Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xác định tần suất một số alen mini STR ở người Việt, đánh giá khả năng nhận dạng cá thể qua phân tích mini STRs từ các mẫu ADN bị phân huỷ một phần trong thực nghiệm.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 TẦN SUẤT ALEN MINI-STR TẠI LOCUS MINI STR Ở NGƢỜI VIỆT QUA PHÂN TÍCH CÁC MẪU BỊ BIẾN TÍNH TRONG THỰC NGHIỆM Trần Văn Khoa* TÓM TẮT Tần suất alen từ 66 mẫu ADN khơng có quan hệ huyết thống bị biến tính nhiệt độ 370C, độ ẩm 100% khoảng thời gian tuần, tuần 16 tuần, đun 1000C 30 phút, giờ, Tần số alen phân tích locus D18S51, D8S1179, THO1 FGA Kết quả: alen mini STR cá thể cho thông tin cần thiết Tỷ lệ dị hợp tử quan sát dao động từ 0,8305 0,9492 Như vậy, phân tích marker mini STR locus mini STR ứng dụng mẫu ADN bị biến tính phần ứng dụng cho lĩnh vực pháp y * Từ khoá: Mini STRs; Nhận dạng cá thể ALLELE FREQUENCY AT AUTOSOMAL MINI STR LOCI IN VIETNAMESE PEOPLE ANALYSED FROM EXPERIMETALLY DEGRADED SAMPLES SUMMARY The allele frequencies were determined for 66 unrelated genomic DNA samples Which were not preserved for different period time: weeks, weeks and 16 weeks in condition of 370C temperature with 100% humidity, and in boiling water for 30 minutes, hours, hours and hours The allele frequency distributions were analyzed for four unlinked polymorphic DNA loci: D18S51, D8S1179, THO1 and FGA Results: All mini STR markers were successfully amplified and informative The observed heterozygote frequencies of the loci ranged from 0.8305 to 0.9492 Based on the results of testing these four systems can provide a useful tool for forensic applications with degraded samples * Key words: Mini STRs; Individual identification ĐẶT VẤN ĐỀ Trên giới Việt Nam, việc sử dụng phân tích STR nhận dạng xác định huyết thống phát triển [1] Tuy nhiên, việc sử dụng tiểu trình tự lặp lại ngắn lĩnh vực chưa quan tâm nghiên cứu nước ta Tiểu trình tự lặp lại ngắn trình tự ADN lặp lại, thiết kế nhân lên đoạn ngắn phía so với trình tự lặp lại ngắn thông thường để khắc phục thất bại mẫu ADN bị phân huỷ nặng Trong thực tế, tàng thư gen dựa phân tích mini STRs để tham chiếu trường hợp mẫu ADN bị phân huỷ phần gây khó khăn cho cơng tác giám định Tuy nhiên, thông tin mini STRs thu mẫu ADN bị phân huỷ phần có giá trị đến đâu cần nghiên cứu để làm sở cho xây dựng tàng thư gen mini STRs trước tiến hành quy mô rộng * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Trần Văn Khoa (tranvankhoa@gmail.com) Ngày nhận bài: 10/10/2013; Ngày phản biện đánh giá báo: 10/12/2013 Ngày báo đăng: 16/12/2013 63 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QN SỰ SỐ 1-2014 Chính vậy, chúng tơi thực đề tài nhằm: Bước đầu xác định tần suất số alen mini STR người Việt, đánh giá khả nhận dạng cá thể qua phân tích mini STRs từ mẫu ADN bị phân huỷ phần thực nghiệm ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng vật liệu nghiên cứu 66 mẫu máu toàn phần phi công tổ lái thu thập Viện Y học Hàng không Xử lý mẫu máu thực nghiệm theo mơ hình Dixon CS 2006 [2]: để mẫu môi trường 370C với độ ẩm 100% thời gian tuần, tuần, 16 tuần Tạo mẫu ADN biến tính phần tác nhân nhiệt độ 1000C 30 phút, giờ, Hóa chất: kít tách chiết ADN, Qiagen, kit tách chiết ADN hạt từ tính, kÝt ADN IQ, Promega Hóa chất thơng thường cho PCR, điện di Kit phân tích mini STR PowerPlex® S5 PCR Amplification Kit Các hóa chất khác dùng cho điện di mao quản tự động máy giải trình tự ABI, 3130XL, POP-4™ Polymer, Hi-DiTM Formamide Phƣơng pháp nghiên cứu * Tách chiết ADN: Tách chiết ADN từ mẫu không bị biến tính kít Qiagen, tách chiết ADN từ mẫu bị biến tính phần kít ADN IQ theo nguyên lý hạt từ tính [5] Sau thu mẫu ADN, tiến hành định lượng kiểm tra độ tinh sản phẩm phương pháp định lượng máy đo quang phổ Nanodrop 1000 (Mỹ) * Phản ứng PCR nhân gen mini STR: Thành phần phản ứng PCR: Powerplex S5 5X Master Mix 5µl, Power Plex S5 10X Primer Pair Mix 2,5 µl, ADN khn 0,25 0,50 ng, nước cất vừa đủ 25 µl [6] Nhân gen máy PCR 9700 (ABI, Mỹ) theo chu trình nhiệt (bảng 1) 96 C o phút o 94 C 30 giây o 60 C phút o 72 C 90 giây o 60 C 45 phút chu kỳ o ∞ chu kỳ 4C chu kỳ 30 chu kỳ Điện di mao quản tự động hệ thống máy giải trình tự AB 3130XL, phân tích alen: thêm µl sản phẩm PCR µl of PowerPlex® S5 Allelic Ladder Mix Biến tính 95 phút, sau để đá phút trước tra mẫu điện di KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết xác định kiểu gen locus STR máy giải trình tự gen Sau thu mẫu ADN đạt tiêu chuẩn, xác định nồng độ độ tinh mẫu, tiến hành phản ứng nhân gen để xác định đa hình locus mini STR nghiên cứu Sử dụng kÝt nhân gen Powerplex S5 PCR Amplification kit Đây kÝt cho phép đồng khuếch đại phát triển locus, bao gồm D8S1179, D18S51, FGA TH01, kích thước sản phẩm khuyếch đại mini STR sấp xỉ 100 bp [6] Đối với mẫu nghiên cứu, sau chạy điện di, kết thu xử lý phần mềm Genemapper ID 3.2 Qua phân tích, mẫu bị biến tính mẫu khơng bị biến tính, chúng tơi thu thông tin loại alen thuộc locus gen Với số liệu thu được, tiến hành tính tốn tần suất đồng hợp tử, tần suất dị hợp tử trường hợp để bước đầu đánh giá khả nhận dạng mini STRs 64 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 Bảng 2: Kiểu gen dựa marker mini STR 66 mẫu Amello D18S51 D8S1179 TH01 FGA KIỂU GEN* X Y 15 21 10 12 21 25 XY1521101207092125 X Y 14 18 10 10 24 27 XY1418081006102427 X Y 14 15 12 17 10 17 24 XY1415121707101724 X Y 15 16 10 13 9.3 25 25 XY15161013099.32525 X Y 16 19 13 13 18 22.2 XY1619131306091822.2 X Y 15 20 10 14 21 25 XY1520101407092125 X Y 14 16 12 15 7 20 21 XY1416121507072021 X Y 13 15 12 14 9 23 25 XY1315121409092325 X Y 14 15 11 15 9.3 21 22 XY14151115079.32122 10 X Y 12 15 11 15 10 17 21 XY1215111509101721 11 X Y 13 21 14 14 21 23 XY1321141406092123 12 X Y 13 17 10 15 19 21 XY1317101507081921 13 X Y 15 16 10 10 10 21 22 XY1516101009102122 14 X Y 14 19 11 16 19 23 XY1419111608091923 15 X Y 14 15 10 19 7 21 24 XY1415101907072124 16 X Y 13 16 13 15 22 23 XY1316131507082223 17 X Y 12 14 11 12 19 23 XY1214111207091923 18 X Y 13 15 13 13 9 18 24 XY1315131309091824 19 X Y 18 19 14 15 23 24 XY1819141507092324 20 X Y 15 15 10 12 22 23 XY1515101206082223 21 X Y 14 15 12 16 10 24 25 XY1415121609102425 22 X Y 13 14 10 13 6.3 19 22.2 XY131410136.3091922.2 23 X Y 15 16 13 15 6.3 20 23 XY1516131507092023 24 X Y 13 22 11 15 9.3 22 22 XY13221115099.32222 25 X Y 14 15 10 13 23 23 XY1415101306072323 26 X Y 13 16 10 15 9.3 21 23 XY13161015099.32123 27 X Y 17 18 10 14 21 23 XY1718101406092123 28 X Y 13 14 13 16 9 22 26 XY1314131609092226 29 X Y 16 19 10 15 24 25 XY1619101507092425 30 X Y 13 18 14 15 22.2 26 XY13181415070922.226 31 X Y 12 22 13 17 22 25 XY1222131707092225 32 X Y 14 20 11 13 22 26 XY1420111308092226 33 X Y 13 20 14 16 8.3 8.3 24 24 XY1320141609092424 34 X Y 13 17 10 11 347 22 24 XY1317101106072224 65 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7 (8) (9) (10) (11) (12) 35 X Y 16 17 14 14 6.3 23 26 XY161714146.3092326 36 X Y 12 22 10 11 22 25 XY1222202207092326 37 X Y 16 20 12 16 21.2 26 XY16201216070921.226 38 X Y 15 15 13 15 22 23 XY1515131506072223 39 X Y 13 16 14 15 19 21 XY1316141506081921 40 X Y 15 16 12 16 21 24 XY1516121607092124 41 X Y 16 17 13 14 23 26 XY1617131406072326 42 X Y 10 13 11 12 22 24 XY1013111205072224 43 X Y 13 25 12 17 24 25 XY1325121705062425 44 X Y 15 15 13 14 9 18 23 XY1515131409091823 45 X Y 12 16 13 15 9.3 23 23 XY12161315069.32323 46 X Y 15 17 12 14 9 22 23 XY1517121409092223 47 X Y 15 18 10 10 22 24 XY1518101007092224 48 X Y 13 15 15 16 19 21.2 XY1315151607091921.2 49 X Y 15 16 11 14 9 22 22 XY1516111409092222 50 X Y 14 20 11 12 9.3 19 26 XY14201112099.31926 51 X Y 13 15 10 13 10 18 25 XY1315101306101825 52 X Y 14 15 11 15 19 25 XY1415111508091925 53 X Y 16 19 11 13 20 23 XY1619111307092023 54 X Y 12 14 14 15 23 25 XY1214141507082325 55 X Y 14 15 10 10 22 23 XY1415091008102223 56 X Y 12 23 10 11 22 22 XY1223101106082222 57 X Y 13 15 14 15 18 24 XY1315141507091824 58 X Y 15 15 10 12 22 25.2 XY1515101207092225.2 66 X Y 14 18 15 15 7 20 22 XY1418151507072022 60 X Y 15 15 12 14 10 24 25 XY1515121407102425 61 X Y 14 16 10 17 21 24 XY1416101707092124 62 X Y 16 19 12 15 21.2 23 XY16191215070921.223 63 X Y 14 16 11 13 21 22 XY1416111307082122 64 X Y 14 15 10 15 22 23 XY1415101506072223 65 X Y 15 16 13 15 21 24 XY1516131506072124 66 X Y 15 15 11 10 19 21 XY1515071109101921 (* Kiểu gen: Viết liên tục, hai chữ số cho alen) Ở mẫu ADN khơng bị biến tính bị biến tính phần, thơng tin thu từ phân tích alen locus gen tốt, khơng có trường hợp trùng kiểu gen 66 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 Đánh giá khả nhận dạng mẫu nghiên cứu Bảng 3: Tỷ lệ gen đồng hợp gen dị hợp locus gen 66 mẫu nghiên cứu D18S51 4/66 (6,06%) 93,94% D8S1179 6/66 (9,09%) 90,91% TH01 10/66 (15,15%) 84,85% FGA 5/66 (7,58%) 92,62% Các locus gen có tỷ lệ dị hợp tử cao, bước đầu đánh giá khả nhận dạng mẫu nghiên cứu tốt Bảng 4: Tần suất xuất alen (%) 1,52 (2/132)* 12,12 (16/132) 6.3 2,27 (3/132) - 0,76 (1/132)* 29,55 (37/132) 0,76 (1/132)* 8,33 (11/132) 8.3 1,52 (2/132)* - 0,76 (1/132)* 9.3 34,85 (46/132)** 5,08 (6/132) 10 0,76 (1/132)* 10.2 - 18,18 (24/132) 6,82 (9/132) - 11 - 12,12 (16/132) 12 5,30 (7/132) 12,12 (16/132) 13 13,64 (18/132) 15,15 (20/132) 13.2 - 14 15,15 (20/132) 13,64 (18/132) 15 27,27 (36/132)** 17,42 (23/132)** 16 15,15 (20/132) 5,30 (7/132) - 17 4,55 (6/132) 3,03 (4/132) 1,69 (2/132) 18 5,30 (7/132) - 3,79 (5/132) 4,55 (6/132) 0,76 (1/132)* 6,82 (9/132) 12.2 - 18.2 19 19.2 - - 67 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 (1) (2) 20 3,79 (5/132) (3) (4 3,39 (4/132) 20.2 21 1,52 (2/132) 12,88 (17/132) 21.2 22 2,54 (3/132) 2,27 (3/132) 18,18 (24/132) 22.2 23 2,27 (3/132) 0,76 (1/132)* 18,18 (24/132)** 23.2 24 - 13,64 (18/132) 24.2 25 (5 0,76 (1/132)* 11,36 (14/132) 25.2 0,76 (1/132)* 26 - 4,55 (7/132) 27 - 0,76 (1/132)* Tổng alen 14/22 alen (10+1)/12 alen 9/12 alen 14/28 alen (Ghi chú: * alen có tần số thấp nhất; ** alen có tần số cao nhất; (-) alen không thấy xuất hiện) Theo thang alen chuẩn, locus D18S51 có 22 alen khác Chúng phát 14/22 alen Trong đó, thấp alen 10, 23 25 (0,76%), cao alen 15 (27,27%) alen không phát thấy alen 8, 9, 10.2, 11, 13.2, 24, 26, 27 Đối với locus D8S1179, phát thấy 11/12 alen khác thang chuẩn Trong đó, thấp alen 7, 9, 19 (0,76%), cao alen 15 (17,42%) Không thấy alen 18, lại có alen khơng có thang alen chuẩn, alen 19 Đối với locus TH01, phát thấy 9/12 alen khác thang chuẩn Trong đó, thấp alen 8.3 (1,52%), cao alen (34,85%) alen không phát thấy alen 4, 11 13.2 Đối với locus FGA, phát 14/28 alen khác Trong đó, thấp alen 25.2 27 (0,76%), cao alen 23 (18,18%) 14 alen không phát thấy là: 16, 18.2, 19.2, 20.2, 23.2, 24.2, 28, 29, 30, 31.2, 43.2, 44.2, 45.2 46.2 Về mặt lý thuyết, tính tốn số kiểu gen quần thể theo công thức Số kiểu gen = n (n + 1)/2 [7] Trong đó, n số loại alen - Locus D18S51 nghiên cứu xuất 14 alen, có số kiểu gen 105 - Locus D8S1179 nghiên cứu xuất 11 alen, có số kiểu gen 66 - Locus TH01 nghiên cứu xuất alen, có số kiểu gen 45 - Locus FGA nghiên cứu xuất 14 alen, có số kiểu gen 105 Tổ hợp locus nói có tới 32.744.250 khả kiểu gen khác Để đánh giá khả nhận dạng cá thể, xem xét độ tin cậy xác suất trùng hợp người có kiểu gen đồng 68 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 hợp tử với alen có tần suất thấp (0,0076 alen 10 thuộc locus D18S51) alen có tần suất cao (0,3485 alen thuộc TH01) liệu thu [7]: Trường hợp 1: người có kiểu gen đồng hợp với tần suất alen 0,0076, độ tin cậy thu (1 - 0,00762) x 100% = 99,9943%, khả trùng hợp 1/0,00762, nghĩa khoảng 1.754 người có người trùng hợp kiểu gen Tuy nhiên, tỷ lệ đồng hợp tử nói chung locus khơng cao Trong 66 mẫu nghiên cứu, chưa gặp trường hợp đồng hợp tử alen 10, locus D18S51 Trường hợp 2: người có kiểu gen đồng hợp với tần suất alen 0,3845, độ tin cậy thu (1 - 0,38452) x 100% = 87,86%, khả trùng hợp 1/0,38452, nghĩa khoảng người có người trùng hợp kiểu gen Ví dụ, phân tích với alen riêng lẻ Do tỷ lệ kiểu gen đồng hợp tử locus gen không cao, kết hợp nhiều alen với nhau, khả phân biệt cao nhiều xác suất trùng hợp thấp Với số lượng mẫu lớn hơn, khoảng 200 cá thể, việc tính tốn khả phân biệt, xác suất trùng lặp tất locus cho thông tin sát với di truyền quần thể Với số lượng mẫu lớn hơn, tổ hợp kiểu gen phong phú, đa dạng nhiều, cho thấy khả sử dụng marker mini STR nhận dạng cá thể từ mẫu bị biến tính KẾT LUẬN Qua phân tích miniSTR 66 mẫu máu cá thể xử lý gây phân huỷ ADN phần thực nghiệm, rút số kết luận sau: - Đã chuẩn hóa quy trình phân tích mini-STR từ mẫu ADN bị biến tính phần - Xác định tần suất alen, tần số dị hợp tử locus gen mini STR khảo sát Phát alen số 19, khơng có thang alen chuẩn locus D8S1179 KIẾN NGHỊ Tăng số mẫu phân tích quần thể khoảng 200 người để có thơng số cho việc tính tốn độ tin cậy, khả phân biệt, xác suất trùng hợp Áp dụng phân tích mini-STR nhận dạng cá thể xác định huyết thống mẫu ADN bị biến tính trường hợp không thu thông tin sử dụng marker STR thông thường TÀI LIỆU THAM KHẢO Carracedo A and Lareu MV Proceedings of the ninth international symposium on human indentification Madison WI: Promega corporation 1998, pp.89-107 Dixon L.A, Dobbins A.E, Pulker H.K et al Analysis of artificially degraded DNA using STRs and SNPs-results of a collaborative European (EDNAP) exercise Forensic Science International 2006,164, pp.33-44 John M Butler Forensic DNA typing: Biology, Technology, and Genetics of STR Markers Second edition Academic Press London 2005 Matthew B Hamilton Population Genetics Wiley-Blackwell 2009, pp.9-49 Promega Technical Bullentin for use with DNA IQ 2011 Promega Technical manual PowerPLexS5 System 2011 Wing Kam Fung and Yue Qing Statistical DNA forensics John Wiley Sons and Ltd 2008 69 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 70 ... 1-20 14 Chính vậy, chúng tơi thực đề tài nhằm: Bước đầu xác định tần suất số alen mini STR người Việt, đánh giá khả nhận dạng cá thể qua phân tích mini STRs từ mẫu ADN bị phân huỷ phần thực nghiệm. .. mini- STR từ mẫu ADN bị biến tính phần - Xác định tần suất alen, tần số dị hợp tử locus gen mini STR khảo sát Phát alen số 19, khơng có thang alen chuẩn locus D8S1179 KIẾN NGHỊ Tăng số mẫu phân tích. .. mini STR nhận dạng cá thể từ mẫu bị biến tính KẾT LUẬN Qua phân tích miniSTR 66 mẫu máu cá thể xử lý gây phân huỷ ADN phần thực nghiệm, rút số kết luận sau: - Đã chuẩn hóa quy trình phân tích mini- STR