ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Mai Lƣơng NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỊU AXIT VÀ HẤP THỤ NHÔM CỦA VI SINH VẬT ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ ĐẤT TRỒNG CHÈ VÙNG TÂN CƢƠNG, THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Mai Lƣơng NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỊU AXIT VÀ HẤP THỤ NHÔM CỦA VI SINH VẬT ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ ĐẤT TRỒNG CHÈ VÙNG TÂN CƢƠNG, THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Khoa học môi trường Mã số: 8440301.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Ngô Thị Tường Châu Hà Nội – 2018 LỜI CẢM ƠN Để có kết nghiên cứu này, ngồi nỗ lực thân, tơi nhận nhiều quan tâm, động viên, giúp đỡ tập thể, cá nhân ngồi trường Trước tiên, tơi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Ngô Thị Tường Châu – người trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo, động viên ln dõi theo sát q trình thực đề tài Tiếp theo, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy, cô, cán khoa Môi trường, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội nói chung thầy, mơn Tài ngun Mơi trường đất nói riêng tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực đề tài, truyền đạt cho kiến thức, kinh nghiệm q báu, lời khun bổ ích Tơi xin chân thành cảm ơn thầy, cơ, cán Phòng thí nghiệm Phân tích mơi trường thầy, cơ, anh/chị/bạn làm việc Phòng thí nghiệm Thổ nhưỡng Mơi trường Đất ln nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới cô bác nông dân hợp tác xã (HTX) chè Soi Vàng HTX chè Hồng Thái, xã Tân Cương, thành phố Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên tận tình giúp đỡ tơi địa phương làm việc Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến gia đình bạn bè người bên động viên giúp đỡ tơi gặp khó khăn q trình làm luận văn Do thời gian kinh nghiệm hạn chế nên luận văn khoa học tơi nhiều thiếu sót, kính mong nhận góp ý thầy cô giáo, anh/chị bạn bè để luận văn tơi hồn chỉnh Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 30 tháng 12 năm 2018 Học viên cao học Nguyễn Thị Mai Lương i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chè đất trồng chè 1.1.1 Tổng quan chè 1.1.2 Tổng quan đất trồng chè 1.2 Tổng quan khả hút thu nhôm chè .6 1.3 Tổng quan mối quan hệ nhôm số bệnh liên quan 1.4 Tổng quan khả chịu axit hấp thụ kim loại vi sinh vật 1.4.1 Ảnh hưởng axit đến hoạt động sống vi sinh vật 1.4.2 Ảnh hưởng nhôm kim loại nặng đến hoạt động vi sinh vật 10 1.4.3 Vi sinh vật kháng kim loại 11 1.4.4 Vi sinh vật kháng nhôm 13 1.4.5 Khả loại bỏ kim loại khỏi môi trường vi sinh vật 14 1.5 Tổng quan tình hình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật chịu axit hấp thụ nhôm nước……………………………………… …………… 16 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phương pháp thu thập tài liệu sơ cấp thứ cấp 19 2.2.2 Phương pháp thu mẫu xử lý mẫu 19 2.2.3 Phương pháp xác định số tính chất đất 20 2.2.4 Phương pháp phân lập chủng vi sinh vật chịu axit hấp thụ nhôm 21 2.2.5 Phương pháp tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả chịu axit hấp thụ nhôm cao từ chủng phân lập 22 ii 2.2.6 Phương pháp định danh chủng vi sinh vật chịu axit có khả hấp thụ nhơm cao tuyển chọn 23 2.2.7 Phương pháp nghiên cứu khả chịu axit chủng vi sinh vật tuyển chọn 25 2.2.8 Nghiên cứu khả hấp thụ nhôm chủng vi sinh vật tuyển chọn 25 2.2.9 Phương pháp sơ đánh giá khả ứng dụng hỗn hợp vi sinh vật nhằm hạn chế hàm lượng nhôm linh động đất trồng chè 26 2.2.10 Phương pháp xử lý số liệu 28 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Một số tính chất hàm lượng nhôm tổng số đất trồng chè vùng Tân Cương, Thái Nguyên 29 3.1.1 Một số tiêu lí, hóa học đất 29 3.1.2 Mật độ vi sinh vật tổng số đất 33 3.2 Kết phân lập chủng vi sinh vật chịu axit hấp thụ nhôm từ đất trồng chè vùng Tân Cương, Thái Nguyên 34 3.3 Kết tuyển chọn chủng vi sinh vật chịu axit hấp thụ nhôm phân lập từ đất trồng chè vùng Tân Cương, Thái Nguyên .37 3.4 Kết định danh chủng vi sinh vật có khả kháng nhơm cao tuyển chọn 38 3.4.1 Kết định danh chủng vi khuẩn B2 38 3.4.2 Kết định danh chủng vi khuẩn B4 40 3.4.3 Kết định danh chủng nấm mốc F8 41 3.4.4 Kết định danh chủng nấm mốc F13 42 3.4.5 Kết định danh chủng nấm mốc F17 44 3.5 Kết nghiên cứu khả chịu axit chủng vi sinh vật tuyển chọn 47 3.6 Khả sinh trưởng, phát triển hấp thụ nhôm chủng vi sinh vật tuyển chọn 49 iii 3.7 Kết sơ đánh giá khả ứng dụng hỗn hợp vi sinh vật nhằm hạn chế hàm lượng nhôm linh động đất trồng chè………………………………… 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 KẾT LUẬN 55 KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Bảng ký hiệu mẫu đất 19 Bảng 2.2 Thành phần môi trường nước thịt pepton 20 Bảng 2.3 Thành phần môi trường chủng vi sinh vật 22 Bảng 2.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR……………………………………… 24 Bảng 3.1 Một số tiêu lí, hóa học mẫu đất nghiên cứu 29 Bảng 3.2 Mật độ tế bào vi sinh vật tổng số đất 33 Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái chủng vi sinh vật phân lập 35 ảng 3.4 Hiệu suất hấp thụ nhôm chủng vi sinh vật nghiên cứu môi trường nuôi cấy chứa nồng độ nhôm khác (%) 52 ảng 3.5 Hàm lượng nhôm linh động mẫu đất nghiên cứu…………….53 v DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Hình thái tế bào (×100) chủng vi khuẩn B2 38 Hình 3.2 Trình tự gen 16S rRNA chủng vi khuẩn B2 38 Hình 3.3 Kết so sánh chi tiết trình tự tương đồng chủng tra cứu NCBI 39 Hình 3.4 Hình thái tế bào (×100) chủng B4 40 Hình 3.5 Trình tự gen 16S rRNA chủng vi khuẩn B4 40 Hình 3.6 Kết so sánh chi tiết trình tự tương đồng chủng B4 tra cứu NCBI 41 Hình 3.7 Hình thái khuẩn lạc đĩa thạch Sabouraud trình tự gen 28S rRNA chủng F8 .42 Hình 3.8 Kết so sánh chi tiết trình tự tương đồng chủng F8 tra cứu NCBI 42 Hình 3.9 Hình thái khuẩn lạc đĩa thạch Sabouraud chủng F13 43 Hình 3.10 Trình tự gen 28S rRNA chủng F13 43 Hình 3.11 Kết so sánh chi tiết trình tự tương đồng chủng F13 tra cứu NCBI 44 Hình 3.12 Hình thái khuẩn lạc đĩa thạch trình tự gen 28S rRNA chủng F17 .45 Hình 3.13 Kết so sánh chi tiết trình tự tương đồng chủng F17 tra cứu NCBI 46 Hình 3.14 Biểu diễn ảnh hưởng pH đến sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn B2 B4 46 Hình 3.15 Biểu diễn lượng sinh khối tạo thành chủng nấm mốc mơi trường có pH khác .49 Hình 3.16 Sinh khối chủng F8 trái ; F13 (giữa) F17 (phải) môi truờng Hansen pH 2,4 49 Hình 3.17 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng nồng độ nhôm môi trường đến sinh trưởng phát triển vi khuẩn B2 B4 50 Hình 3.18 Biểu đồ biểu diễn khả sinh trưởng phát triển chủng nấm mốc môi trường dịch thể có hàm lượng nhơm khác 51 vi DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Giải nghĩa Từ viết tắt EGCG Epigallocatechin – gallate (Chất chống oxy hóa) Food and Agriculture Organization of the United FAO Nations (Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc) HCBVTV Hóa chất bảo vệ thực vật Inductively Coupled Plasma – Optical Emission ICP – OES Spectroscopy (Kỹ thuật phân tích phổ phát xạ nguyên tử) HTX Hợp tác xã KLN Kim loại nặng MĐ Mẫu đất NCBI TCVN US EPA National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia) Tiêu chuẩn Việt Nam United States Environmental Protection Agency Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ) VSV Vi sinh vật WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) vii MỞ ĐẦU Chè xanh (Camellia sinensis) có nhiều vitamin có giá trị dinh dưỡng bảo vệ sức khỏe Có tác dụng giải khát, bổ dưỡng kích thích hệ thần kinh trung ương, giúp tiêu hóa chất mỡ, giảm bệnh béo phì, chống lão hóa… Do chè trở thành sản phẩm đồ uống thông dụng toàn giới Chè sử dụng hàng ngày hình thành nên tập quán tạo văn hóa Chè có giá trị sử dụng hàng hóa có giá trị kinh tế, sản xuất chè mang lại hiệu kinh tế cao góp phần cải thiện đời sống cho người lao động Hiện chè trở thành mặt hàng xuất có giá trị Việt Nam, sản phẩm tiếng chè Tân Cương, Thái Nguyên Tuy nhiên chè loại ua đạm, trình canh tác, luợng lớn phân đạm đặc biệt ammonium sulfate bón vào đất trồng chè nhằm tang hàm luợng amino axit chè, đồng thời tạo màu sắc hấp dẫn hương vị đậm đà sản phẩm chè Khi cay chè hấp thụ luợng lớn ammonium, sulfate t ch tụ đất Ngồi ra, ammonium bón vào đất trồng chè nhanh chóng bị chuyển đổi thành nitrate vi khuẩn nitrate hóa tự duỡng có khả chịu axit Hậu luợng đáng kể nitrate sulfate tích luỹ dần đất trồng chè, làm pH đất giảm xuống c n 4,0 hoạc thạm ch thấp hon, từ làm tăng hàm lượng nhơm linh động đất trồng chè Trong điều kiện này, chè cho hấp thụ lượng nhôm đáng kể, hàm lượng nhôm sản phẩm chè cao gây hại đến sức khoẻ (yếu thận cho người tiêu dùng Hơn nữa, hàm lượng nhôm thể người cao giả thuyết có mối liên kết với nhiều bệnh khác chứng tr não, xơ não, gãy xương bệnh Alzheimer Là thành phần quan trọng môi trường đất, vi sinh vật (VSV) đất chắn bị ảnh hưởng độc tính nhơm Tuy nhiên số VSV sống sót tốt đất axit làm giảm độc tính nhơm nhờ chế kháng hấp thụ kim loại Vì việc sử dụng hệ VSV có khả chịu axit, hấp thụ nhơm để cải thiện mơi trường đất có tiềm khơng thể phủ nhận việc phân lập Tiếng Anh: 10 Appanna VD (1989), “Exopolysaccharide synthesis in Rhizobium trifolii in the presence of manganese and aluminium”, Microbios Lett., 40, pp 31-36 11 Brunker RL and Bott TL (1974), “Reduction of mercury to the element state by a yeast”, Appl Microbiol., 27, pp 870 – 873 12 Carmelo Y, Santos II, and Sa-Correia I (1997), “Effect of extracellular acidification on the activity of plasma membrane ATPase and on the cytosolic and vacuolar pH of Saccharomyces cerevisiae”, Biochim Biophys Acta, 1325, pp 63-70 13 Fung KF and Wong MH (2004), “Application of different forms of calcium to tea soil to prevent aluminum accumulation”, J Sci Food Agric., 84, pp 1469 – 1477 14 Eleanora IR (2000), “Bacteria and Archaea in acidic environments and a key to morphological identification”, Hydrobiologia, 433, pp 61- 89 15 Gadd GM (1992), “Metals and microorganisms: a problem of definition”, FEMS Microbiol Lett., 100, pp 197 – 204 16 Gadd GM and Griffiths AJ (1978), “Microorganisms and Heavy metal Toxicity”, Microb Ecol., 4, pp 303 – 317 17 Ganrot PO (1986), “Metabolism and possible health effects of aluminum”, Environ Health Perspect, 85, pp 363 – 441 18 Genhe He, Xiaodong Wang, Genhong Liao, Shoucheng Huang, Jichun Wu 2016 , “Isolation, Identification and Characterization of Two Aluminum – Tolerant Fungi from Axitic Red Soil”, Indian J Microbiol, 56(3), pp 344 – 352 19 Hayatsu Masahito and Kosuge Nobuo (1993), “Autotrophic nitrification in axit tea soils”, Soil Sci Plant Nutr., 39, pp 209 – 217 20 Hue NV, Croddock GR, and Adams F (1986), “Effect of organic acids on Al toxicity in subsoils”, Soil Sci Soc Am J., 50, pp 28-34 21 H Wang, R.K Xu, N Wang, X.H Li (2010), “Soil acidification of Alfisols as influenced by tea cultivation in eastern China”, Pedosphere 20(6), pp 799- 806 22 Jian FM, Peter RR, and Emmanuel D (2001), “Aluminum tolerance in plants and the complexing role of organic acids” Trends Plant Sci., 6(6), pp 273-278 23 Joho M, Inouhe M, Tohoyama H, and Murayama T (1995), “Nickel resistance in yeast and other fungi”, J Ind Microbiol., 14, pp 164-168 24 Kanazawa S and Kunito T (1996), “Preparation of pH 3.0 agar plate, enumeration of axit-tolerant and Al-resistant microorganisms in axit soils”, Soil Sci Plant Nutr., 42, pp 165 – 173 25 Kanazawa S, Ngo Thi Tuong Chau, and Miyaki S (2005), “Identification and Characterization of yeasts with tolerance to high axitity and resistance to Aluminum isolated from tea soils”, Soil Sci Plant Nutr., 51 (4), pp 507 – 513 26 Kikuchi T (1965), “Studies on the pathway of sulphide production in a copperadapted yeast”, Plant Cell Physiol., 6, pp 195 – 210 27 Kochian LV (1995), “Cellular mechanisms of aluminium toxicity and resistance in plants”, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol., 46, pp 237-260 28 Komura I and Izaki K (1971), “Mechanism of mercuric chloride resistance in microorganisms I Vaporization of a mercury compound from mercuric chloride by multiple drug resistant strains of Escherichia coli”, J Biochem., 70, pp 885 – 893 29 Konishi S, Souta I, Takahashi J, Ohmoto M, and Kaneko S (1994), “Isolation and characteristics of axit and aluminum-tolerant bacterium”, Biosci Biotech Biochem., 58, pp 1960 – 1963 30 Lansing MP, John PH, and Donald AK (2001), “Microbiology”, 5th ed., International Edition ISBN 0-07-112259-1, pp.123-125 31 Macdonald T and Martin RB (1988), “Aluminum ion in biological system” Trends Biochem Sci., 13, pp 15-19 32 Mahboobeh Ghoochani, Sakine Shekoohiyan, Masoud Yunesian, Shahrokh Nazmara and Amir Hossein Mahvi 2015 , “Determination of aluminum and zinc in infusion tea cultivated in north of Iran”, Journal of Environmental Health Science & Engineering, 13 (49) 33 Matsumoto, H., Hiraseva, E., Morimura, S & Takahashi, E (1976), “Localization of aluminum in tea leaves” Plant Cell Physiol 17, pp 627-631 34 Mark RB, Sanjay K, and Frederick WO (2000), “Microbial Resistance to Metals in the Environment”, Ecotoxicol Environ Saf., 45, pp 198 – 207 35 Martin RB (1986), “The chemistry of aluminum as related to biology and medicine”, Clin Chem., 32, pp 1797 – 1806 36 May, H.M & Nordstrom, D.K 1991 , “Assessing the solubilities and reaction kinetics of aluminous minerals in soil”, in Soil Acidity (Urlich, B & Sumner, M.E., eds.), pp 125-148, Springer-Verlag, Berlin 37 Mehra RK and Winge DR (1991), “Metal ion resistance in fungi: molecular mechanisms and their related expression”, J Cell Biochem., 45, pp 30 – 40 38 Murata K, Fukuda Y, Shimosaka M, Wantanabe K, Saikusa T, and Kimura A (1985), “Phenotypic character of the methylglycoxal resistance gene in Saccharomyces cerevisae: expression in Escherichia coli and application to breeding wild-type yeast strains”, Appl Environ Microbiol., 50, pp 1200 – 1207 39 Nayak P (2002), “Aluminium: Impacts and disease”, Environ Res Sect A, 89, pp 101 – 115 40 Nguyen VAT, Senoo K, Mishima T, and Hisamatsu M (2001), “Multiple Tolerance of Rhodotorula ghtirtis R-1 to Acid, Aluminum Ion and Manganese Ion, and Its Unusual Ability of Neutralizing Acidic Medium”, J Biosci Bioeng., 92(4), pp 366-371 41 Ngo Thi Tuong Chau, Le Van Thien and Shinjiro Kanazawa (2014), “Identification and characterization of axitity-tolerant and aluminum – resistant bacterium isolate from tea soil”, African Journal of Biotechnology, 13(27), pp 2715 – 2726 42 Nies DH (1999), “Microbial heavy metal resistance”, Appl Microbiol Biotechnol., 57, pp 730 – 750 43 Nioh I, Osada M, Yamamura T, and Muramatsu K 1995: Acidophilic and Acidotolerant Actinomycetes in an Acid Tea Field Soil J Gen Appl Microbiol., 41(2), pp 175-180 44 Olivier J, Symington EA, Jonker CZ, Rampedi IT, Van Eeden TS (2012), “Comparison of the mineral composition of leaves and infusions of traditional and herbal teas”, Soil African Journal Science, 108, pp – 45 Pina RG and Cervantes C (1996), “Microbial interactions with aluminum”, Biometals, 9, pp 311 – 316 46 Qin F, Chen W 2007 , “Lead and copper levels in tea samples marketed in eijing, China”, Bull Environ Contam Toxicol, 79(3), pp 247 – 50 47 Robert LT (2000), Soil Microbiology 2nd ed., John Wiley& Sons, Inc, pp 149-150 48 Ross IS (1975), “Some effects of heavy metals on fungal cells”, Trans Br Mycol Soc., 64, pp 175 – 193 49 Sabine G and Eleanora IR (2000), Acidophilic and acid-tolerant fungi and yeasts Hydrobiologia, 433, pp 91–109 50 Scott JA and Palmer S J (1988), “Cadmium bio-sorption by bacterial exopolysaccharide”, Biotechnol Lett., 10, pp 21 – 24 51 Silver S, Nucifors G, Chu L, and Misra TK (1989), “Bacterial resistance ATPases: Primary pumps for exporting toxic cations and anions”, Trends Biochem Sci., 14, pp 76 – 80 52 Silver S and Phung LT (1996), “Bacterial heavy metal resistance: new surprises”, Annu Rev Microbiol., 50, pp 753 – 789 53 Swan TM and Watson K (1997 , “Membrane fatty acid composition and membrane fluidity as parameters of stress tolerance in yeast Can J Microbiol., 43, pp 70-77 54 Teresa Mossor – Pietraszewska (2001), “Effect of aluminium on plant growth and metabolism”, Acta, Biochimica, Polonica, pp 673 – 686 55 Tobin J, White C, and Gadd GM 1994: Fungal accumulation of toxic metals and application to environmental technology J Indust Microbiol., 13, pp 126-130 56 Tonomura K, Maeda K, and Futai F (1968), “Studies on the action of mercuryresistant microorganisms on mercurials II The vaporization of mercurials stimulated by mercury-resistant bacterium”, J Ferment Technol., 46, pp 685 – 692 57 Veglio' F and Beolchini F (1997), “Removal of metals by biosorption: a review”, Hydrometallurgy, 44, pp 301 – 316 58 Volesky B and May-Phillips HA (1995 , “Biosorption of heavy metals by Saccharomyces cerevisiae” Appl Microbiol Biotechnol., 42, pp 797-806 59 Vyas P, Rahi P, Chauhan A, Gulati A 2007 , “Phosphate solubilization potential and stress tolerance of Eupenicillium parvum from tea soil”, Mycol Res 111, pp 931–938 60 Wales DS and Sagar BF (1990), “Recovery of metal ions by microfungal filters”, J Chem Technol Biotechnol., 49, pp 345 – 355 61 Weast RC (1984), CRC handbook of chemistry and physics, CRC, Boca Raton, Florida 62 White C and Gadd GM (1995), “Determination of metals and metal fluxes in algae and fungi”, Sci Total Environ., 176, pp 107-115 63 White C, Sayer JA, and Gadd GM (1997), “Microbial solubilization and immobilization of toxic metals: key biogeochemical processes for treatment of contamination”, FEMS Microbiol Rev., 20(3-4), pp 503-516 64 Zhang D, Duine J, Kawai F 2002 , “The extremely high Al resistance of Penicillium janthineleum F-13 is not caused by internal or external sequestration of Al”, Biometals (15), pp 167–174 65 Zenova GM, Zakalyukina YV, and Zvyagintsev DG (2000), “Acidotolerant Actinomycetes in Soils”, Pochvovedenie, 9, pp 1114-1116 Một số trang web tham khảo: 66 https://chebuptancuong.com/loai-dat-nao-phu-hop-voi-cay-che.html 67 Quang Thịnh (2008), Nhôm sức khỏe người PHỤ LỤC Phụ lục 1: Tiêu chuẩn McFarland Tiêu chuẩn McFarland sử dụng để chuẩn hóa số lượng vi khuẩn gần hệ thống chất lỏng cách so sánh độ đục hệ thống thử với tiêu chuẩn McFarland Tiêu chuẩn McFarland dung dịch hóa học bari clorua axit sulfuric; phản ứng hai chất tạo kết tủa bari sulfat Khi trình lắc diễn tốt, độ đục tiêu chuẩn McFarland so sánh trực quan với mật độ vi khuẩn bảng đây: Tiêu chuẩn 1% BaCl2 (ml) 1% McFarland H2SO4 Mật độ (ml) khuẩn/ ml TM50 0,5 0,05 9,95 1,5 x 108 TM51 1,0 0,10 9,90 3,0 x 108 TM52 2,0 0,20 9,80 6,0 x 108 TM53 3,0 0,3 9,7 9,0 x 108 TM54 4,0 0,4 9,6 1,2 x 109 TM55 5,0 0,5 9,5 1,5 x 109 TM56 6,0 0,6 9,4 1,8 x 109 TM57 7,0 0,7 9,3 2,1 x 109 TM58 8,0 0,8 9,2 2,4 x 109 TM59 9,0 0,9 9,1 2,7 x 109 vi Trước sử dụng, tiêu chuẩn McFarland nên lắc tốt chia thành phần ống nghiệm giống hệt sử dụng để chuẩn bị dung dịch Sau lấymẫu ống nên niêm phong chặt chẽ để tránh bốc Trước lần sử dụng, lắc để đảm bảo bari sulfat phân bố suốt dung dịch Tiêu chuẩn sử dụng phổ biến phòng thí nghiệm vi sinh vật học tiêu chuẩn McFarland 0,5 quy định để điều chỉnh độ đục huyền dịch nuôi cấy vi khuẩn cho thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh Chuẩn bị tiêu chuẩn McFarland 0,5: Độ đục chuẩn 0,5 Mcfarland chuẩn bị cách trộn: - Dung dịch BaCl2 1%: 0,5ml - Dung dịch H2SO4 1%: 99,5 ml - Trộn dung dịch pha để thu hỗn hợp có độ đục tương đương 1,5x108 CFU/ml Chia vào tube thủy tinh hàn k n để tránh bay hơi, ống đục chuẩn giữ vòng tháng bóng tối nhiệt độ phòng Lắc trước sử dụng để làm tan hạt BaSO4 kết tủa tube Kiểm tra độ xác độ đục chuẩn 0,5 Mcfaland - Đo máy đo độ đục bước sóng 625 nm: OD = 0,08-0,1 - Hoặc sử dụng chủng chuẩn E coli ATCC 15922: điều chỉnh huyền dịch vi khuẩn giống với độ đục chuẩn, chuẩn bị độ pha loãng 10 lần huyền dịch, xác định số lượng vi khuẩn phương pháp đếm đĩa thạch Huyền dịch vi khuẩn có độ đục với độ đục chuẩn 0,5 phải có số lượng vi khuẩn 108 vi khuẩn/ml Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ ống nghiệm giữ giống vi khuẩn tuyển chọn h a vào 100 ml nước cất lần khử trùng So sánh độ đục dung dịch vừa pha thẻ Wickerham, cho độ đục dịch huyền phù vi khuẩn tương tự với độ đục môi trường McFarland pha Phụ lục 2: Một số hình ảnh kết nghiên cứu đề tài Hình Một số chủng nấm mốc phân lập từ MĐ1 Hình Một số chủng nấm mốc phân lập từ MĐ2 Hình Một số chủng nấm mốc phân lập từ MĐ3 Hình Các chủng vi khuẩn B1, B2, B3 môi trƣờng thạch chứa hàm lƣợng Al3+ lần lƣợt 300 mg/l, 500 mg/l 700 mg/l Hình Các chủng vi khuẩn B4, B5, B6 môi trƣờng thạch chứa hàm lƣợng Al3+ lần lƣợt 300 mg/l, 500 mg/l 700 mg/l Hình Các chủng vi khuẩn B7, B8, B9 môi trƣờng thạch chứa hàm lƣợng Al3+ lần lƣợt 300 mg/l, 500 mg/l 700 mg/l Hình Các chủng vi khuẩn B10, B11, B12 môi trƣờng thạch chứa hàm lƣợng Al3+ lần lƣợt 300 mg/l, 500 mg/l 700 mg/l Hình Chủng môi trường thạch chứa hàm lượng Al 3+ 300 mg/l, 500 mg/l 700 mg/l Hình Chủng môi trường thạch chứa hàm lượng Al 3+ 300 mg/l, 500 mg/l 700 mg/l Hình 10 Chủng môi trường thạch chứa hàm lượng Al 3+ 300 mg/l, 500 mg/l 700 mg/l Hình 11 Chủng mơi trường thạch chứa hàm lượng Al 3+ 300 mg/l, 500 mg/l 700 mg/l Hình 12 Chủng 10 môi trường thạch chứa hàm lượng Al 3+ 300 mg/l, 500 mg/l 700 mg/l Hình 13 Chủng 11 12 môi trường thạch chứa hàm lượng Al 3+ 300 mg/l, 500 mg/l 700 mg/l Hình 14 Chủng 13 14 môi trường thạch chứa hàm lượng Al 3+ 300 mg/l, 500 mg/l 700 mg/l Hình 15 Chủng 15 16 môi trường thạch chứa hàm lượng Al 3+ 300 mg/l, 500 mg/l 700 mg/l Hình 16 Sinh khối chủng F17 thu từ mơi trường nuôi cấy chứa 500 mg/l 1000 mg/l (trái sang phải) Al3+ B2 B4 Hình 17 Sự phát triển chủng môi trường chứa 100 mg/l Al3+ pH từ đến 5,0 (trái sang phải) B2 B4 Hình 18 Sự phát triển chủng môi trường chứa nồng độ nhôm từ 100 – 2000 mg/l (trái sang phải), pH 3,0 Phụ lục Một số bảng số liệu gốc Bảng Số lượng tế bào chủng vi khuẩn B2 B4 giá trị pH khác (CFU/ml) pH Bacillus subtilis B2 B2.1 B2.2 B2.3 Burkholderia cenocepacia B4 TB B2 B4.1 B4.2 B4.3 TB B4 2,4 2,1x105 1,7x105 2,0x105 1,9x105 0 0 2,6 2,4x105 2,1x105 2,5x105 2,3x10 0 0 2,8 1,1x105 9,0x104 9,5x104 9,8x10 9,8x102 1,1x103 9,5x102 1,0x10 3,0 7,2x104 7,7x104 7,9x104 7,6x10 1,5x105 1,9x105 1,9x105 1,8x10 5,0 3,5x104 3,4x104 3,6x104 3,5x10 2,0x105 1,9x105 2,3x105 2,1x10 Bảng Số lượng tế bào chủng vi khuẩn mơi trường axit có chứa nồng độ nhôm khác (CFU/ml) Nồng Bacillus subtilis B2 Burkholderia cenocepacia B4 độ nhôm B2.1 B2.2 B2.3 TB B2 B4.1 B4.2 B4.3 TB B4 (mg/l) 100 6 2,3x106 2,5x106 2,3x106 2,4x10 2,5x106 2,4x106 2,5x106 2,5x10 500 6 1,9x106 1,7x106 2,0x106 1,9x10 1,2x106 1,6x106 1,2x106 1,3x10 1000 1,7x105 1,6x105 2,2x105 1,8x10 6,0x104 1,0x104 1,0x104 2,7x10 2000 1,4x105 1,9x105 1,7x105 1,7x10 1,7x104 1,8x104 2,2x104 1,9x10 Bảng Khối lượng sinh khối khô chủng nấm mốc F8, F13 F17 mơi trường có pH khác (g/l) Chủng Eupenicillium javanicum F8 Penicillium variabile F13 Penicillium janthinellum F17 pH 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 5,0 9,83 13,24 8,24 7,45 7,38 9,27 7,65 12,65 8,97 7,25 7,86 8,95 12,5 11,9 12,7 11,6 1,41 1,21 Bảng Khối lượng sinh khối khô chủng nấm mốc F8, F13 F17 mơi trường có chứa nồng độ nhôm khác (g/l) Chủng pH 100 500 1000 2000 Eupenicillium javanicum F8 20,53 7,44 6,69 6,35 6,14 Penicillium variabile F13 17,89 7,32 6,48 6,39 5,62 Penicillium janthinellum F17 22,65 8,75 7,05 5,57 4,74 ... chịu axit hấp thụ nhôm vi sinh vật phân lập từ đất trồng chè vùng Tân Cương, Thái Nguyên  Mục đ ch đề tài - Phân lập chủng VSV chịu axit hấp thụ nhôm từ đất trồng chè vùng Tân Cương, Thái Nguyên. .. số đất 33 3.2 Kết phân lập chủng vi sinh vật chịu axit hấp thụ nhôm từ đất trồng chè vùng Tân Cương, Thái Nguyên 34 3.3 Kết tuyển chọn chủng vi sinh vật chịu axit hấp thụ nhôm phân. .. vùng Tân Cương, Thái Nguyên - Phân lập hệ VSV chịu axit hấp thụ nhôm từ số mẫu đất trồng chè vùng Tân Cương, Thái Nguyên - Tuyển chọn chủng VSV có khả hấp thụ nhôm cao từ chủng VSV phân lập - Định