BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Đoàn Thị Bắc NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10 CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội, 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Đồn Thị Bắc NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10 CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hướng dẫn 1: TS Lê Thị Nhi Công Hướng dẫn 2: TS Tạ Thu Hằng Hà Nội, 2020 i Lời cam đoan Tơi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Đoàn Thị Bắc ii Lời cảm ơn Với tất lòng, tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Thị Nhi Cơng, Trưởng phòng Cơng nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TS Tạ Thu Hằng, Trưởng phòng Cơng nghệ sinh học Nơng nghiệp, Viện Nghiên cứu Phát triển Vùng, người thầy dành cho ý tưởng quý báu, hướng dẫn tận tình, tạo điều kiện thuận lợi động viên suốt trình thực luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Liên anh chị Phòng Cơng nghệ sinh học Mơi trường, Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ nhiệt tình đóng góp ý kiến q báu tận tình dạy, tạo điều kiện giúp đỡ thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Học Viện Khoa học Công nghệ với Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu suốt thời gian thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu Phát triển Vùng tạo điều kiện cho có thời gian để học tập thời gian cơng tác Viện, nhận hỗ trợ nhiệt tình từ Phòng Cơng nghệ sinh học Nơng nghiệp nơi tơi cơng tác, giúp đỡ nhiệt tình động viên anh, chị, em đồng nghiệp, xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, người thân gia đình người bạn thân thiết ln bên cạnh, động viên khích lệ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tác giả Đoàn Thị Bắc iii Danh mục ký hiệu chữ viết tắt Chữ viết Tiếng anh Tiếng việt tắt, kí hiệu Bchl Bacteriochlorophyll CoQ Coenzyme Q CoQ10 Coenzyme Q with chain containing 10 isoprene subunits Coenzyme Q với chuỗi isoprene có chứa 10 tiểu đơn vị HPLC High-performance liquid chromatography Sắc kí lỏng hiệu cao OD Optical Density Mật độ quang TCL Thin layer chromatography Sắc kí lớp mỏng VKQH VKTQH Sắc tố diệp lục vi khuẩn Vi khuẩn quang hợp Vi khuẩn tía quang hợp iv Danh mục bảng Bảng 1.1 Hàm lượng Coenzyme Q10 (μg/g) số loại thực phẩm Bảng 3.1 Kết đánh giá hàm lượng Coenzyme Q10 chủng .28 Bảng 3.2 So sánh khả sử dụng số nguồn C chủng lựa chọn với Rhodopseudomonas palustris (Molish) van Niel BCRC16408 31 Bảng 3.3 Hàm lượng CoQ10 chủng VKTQH tích lũy môi trường nuôi cấy khác 42 v Danh mục hình vẽ, đồ thị Hình 1.1 Chuỗi vận chuyển điện tử Hình 1.2 Hình ảnh quang phổ vi khuẩn tía quang hợp 13 Hình 3.1 Khả sinh trưởng chủng vi khuẩn tía quan hợp môi trường DSMZ 27 sau hoạt hóa 27 Hình 3.2 Sắc ký mỏng thể có mặt Coenzyme Q10 28 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào chủng FO2 (A, B) chủng DQ4 (C, D) 30 Hình 3.4 Cây phát sinh chủng loại chủng FO2 DQ4 dựa vào so sánh trình tự gen 16S rRNA 32 Hình 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn .34 Hình 3.6 Ảnh hưởng pH ban đầu đến sinh trưởng chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn 35 Hình 3.7 Ảnh hưởng cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn 36 Hình 3.8 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh trưởng chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn .37 Hình 3.9 Ảnh hưởng NaCl đến sinh trưởng chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn .39 Hình 3.10 Phương pháp thu nhận CoQ10 từ chủng FO2 DQ4 40 vi MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 TỔNG QUAN VỀ COENZYME Q10 .3 1.1.1 Cấu tạo Coenzyme Q10 .3 1.1.2 Đặc tính Coenzyme Q10 1.1.2.1 Đặc tính lý hóa 1.1.2.2 Đặc tính sinh học thể sinh vật 1.1.3.1 Tổng hợp hóa học 1.1.3.2 Coenzyme từ động vật thực vật 1.1.3.3 Coenzyme Q10 từ vi sinh vật 1.1.4 Các nghiên cứu phương pháp tách chiết Coenzyme Q10 .8 1.1.5 Ứng dụng Coenzyme Q10 10 1.1.5.1 Ứng dụng y học 10 1.1.5.2 Trong mỹ phẩm .11 1.2 MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP VÀ ỨNG DỤNG TRONG VIỆC SẢN XUẤT COENZYME Q10 11 1.2.1 Giới thiệu chung vi khuẩn quang hợp 11 1.2.2 Giới thiệu chung vi khuẩn tía quang hợp 12 1.2.3 Ảnh hưởng nhân tố lý hóa đến sinh trưởng vi khuẩn tía quang hợp 13 1.2.4 Các nghiên cứu khả tích lũy Coenzyme Q10 vi khuẩn tía quang hợp 15 1.2.4.1 Nghiên cứu giới khả tích lũy Coenzyme Q10 vi khuẩn tía quang hợp .15 1.2.4.2 Nghiên cứu nước khả tích lũy Coenzyme Q10 vi khuẩn tía quang hợp .16 vii CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC 18 2.1.1 Nguyên vật liệu 18 2.1.2 Các thiết bị máy móc 18 2.1.3 Hóa chất 19 2.1.4 Thành phần môi trường nuôi cấy .19 2.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 20 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.3.1 Phương pháp ni cấy, hoạt hóa đánh giá sinh trưởng vi khuẩn tía quang hợp 20 2.3.2 Phương pháp xác định Coenzyme Q10 từ chủng vi khuẩn tía quang hợp 20 2.3.3 Phương pháp xác định đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn tía quang hợp 22 2.3.3.1 Phương pháp đánh giá sinh trưởng xác định đặc điểm hình thái 22 2.3.3.2.Phương pháp xác định khả sử dụng số nguồn carbon 22 2.3.3.3 Phương pháp phân tích gene mã hóa 16S rRNA 23 2.3.4 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn 23 2.3.5.Xây dựng phương pháp tách chiết Coenzyme Q10 từ chủng lựa chọn 25 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VKTQH CÓ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10 CAO 26 viii 3.1.1.Sàng lọc chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả tích lũy Coenzyme Q10 cao 26 3.1.1.1.Hoạt hóa đánh giá khả sinh trưởng chủng vi khuẩn tía quang hợp 26 3.1.1.2 Sàng lọc chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả tích lũy Coenzyme Q10 cao 27 3.1.2 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng lựa chọn.29 3.1.2.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào 29 3.1.2.2 Khả sử dụng nguồn carbon .31 3.1.2.3 Xác định trịnh tự gene 16S rRNA chủng lựa chọn 32 3.2 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP LỰA CHỌN .33 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn 33 3.2.2 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn .35 3.2.3 Ảnh hưởng cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn 36 3.2.4 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh trưởng chủng lựa chọn 37 3.2.5 Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl đến sinh trưởng chủng lựa chọn 38 3.3 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT COENZYME Q10 TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP LỰA CHỌN 39 CHƯƠNG 4.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 4.1 KẾT LUẬN 44 4.2 KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO .45 57 Bảng P6.Ảnh hưởng cường độ ánh sáng đến mức độ tích lũy sinh khối chủng VKTQH sau ngày nuôi cấy Đơn vị: ΔOD800 NaCl (%) DQ4 FO2 ΔOD800 ±SD ΔOD800 ±SD NH4Cl 2,02b 0,03 2,09b 0,03 Pepton 2,22a 0,03 2,30a 0,04 (NH4)2SO4 1,87b 0,03 1,96b 0,04 Co(NH2)2 1,50c 0,04 1,40c 0,05 NH4NO3 1,02d 0,03 1,40c 0,03 NaNO2 1,15d 0,02 1,05d 0,03 KNO3 0,80e 0,02 0,93de 0,04 Ca(NO3)2 0,81e 0,04 0,80e 0,04 LSD 0,05 0,18 0,20 Trong hàng, cơng thức có số mũ khác khác có ý nghĩa mức độ tin cậy 95% 58 PHỤ LỤC 2.MỘT SỐ HÌNH ẢNH KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM o 27-30 C o 38-40 C o 14-16 C Hình P1.Sinh trưởng chủng FO2 nhiệt độ khác sau ngày nuôi cấy o 27-30 C o 38-40 C o 14-16 C Hình P2.Sinh trưởng chủng DQ4 nhiệt độ khác sau ngày nuôi cấy 59 pH4 pH5 pH6 pH6,5 pH7 pH7,5 pH8 pH8,5 pH9 Hình P3.Sinh trưởng chủng FO2 điều kiện pH khác sau ngày nuôi cấy pH4 pH5 pH6 pH6,5 pH7 pH7,5 pH8 pH8,5 Hình P4.Sinh trưởng chủng DQ4 điều kiện pH khác sau ngày nuôi cấy pH9 60 0% 0,5% 1% 1,5% 2% 2,5% 3% 3,5% 4,5% Hình P5.Sinh trưởng chủng FO2 nồng độ muối khác sau ngày nuôi cấy 0% 0,5% 1% 1,5% 2% 2,5% 3% 3,5% 4,5% Hình P6.Sinh trưởng chủng DQ4 nồng độ muối khác sau ngày nuôi cấy 5000 lux 4000 lux 3000 lux 2000 lux 1000 lux lux Hình P7.Sinh trưởng chủng FO2 cường độ ánh sáng khác sau ngày nuôi cấy 61 5000 lux 4000 lux 3000 lux 2000 lux 1000 lux lux Hình P8.Sinh trưởng chủng DQ4 cường độ ánh sáng khác sau ngày nuôi cấy FO2-5 ngày NH4Cl pepton (NH4)2SO4 Urea NH4NO3 NaNO3 KNO3 Ca(NO3)2 Hình P9.Sinh trưởng chủng FO2 nguồn nito khác sau ngày nuôi cấy DQ4-5 ngày NH4Cl pepton (NH4)2SO4 Urea NH 4NO3 NaNO3 KNO3 Ca(NO3)2 Hình P10.Sinh trưởng chủng DQ4 nguồn nito khác sau ngày nuôi cấy 62 63 ... trưởng vi khuẩn tía quang hợp 13 1.2.4 Các nghiên cứu khả tích lũy Coenzyme Q10 vi khuẩn tía quang hợp 15 1.2.4.1 Nghiên cứu giới khả tích lũy Coenzyme Q10 vi khuẩn tía quang hợp. .. khả tích lũy CoQ10 VKTQH chưa công bố nhiều Vi t Nam Vì vậy, chúng tơi thực đề tài: Nghiên cứu khả tích lũy Coenzyme Q10 số chủng vi khuẩn tía quang hợp phân lập Vi t Nam *Mục tiêu nghiên cứu: ... TẠO VI N HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI T NAM HỌC VI N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Đoàn Thị Bắc NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10 CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP PHÂN