BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN NGỌC QUANG NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HĨA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN NGỌC QUANG NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HĨA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 942 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Chu Hoàng Hà TS BS Nguyễn Phi Hùng Hà Nội – 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án cơng trình nghiên cứu tơi số kết nghiên cứu, cộng tác với nhà khoa học khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chun ngành hội nghị nước quốc tế với đồng ý cho phép đồng tác giả; kết lại luận án chưa tác giả công bố công trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Nghiên cứu sinh Nguyễn Ngọc Quang LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Chu Hồng Hà, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hướng dẫn, bảo tận tình suốt q trình tơi thực luận án Thầy không truyền thụ cho tơi nhiều kiến thức chun mơn mà giúp tơi bồi đắp lòng say mê, nghiêm túc, tính cẩn thận nghiên cứu khoa học Đó tảng cho trình thực luận án hành trang giúp tự tin vững bước đường khoa học sau Trong thời gian học tập nghiên cứu, xin trân trọng cảm ơn TS BS Nguyễn Phi Hùng, Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K Thầy hướng dẫn, động viên, dành cho nhiều lời khuyên quý báu lúc tơi gặp khó khăn Tơi xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Tạ Văn Tờ, TS Vương Diệu Linh đồng nghiệp thuộc Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K tạo điều kiện thuận lợi cho thực tốt đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công Nghệ Sinh học bên cạnh giúp đỡ cổ vũ suốt thời gian qua Với tất lòng biết ơn, xin dành cho bố mẹ, bạn bè tin tưởng, thông cảm, động viên, tạo điều kiện chia sẻ khó khăn thời gian qua, giúp tơi hồn thành tốt luận án Nghiên cứu sinh Nguyễn Ngọc Quang MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Ung thư phổi 1.1.1 Thực trạng ung thư phổi 1.1.2 Phân loại ung thư phổi 1.1.3 Các giai đoạn ung thư phổi 1.2 Ung thư biểu mô tuyến phổi 1.2.1 Đặc điểm ung thư biểu mô tuyến 1.2.2 Các phân típ mơ bệnh học ung thư biểu mô tuyến 11 1.3 Biến đổi gen EGFR ung thư phổi 13 1.3.1 Cấu trúc chức gen EGFR 13 1.3.2 Đột biến gen EGFR ung thư phổi 15 1.3.3 Biểu protein EGFR ung thư phổi 17 1.4 Methyl hóa DNA ung thư phổi 17 1.4.1 Methyl hóa DNA 17 1.4.2 Methyl hóa gen EGFR, BRCA1, MLH1, MGMT RASSF1A ung thư phổi 20 1.5 Điều trị đích ung thư ung thư phổi 29 1.5.1 Điều trị đích ung thư 29 1.5.2 Điều trị đích ung thư phổi 31 1.6 Phương pháp phân tích biến đổi phân tử ung thư phổi 33 1.6.1 Phương pháp phân tích đột biến gen ung thư phổi 33 1.6.2 Phương pháp phân tích methyl hóa DNA ung thư phổi 35 1.7 Nghiên cứu dấu ấn phân tử ung thư phổi Việt Nam 37 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 39 2.1 Vật liệu 39 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 39 2.1.2 Hóa chất 39 2.2 Thiết bị 42 2.3 Phương pháp nghiên cứu 43 2.3.1 Tách chiết DNA tổng số xác định nồng độ DNA 43 2.3.2 Xử lý bisulfite với DNA tổng số 44 2.3.3 Phương pháp PCR 44 2.3.4 Phương pháp điện di 47 2.3.5 Phương pháp xác đinh đột biến gen EGFR 47 2.3.6 Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch 48 2.3.7 Phương pháp tạo trình tự DNA methyl enzyme M.sssI .49 2.3.8 Xử lý kết thống kê sinh học 50 2.4 Sơ đồ nghiên cứu 50 CHƢƠNG III KẾT QUẢ 51 3.1 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu 51 3.2 Đột biến biểu gen EGFR 52 3.2.1 Đột biến gen EGFR tương quan với đặc điểm bệnh nhân 52 3.2.2 Biểu protein EGFR tương quan với đặc điểm bệnh nhân 56 3.3 Tình trạng methyl hóa số gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến phổi 59 3.3.1 Methyl hóa gen EGFR tương quan với đặc điểm bệnh nhân 59 3.3.2 Methyl hóa gen BRCA1 tương quan với đặc điểm bệnh nhân 61 3.3.3 Methyl hóa gen MGMT tương quan với đặc điểm bệnh nhân 63 3.3.4 Methyl hóa gen MLH1 tương quan đặc điểm bệnh nhân 65 3.3.5 Methyl hóa gen RASSF1A tương quan với đặc điểm bệnh nhân 66 3.4 Tương quan đột biến biểu gen EGFR với methyl hóa số gen liên quan đến ung thư tuyến phổi 68 3.4.1 Tương quan đột biến, biểu methyl hóa gen EGFR 68 3.4.2 Tương quan đột biến biểu gen EGFR với methyl hóa gen BRCA1, MGMT, MLH1 RASSF1A 71 3.4.3 Tương quan tình trạng methyl gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến phổi 74 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 76 4.1 Đặc điểm phân tử gen EGFR bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi 76 4.1.1 Đột biến vùng hoạt hóa Tyrosine Kinase gen EGFR 76 4.1.2 Biểu mức protein EGFR 78 4.1.3 Methyl hóa vùng promoter EGFR 80 4.1.4 Tương quan đặc điểm phân tử gen EGFR 81 4.2 Methyl hóa gen ức chế khối u BRCA1, MGMT, MLH1 RASSF1A bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi 83 4.2.1 Methyl hóa vùng promoter gen BRCA1 83 4.2.2 Methyl hóa vùng promoter gen MGMT 84 4.2.3 Methyl hóa vùng promoter gen MLH1 86 4.2.4 Methyl hóa vùng promoter gen RASSF1A 87 4.3 Tương quan đặc điểm phân tử gen EGFR với methyl hóa BRCA1, MGMT, MLH1 RASSF1A ung thư biểu mô tuyến phổi 88 4.3.1 Đột biến EGFR với methyl hóa mức gen ức chế khối u .88 4.3.2 Biểu EGFR với methyl hóa gen ức chế khối u 90 4.3.3 Sự methyl hóa đồng thời số gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến phổi 91 KẾT LUẬN 94 KIẾN NGHỊ 95 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 96 TÀI LIỆU THAM KHẢO 97 DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ A260 Độ hấp thụ bước sóng 260 nm AAH Atipical Adenomatous Hyperplasias (Tế bào phân chia q mức khơng điển hình) ABL Abelson murine leukemia viral oncogene homolog gene ACS American Cancer Society (Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ) AIS Adenocarcinoma in situ (Ung thư chỗ) ALK Anaplastic Lymphoma Kinase gene ALK-EML4, BCR-ABL Chuyển đoạn ALK-EML4, BCR-ABL APC Adenomatous polyposis of the colon gene BAC Bronchioloalveolar Carcinoma (Ung thư biểu mô tiểu phế nang) BCR Breakpoint Cluster Region gene BRCA1 Breast cancer susceptibility gene (Gen nhạy cảm với ung thư vú) BRAF v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B CD74 Cluster of Differentiation 74 gene CHFR Checkpoint With Forkhead And Ring Finger Domains CK5/6 Cytokeratin 5/6 protein CK7 Cytokeratin protein COBRA Combined Bisulfite Restriction Analysis (Phân tích kết hợp Bisulfite cắt giới hạn) cs Cộng DAB 3, –diaminobenzidine DAPK Death‐associated protein kinase DNA Acid deoxyribonucleic DNMTs DNA methyltransferase (Enzyme methyl hóa DNA) dNTP Deoxynucleotide triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EGFR Epidermal growth factor receptor (Yếu tố phát triển biểu mô) ER Estrogen receptor (thụ thể estrogen) FDA Food and Drug Administration (Hiệp hội thực phẩm thuốc Hoa Kỳ) FFPE Formalin fixed paraffin embedded FISH Fluorescence In Situ Hybridization (Lai chỗ huỳnh quang) GTP Guanosine triphosphate GDP Guanosine diphosphate GSTP1 Glutathione S-transferase Pi gene H&E Hematoxylin & Eosin HDACs Histone deacetylase HRM High Resolution Melting (Độ phân giải cao nhiệt độ nóng chảy) HPR Horseradish Peroxidase IARC International Agency for Research on cancer (Tổ chức nghiên cứu ung thư giới) IHC Immunohistochemistry (Hóa mơ miễn dịch) MAPK Mitogen-activated protein kinase MDR Multidrug resistance gene MEK (MAP2K1) Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase MET Mesenchymal-epithelial transition factor MIA Minimally Invasive Adenocarcinoma MGMT O-6-methylguanine-DNA methyltransferase gene MLH1 MutL homolog gene MsssI CpG methyltransferase MS-PCR Methylation Specific PCR (PCR đặc hiệu methyl) MYC Myelocytomatosis genes NGS Next Generation Sequencing (Giải trình tự hệ mới) NSCLC Non-small cell lung cancer (Ung thư phổi không tế bào nhỏ) PI3K Phosphoinositide 3-kinases PTEN Phosphatase and tensin homologue PR Progesterone Receptor (Thụ thể progesterone) RASSF1A Ras association domain family 1A gene RARP2 The retinoic acid receptor P gene Ras Rat sarcoma RB2 Retinoblastoma-like protein RET Rearranged during transfection ROS1 c-ros oncogene 1gene SAM S-adenosylmethionine SCLC Small cell lung cancer (Ung thư phổi tế bào nhỏ) SDC4 Syndecan gene SLC34A2 Solute Carrier Family 34 Member gene SNP Single Nucleotide Polymorphism (Sự đa hình nucleotide) SSCP Single-strand conformation polymorphism (đa hình cấu trúc sợi đơn) TAE Tris-acetate-EDTA TBE Tris-borate-EDTA TEMED N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine TKIs Tyrosine Kinase Inhibitors (Các chất ức chế Tyrosine Kinase) TIMP3 Tissue Inhibitor of Metalloproteinases gene TTF-1 Transcription Termination Factor (Yếu tố kết thúc phiên mã 1) WHO World Heath Organization (Tổ chức Y tế giới) WNT Wingless genes YAP Yes-associated protein 134 59050 S134 117,5 Wildtype - 2+ 135 43573 S135 Wildtype - Âm tính 136 62996 S136 Del - Âm tính 137 39885 S137 Wildtype - 3+ 138 22053 S138 Del - 2+ 139 49473 S139 177,8 195,8 264,8 125,6 208,5 Del - Âm tính PHỤ LỤC 3: Kết methyl hóa gen BRCA1, MGMT, MLH1 RASSF1A STT Số GPB Ký Methyl hóa Methyl hóa Methyl hóa Methyl hóa hiệu gen BRCA1 gen MGMT gen MLH1 gen RASSF1A 22724 S1 - - - - 30706 S2 - - - + 38917 S3 - - - - 34221 S4 - - - - 52455 S5 - + - - 38814 S6 - + - + 36505 S7 - + - + 38663 S8 + - - - 62635 S9 - - - - 10 24617 S10 - - - - 11 3634 S11 - - + + 12 17030 S12 - - - + 13 30270 S13 - + - - 14 7821 S14 - - - - 15 445 S15 + + + + 16 36391 S16 - + + + 17 33066 S17 - - + + 18 36868 S18 + + + + 19 31542 S19 - + - - 20 29023 S20 - + + - 21 27189 S21 - + - - 22 38698 S22 - - + - 23 37451 S23 - - - - 24 64484 S24 - - - - 25 61609 S25 - - - - 26 43883 S26 - - - - 27 58838 S27 - - - - 28 34385 S28 + - + + 29 17026 S29 + - - - 30 30550 S30 - - - - 31 72498 S31 + - - - 32 32540 S32 + - - - 33 39886 S33 - - - - 34 64146 S34 - - - - 35 40828 S35 + - - + 36 39305 S36 - - - - 37 32926 S37 - - - - 38 41294 S38 - + - - 39 64249 S39 - + - - 40 R1097 S40 - - - - 41 63959 S41 + - - + 42 61036 S42 + + - - 43 41240 S43 - - - + 44 29311 S44 - + - - 45 5999 S45 - + - + 46 33351 S46 + + - - 47 3163 S47 + - - - 48 63005 S48 + + - + 49 32040 S49 - - - - 50 41730 S50 - - - - 51 1525 S51 + - - + 52 57820 S52 - + + - 53 47854 S53 + - - - 54 33244 S54 + - - - 55 DA394 S55 - - - - 56 42712 S56 + - - - 57 39816 S57 + - - + 58 40539 S58 + - - + 59 32335 S59 - + - + 60 62660 S60 + - + + 61 33892 S61 + - + + 62 5821 S62 - - + - 63 42536 S63 - - - - 64 5290 S64 - - - + 65 22624 S65 + - - + 66 44004 S66 + - - - 67 42705 S67 - + - - 68 32862 S68 + + - - 69 42850 S69 + + + + 70 90391 S70 + + + + 71 57965 S71 - - - + 72 66349 S72 - - + + 73 44507 S73 + + - + 74 14090 S74 - + + + 75 M828 S75 - - - - 76 33960 S76 + - - - 77 10808 S77 + + - + 78 42516 S78 - - - - 79 38272 S79 + - - + 80 44006 S80 + + - - 81 45150 S81 + + + + 82 44748 S82 - - - - 83 39062 S83 - + - - 84 93133 S84 - - - - 85 44874 S85 - - - - 86 49313 S86 - - - - 87 45407 S87 + - - + 88 10087 S88 - + - - 89 89195 S89 - - - - 90 45282 S90 + - + - 91 43942 S91 - - + + 92 52957 S92 - - + - 93 10793 S93 - + + + 94 12395 S94 - - - - 95 12905 S95 - - - - 96 41967 S96 - + - - 97 52178 S97 + - - + 98 44771 S98 - + - - 99 44144 S99 - - - - 100 46210 S100 - - - - 101 46628 S101 - + - - 102 45998 S102 - + + + 103 47046 S103 - + + - 104 38325 S104 - - + - 105 43861 S105 - - - - 106 94807 S106 - - + - 107 46146 S107 - - + - 108 57240 S108 - - + + 109 68116 S109 - - - - 110 32619 S110 - - - - 111 94607 S111 - - - - 112 47562 S112 + - - - 113 45312 S113 - + - - 114 62319 S114 - + - - 115 95421 S115 - - - + 116 59222 S116 - - - - 117 45392 S117 - - - - 118 52412 S118 - + - - 119 67142 S119 - - - - 120 37039 S120 + - - - 121 99551 S121 - + - - 122 56484 S122 + + + - 123 99696 S123 + + - + 124 56128 S124 + - - - 125 56309 S125 - + - - 126 55923 S126 - + - - 127 59068 S127 - - - - 128 30471 S128 - - - - 129 43248 S129 - - - - 130 43860 S130 - - - - 131 59993 S131 - + - - 132 41418 S132 + + - - 133 45528 S133 - - - + 134 59050 S134 - - - - 135 43573 S135 - - - - 136 62996 S136 - - - - 137 39885 S137 - - - - 138 22053 S138 - - - - 139 49473 S139 - - - - 140 38917-2 S140 - - - - 141 34221-2 S141 - - - - 142 38698-2 S142 - - - - 143 32540-2 S143 - - - - 144 39816-2 S144 - - - - 145 S145 - - - - Máu PHỤ LỤC 4: 29 đột biến đƣợc phát kit Therascreen EGFR RGQ PCR Đột biến Exon Vị trí thay đổi COSMIC ID T790M 20 2369C>T 6240 L858R 21 2573T>G 6224 L861Q 21 2582T>A 6213 S768I 20 2303G>T 6241 G719A 18 2156G>C 6239 G719S 18 2155G>A 6252 G719C 18 2155G>T 6253 Thêm đoạn 20 2307_2308ins9 12376 2319_2320insCAC 12377 2310_2311insGGT 12378 2237_2255>T (complex) 12384 2236_2250del15 6225 2238_2255del18 6220 2238_2248>GC (complex) 12422 2238_2252>GCA (complex) 12419 2239_2247del9 6218 2239_2253del15 6254 2239_2256del18 6255 2239_2248TTAAGAGAAG>C (complex) 12382 2239_2258>CA (complex) 12387 2240_2251del12 6210 2240_2257del18 12370 2240_2254del15 12369 2239_2251>C (complex) 12383 Mất đoạn 19 PHỤ LỤC 5: Kết giải trình tự Phụ lục 5.1: Trình tự promoter gen EGFR methyl hóa Hình 5.1 Trình tự vùng promoter gen EGFR methyl Phụ lục 5.2 Trình tự promoter gen EGFR khơng methyl hóa Hình 5.2 Trình tự vùng promoter gen EGFR không methyl PHỤ LỤC 6: Một số kết điện di sản phẩm MS-PCR Phụ lục 6.1: Một số kết điện di sản phẩm MS-PCR gen EGFR Hình 6.1 Kết điện di sản phẩm MS-PCR phát methyl hóa gen EGFR S: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến phổi, L: Thang chuẩn DNA 100bp (Fermentas), M: Sản phẩm EGFR methyl hóa (158 bp), U: Sản phẩm EGFR khơng methyl hóa (150 bp), NTC: Đối chứng âm, Phụ lục 6.2: Một số kết điện di sản phẩm MS-PCR gen BRCA1 Hình 6.2 Kết điện di sản phẩm MS-PCR phát methyl hóa gen BRCA1 S: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến phổi, L: Thang chuẩn DNA 100 bp (Fermentas), M: Sản phẩm BRCA1 methyl (70 bp), U: Sản phẩm BRCA1 không methyl (77 bp), NTC: Đối chứng âm, Phụ lục 6.3: Một số kết điện di sản phẩm MS-PCR gen MGMT Hình 6.3 Kết điện di sản phẩm MS-PCR phát methyl hóa gen MGMT S: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến phổi, L: Thang chuẩn DNA 100 bp (Fermentas), M: Sản phẩm MGMT methyl (81 bp), U: Sản phẩm MGMT không methyl (93 bp), NTC: Đối chứng âm, Phụ lục 6.4: Một số kết điện di sản phẩm MS-PCR gen MLH1 Hình 6.4 Kết điện di sản phẩm MS-PCR phát methyl hóa MLH1 S: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến phổi, L: Thang chuẩn DNA 100 bp (Fermentas), M: Sản phẩm MLH1 methyl (303 bp), U: Sản phẩm MLH1 không methyl (301 bp), NTC: Đối chứng âm, Phụ lục 6.5: Một số kết điện di sản phẩm MS-PCR gen RASSF1A Hình 6.5 Kết điện di sản phẩm MS-PCR phát methyl hóa gen RASSF1A, S: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến phổi, L: thang chuẩn DNA 100bp (Fermentas), M: Sản phẩm RASSSF1A methyl (175 bp), U: Sản phẩm RASSF1A không methyl (137 bp), NTC: Đối chứng âm PHỤ LỤC 7: Kết hóa mơ miễn dịch S8 S12 S14 S13 S18 S21 S1 S2 S3 S6 S7 S29 S42 S48 S56 S37 S45 S46 S51 S52 S53 S39 S55 Hình 7.1 Kết hóa mơ miễn dịch, S58 S: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến phổi độ phóng đại 200X ... Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu gen EGFR tình trạng methyl hóa số gen liên quan bệnh nhân ung thƣ biểu mô tuyến phổi với mục tiêu: Phân tích tỷ lệ đột biến mức độ biểu gen EGFR bệnh nhân ung. .. sơ bệnh án hoàn chỉnh Thu thập mẫu bệnh phẩm ung thư phổi mẫu phổi liền kề Xác định tỷ lệ đột biến mức độ biểu gen EGFR Phân tích liên quan đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu với đột biến biểu gen EGFR. .. giá tình trạng methyl hóa gen ức chế khối u quan trọng ung thư biểu mô tuyến phổi Nghiên cứu có số đóng góp ý nghĩ thực tiễn sau: Mô tả tỷ lệ đột biến, mức độ biểu protein EGFR methyl hóa số gen