Đang tải... (xem toàn văn)
Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8400-16:2011. Tiêu chuẩn giới thiệu về bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 16: bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E. coli. Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh phù trên lợn (bệnh phù đầu) do vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) gây ra.
Cấy vi khuẩn vào môi trường nước pepton môi trường nước pepton có bổ sung tryptophan, ủ 37 oC Sau 24 h, nhỏ 0,2 ml ñến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s vào môi trường, lắc nhẹ - Phản ứng dương tính: bề mặt mơi trường vòng thuốc thử chuyển màu đỏ - Phản ứng âm tính: vòng thuốc thử khơng chuyển màu A.2.2 Phản ứng MR Thuốc thử phản ứng MR 12 Đỏ metyl 0,04 g Cồn 95 ñộ 60 ml Nước 40 ml TCVN 8400-16:2011 Môi trường VP-MR pha chế theo hướng dẫn nhà sản xuất Cấy vi khuẩn vào môi trường nước VP-MR, nuôi 37 oC sau 24 h nhỏ vào mơi trường ni cấy vi khuẩn mẫu giọt dung dịch thuốc thử, ñọc kết sau - Phản ứng dương tính: mơi trường chuyển màu đỏ - Phản ứng âm tính: mơi trường có màu vàng A.2.3 Phản ứng VP Pha môi trường VP-MR: Theo dẫn nhà sản xuất Pha thuốc thử - Dung dịch 1: Alpha naphthol (C10H7OH) 5g Cồn 96 % 100 ml - Dung dịch 2: KOH 40 g Nước 100 ml Tiến hành phản ứng: Cấy vi khuẩn cần kiểm tra vào môi trường VP–MR, nuôi cấy 37 oC, sau 48 h nhỏ vào môi trường nuôi cấy 0,6 ml dung dịch 0,2 ml dung dịch Đọc kết sau 15 h - Phản ứng dương tính: Mơi trường có màu đỏ hồng đậm - Phản ứng âm tính: Mơi trường có màu vàng không biến màu A.2.4 Sử dụng xitrat Pha chế mơi trường (thạch simon xitrat) theo quy định nhà sản xuất Cấy vi khuẩn vào thạch simon xitrat ni 37 0C từ 18 h đến 24 h Vi khuẩn sử dụng xitrat (dương tính) làm mơi trường chuyển từ màu xanh sang màu xanh nước biển Âm tính mơi trường giữ ngun màu xanh 13 TCVN 8400-16:2011 Phụ lục B (Quy ñịnh) Phương pháp PCR giám ñịnh gene quy ñịnh yếu tố ñộc lực F18 VT2e B.1 Chuẩn bị mẫu Mẫu kiểm tra khuẩn lạc hay canh khuẩn ni cấy từ 18 h đến 24 h Hòa khuẩn lạc nghi ngờ trực tiến vào hỗn hợp phản ứng PCR cho µl nước canh khuẩn Mẫu ñối chứng dương: Chủng vi khuẩn E coli ñã biết có mang gene F18 VT2e Mẫu DNA tách chiết từ khuẩn lạc hay canh trùng nuôi cấy Có thể tách chiết DNA kit thương mại hay nhiệt Nếu sử dụng kit bước tiến hành theo dẫn nhà sản xuất Tách chiết phương pháp shock nhiệt: Lấy từ khuẩn lạc đến khuẩn lạc hòa vào 100 µl nước vô trùng không chứa men Rnase Dnase (nuclease free water) Đun sôi cách thủy 10 min, làm lạnh nhanh huyễn dịch ñá Ly tâm huyễn dịch 12000 r/min Thu hoạch nước ñể làm phản ứng PCR B.2 Tiến hành phản ứng PCR Có thể dùng kit PCR thương mại sử dụng kết hợp với hướng dẫn nhà sản xuất Nếu sử dụng Taq DNA polymerase hãng QIAGEN thành phần cho phản ứng PCR với tổng thể tích 50 µl bao gồm: 10X coral bufer: µl; 200 µM loại dNTP; Taq DNA polymerase 2,5 UI; primer forward primer reverse µM loại; nước cất tiệt trùng; DNA tách chiết từ mẫu (2 µl) khuẩn lạc hay canh trùng vi khuẩn Đối chứng dương: Vi khuẩn hay DNA tách chiết từ vi khuẩn E coli biết có mang gene F18 VT2e Đối chứng âm: bao gồm ñầy ñủ thành phần phản ứng PCR, DNA tách chiết từ mẫu hay vi khuẩn B.3 Chạy ñiện di Sản phẩm PCR ñược chạy ñiện di thạch agarose1,5 % ñến % dung dịch ñệm TAE TBE 14 TCVN 8400-16:2011 Cho µl dung dịch loading dye vào µl sản phẩm PCR, trộn ñều cho vào giếng thạch Cho 10 µl thang chuẩn (marker) vào giếng Bản thạch ñược ñiện di môi trường dung dịch ñệm TAE TBE (tùy thuộc vào loại ñệm sử dụng pha thạch), thời gian 30 ñến 40 min, 100 V, sau nhuộm dung dịch ethidi bromua 0,2 mg/100ml Có thể dùng sản phẩm có sẵn chất nhuộm DNA để pha chế thạch agarose (ví dụ SYBR safe DNA gel stain hãng Invitrogen) sử dụng theo quy ñịnh nhà sản xuất B.4 Đọc kết Phản ứng dương tính khi: - Mẫu đối chứng dương có vạch kích cỡ sản phẩm - Mẫu đối chứng âm: khơng xuất vạch - Mẫu kiểm tra có vạch giống mẫu ñối chứng dương 15 TCVN 8400-16:2011 Thư mục tài liệu tham khảo [1] Standard Diagnostic Manual for livestock diseases in Thailand JICA Third edition- 2003 110-111 [2] Bertschinger HU 1999 Postweaning Escherichia coli diarrhea and edema disease In: Diseases of Swine, BE Straw, S D’Allaire, WL Mengeling and DL Taylor, Eds, Iowa State University Press, Ames pp 441–54 [3] da dares GF, Penatti MP, Brito BG, da Silva Leite D 2001 Escherichia coli strains from edema disease: O serogroups, and genes for Shiga toxin, enterotoxins, and F18 fimbriae.Vet Microbiol 80: 227-33 [4] Johnson WM, Pollard DR, Lior H, Tyler SD, Rozee KR 1990 Differentiation of genes coding for Escherichia coli verotoxin and the verotoxin associated with porcine edema disease (VTe) by the polymerase chain reaction J Clin Microbiol 28: 2351-3 [5] Imberechts H, De Greve H, Lintermans P 1992 The pathogenesis of oedema disease in pigs Vet.Microbiol 31: 221-33 16 ... biển Âm tính mơi trường giữ ngun màu xanh 13 TCVN 8400-16:2011 Phụ lục B (Quy ñịnh) Phương pháp PCR giám ñịnh gene quy ñịnh yếu tố ñộc lực F18 VT2e B.1 Chuẩn bị mẫu Mẫu kiểm tra khuẩn lạc hay canh... agarose1,5 % ñến % dung dịch ñệm TAE TBE 14 TCVN 8400-16:2011 Cho µl dung dịch loading dye vào µl sản phẩm PCR, trộn ñều cho vào giếng thạch Cho 10 µl thang chuẩn (marker) vào giếng Bản thạch điện.. .TCVN 8400-16:2011 Môi trường VP-MR pha chế theo hướng dẫn nhà sản xuất Cấy vi khuẩn vào môi trường