, Heying E, Tanumihardjo SA 2012 History, Global Distribution, and Nutritional Importance of Citrus Fruits Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 11:530-45 Mizoi J, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K 2012 AP2/ERF family transcription factors is plant abiotic stress responses Biochem Biophys Acta 1819:86-96 Sakuma Y, Liu Q, Dubouzet JG, Abe H, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K 2002 DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of arabidopsis DREBs, transcription factors KHCN (31) - 2014 93 ... xếp loại, DREB3 quýt nằm nhánh với DREB3 thực vật khác KẾT LUẬN Trong công trình chúng tơi xác định gen DREB3 quýt hệ gen loài Gen mã hóa DREB3 mã hóa liên tục, có chiều dài 1050 pb Protein suy... XP_003518110.1 3.2 Đặc điểm DREB3 quýt Gen DREB3 quýt gen mã hóa liên tục, với chiều dài 1050 pb Protein suy diễn có kích thước 349 amino acid, tương ứng với khối lượng 37,51 kDa Protein DREB3 qt có tính... protein xây dựng nhờ sử dụng phần mềm Phyre2 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định gen DREB3 quýt Bảng DREB3 quýt đặc điểm Tên CclDREB3 Locus Ciclev10033578m Kích thước Kích thước Khối lượng gen (pb)