Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết Phân tích dòng đột biến trên carcinôm tuyến ống sớm và tiến triển ở dạ dày: Biểu hiện liên tục hay không liên tục với mục tiêu nghiên cứu này là làm sáng tỏ mức độ trùng lặp ở các dòng đột biến gen giữa nhóm carcinôm tuyến ống (TUB) sớm và tiến triển ở dạ dày.
Thơng Tin Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 PHÂN TÍCH DỊNG ĐỘT BIẾN TRÊN CARCINƠM TUYẾN ỐNG SỚM VÀ TIẾN TRIỂN Ở DẠ DÀY: BIỂU HIỆN LIÊN TỤC HAY KHÔNG LIÊN TỤC? Takahisa Nakayama*, Zhi-Qiang Ling*,**, Ken-ichi Mukaisho*, Takanori Hattori* and Hiroyuki Sugihara* TÓM TẮT Tổng quan: Điều trị triệt để carcinôm dày (GC) sớm xem góp phần làm giảm xuất độ tử vong carcinơm dày, hầu hết GC dày sớm diễn tiến tới GC tiến triển Tuy nhiên, GC sớm xem dạng thầm lặng GC, không thường diễn tiến thành GC tiến triển Mục tiêu nghiên cứu làm sáng tỏ mức độ trùng lặp dòng đột biến gen nhóm carcinơm tuyến ống (TUB) sớm tiến triển dày Phương pháp: Kỹ thuật hóa mơ miễn dịch p53 (HMMD) thực 28 ca phẫu thuật cắt dày 13 ca TUB niêm mạc 15 ca TUB xâm lấn Bằng phương pháp di truyền phân tử tế bào có so sánh loại tế bào (CGH), số ADN so sánh vùng niêm mạc vùng xâm lấn TUB xâm lấn vùng niêm mạc TUB xâm lấn TUB niêm mạc, với tổng số ca 25 22 Đột biến gen TP53 phát exon 5-8 20 ca TUB Kết quả: CGH NST cho thấy 4q+ 11q+ thường gặp TUB tiến triển TUB sớm, thay đổi số lượng 8q 17p cho thấy khơng có khác biệt ý nghĩa TUB sớm TUB tiến triển Tuy nhiên, array CGH cho thấy, 13 ca TUB chỗ, đoạn gen MYC (MYC-) thêm đoạn gen TP53 (TP53+) phát TUB, MYC+ và/hoặc TP53- TUB Ở vùng niêm mạc TUB xâm lấn, ca cho thấy MYC-/TP53+ khơng có ca có MYC+ và/hoặc TP53- Ở vùng xâm lấn TUB, TUB (dưới niêm mạc) cho thấy MYC-/TP53+ ca (1 từ TUB niêm từ TUB tiến triển) cho thấy MYC+ và/hoặc TP53- TUB đề cập sau thường cho thấy kiểu đột biến (lan tỏa khơng biểu hiện) nhuộm hóa mơ miễn dịch p53, 4/6 ca cho thấy có đột biến giải trình tự gen TP53 Kết thu từ array CGH cho thấy vùng niêm mạc vùng xâm lấn, dòng gen tìm thấy biểu không liên tục ca TUB tiến triển liên tục ca TUB niêm mạc Kết luận: Các dòng gen thường khác biệt nhóm TUB sớm tiến triển MYC-/TP53+ MYC+ và/hoặc TP53- dấu hiệu điểm TUB thầm lặng tiến triển dày ABSTRACT LINEAGE ANALYSIS OF EARLY AND ADVANCED TUBULAR ADENOCARCINOMAS OF THE STOMACH: CONTINUOUS OR DISCONTINUOUS? Takahisa Nakayama, Zhi-Qiang Ling, Ken-ichi Mukaisho, Takanori Hattori and Hiroyuki Sugihara Background: Eradication of early gastric carcinoma (GC) is thought to contribute to reduction in the mortality of GC, given that most of the early GCs progress to the advanced GCs However, early GC is alternatively considered a dormant variant of GC, and it infrequently progresses to advanced GC The aim of this study was to clarify the extent of overlap of genetic lineages between early and advanced tubular adenocarcinomas (TUBs) of the stomach Methods: Immunohistochemical staining for p53 was performed using 28 surgically resected stomachs with * Khoa Giải Phẫu Bệnh, Trường Đại học Y khoa Shiga, thành phố Otsu, 520-2192, Nhật Bản Nhận trả lời phản hồi: sugihara@belle.shiga-med.ac.jp 192 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Thông Tin Y học 13 intramucosal and 15 invasive TUBs By chromosome- and array-based comparative genomic hybridization (CGH), genomic copy number constitution was compared between the mucosal and invasive parts of the invasive TUBs and between the mucosal parts of the invasive and intramucosal TUBs, using 25 and 22 TUBs, respectively TP53 mutation in exons 5-8 was examined in 20 TUBs Results: Chromosomal CGH revealed that 4q+ and 11q+ were more common in advanced and early TUBs, respectively, whereas copy number changes in 8q and 17p showed no significant differences between early and advanced TUBs However, array CGH revealed that, of the 13 intramucosal TUBs examined, loss of MYC (MYC-) and gain of TP53 (TP53+) was detected in TUBs and MYC+ and/or TP53- was detected in TUBs Of the mucosal samples of invasive TUBs, showed MYC-/TP53+ and none showed MYC+ and/or TP53- Of the samples from the invasive parts, (from submucosal cancers) showed MYC-/TP53+ and (1 from submucosal and from advanced cancers) showed MYC+ and/or TP53- The latter tumours commonly showed a mutant pattern (diffuse or null) in p53 immunohistochemistry, and of the tumours assessable for TP53 sequence analysis revealed mutations The overall array CGH pattern indicated that, between the mucosal and invasive parts, genetic lineage was found discontinuous in advanced cancers and continuous in submucosal cancers Conclusions: Genetic lineages often differed between early and advanced TUBs MYC-/TP53+ and MYC + and/or TP53-may be the signatures of dormant and aggressive TUBs, respectively, in the stomach TỔNG QUAN BACKGROUND Ung thư dày (GC) nguyên nhân thường gặp gây tử vong ung thư thứ hai tồn giới, xuất độ tử vong có giảm nước phát triển gần GC phân làm loại dựa hình thái học: týp tạo ống týp lan tỏa và, dựa theo giai đoạn, phân thành ung thư sớm (khu trú niêm mạc niêm mạc) ung thư tiến triển (xâm lấn đến lớp niêm sâu hơn) GC sớm xem ung thư điều trị được; GC sớm ghi nhận chuyển qua GC tiến triển sau nhiều giai đoạn giai đoạn sớm GC tiến triển Ở Nhật, GC sớm điều trị triệt để phương pháp nội soi can thiệp phẫu thuật, dựa nguyên tắc phát sớm điều trị sớm Mặt khác, vài nhà bệnh học giữ quan điểm khối u dạng ống khu trú niêm mạc phát triển chậm xâm lấn sâu Vì mà tổn thương loại gọi nghịch sản Gastric cancer remains the second most common cause of cancer-related deaths worldwide, despite a recent decrease in its mortality in developed countries [1] Gastric carcinomas (GCs) are classified morphologically into major categories: tubular-forming type and diffuse type [2,3] and, in staging, into early cancers (involving the mucosa and the submucosa) and advanced cancers (involving the muscularis propria or deeper) Early GC is considered a curable cancer [4]; it reportedly progresses to advanced GC after varying durations as an early stage of GC [5,6] In Japan, early GCs can be actively resected endoscopically as well as surgically [7], based on the principles of early detection and treatment On the other hand, some pathologists maintain that the tubular-forming neoplastic lesions that are confined to the mucosa take a long time to or are unable to invade deeper tissues Thereby, these lesions are called dysplasia [4] Gần đây, chương trình tâm sốt u ngun bào thần kinh Nhật bị đình người ta phát thấy có dòng phát sinh khơng Recently, a mass-screening program for neuroblastomas in Japan [8-10] was suspended because a discontinuous genetic lineage was Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 193 Thơng Tin Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 liên tục khối ung thư nguyên bào thần kinh khởi phát sớm khởi phát trễ U nguyên bào thần kinh khởi phát trễ/ hay chưa thể (≥ năm) cho thấy thể lưỡng bội gần đoạn tận 1p, u nguyên bào thần kinh khởi phát trẻ nhỏ cho thấy thể tam bội gần khơng đoạn 1p Nói cách khác, phân tích dựa CGH gợi ý tình trạng tăng sản tuyến khơng điển hình mức độ cao phổi tiền đề thật trình phát triển carcinôm phế quản – phế nang Ở dày, vấn đề đặt dòng gen biến đổi trùng lắp GC sớm GC tiến triển found between the early- and the late-presenting neuroblastomas Negative and late-presenting (≥ year) neuroblastomas showed near-diploidy with loss of terminal 1p, whereas positive neuroblastomas in infants showed near-triploidy without 1p deletion [11,12] On the other hand, comparative genomic hybridization (CGH)-based analysis suggested that high-grade atypical adenomatous hyperplasia in the lung is the true precursor of bronchioloalveolar carcinoma [13] In the stomach, it is a problem to what extent genetic lineage is overlapped in early and advanced GCs Trong GC týp lan tỏa, dùng CGH để chứng minh thay đổi số lượng NST carcinôm tế bào dạng nhẫn niêm mạc, cho thấy cấu trúc phân lớp di truyền phần GC biệt hóa giai đoạn tiến triển Sự diện tế bào dạng nhẫn theo phân lớp gợi ý carcinơm tế bào nhẫn tiền đề thật GC biệt hóa sau Khi phân tích dòng gen dựa CGH nhóm GC tiến triển biệt hóa khác có thành phần dạng ống khơng theo cấu trúc phân lớp phần niêm mạc, kết cho thấy GC nhóm có nguồn gốc từ thành phần biệt hóa ống khối u có biểu 17p- 8q+ bất hoạt gen TP53 wild-type đột biến, tính dị hợp tử (LOH) Để xác định trạng thái tương ứng loại GC này, chúng tơi phân tích carcinơm tuyến ống niêm mạc (TUB) CGH Những phân tích chứng minh TUB niêm mạc không cho thấy vài biến đổi NST thường gặp GC tiến triển, mà thường gặp 8q- 17p+, điểm khác biệt đáng kể GC biệt hóa tiển triển In diffuse type GCs, we used CGH to demonstrate that chromosomal copy-number alterations in the intramucosal signet-ring cell carcinomas that showed a layered structure [14] were inherited in a fraction of poorly differentiated GCs at advanced stages [15] The presence of a layered structure of signet ring cells in the mucosal parts of these advanced cancers also suggested that signet ring cell carcinomas may be a true precursor of poorly differentiated GCs CGH-based lineage analysis of another subset of poorly differentiated advanced GCs with tubular components but no layered structure in the mucosal part revealed that GCs of this subset were derived from a tubular component in a tumour and were characterized by 17p- and 8q+ [16] and inactivation of the wild-type TP53 by mutation and loss of heterozygosity (LOH) [17] In order to determine the early-stage counterpart of this type of GC, we analysed intramucosal tubular adenocarcinomas (TUBs) using CGH These studies found that the intramucosal TUBs showed not only several chromosomal changes common to advanced GCs but also frequently showed 8q- and 17p + that were critically different from advanced and poorly differentiated GCs [18] Trong nghiên cứu này, thay đổi số lượng NST gen xác định vùng niêm mạc vùng xâm lấn hàng loạt phân tích TUBs sớm tiến triển phương pháp CGH NST CGH chip Dựa liệu này, phân tích ca có dòng liên In the present study, copy-number changes of chromosomes and genes were examined in the mucosal and invasive parts of another series of early and advanced TUBs using array and chromosomal CGH Based on these data, we demonstrated cases of continuous and 194 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Thông Tin Y học tục không liên tục so sánh phần ung thư niêm mạc phần ung thư xâm lấn khối u khác phát gen TP53 MYC điểm tốt đột biến theo dòng TUB dày discontinuous lineages between intramucosal and invasive parts of individual tumours and found that TP53 and MYC may be good lineage markers for gastric TUBs PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU METHODS Ủy Ban Xét Duyệt trực thuộc Tổ chức Y khoa Trường Đại học Y khoa Shiga hỗ trợ cho việc tiến hành nghiên cứu đảm bảo bí mật liệu bệnh nhân The Institutional Review Board on Medical Ethics at Shiga University of Medical Science granted approval for conducting this research on the condition that the materials used must be anonymous Mẫu nghiên cứu Tumour samples Nghiên cứu bao gồm 28 mẫu dày toàn phần (bảng 1) với 13 ca TUB niêm mạc 15 ca xâm lấn [6 ca niêm ca tiến triển xâm lấn niêm sâu (thành phần ống khối u xác định 30%)] Mỗi mẫu dày cố định formalin vùi sáp Tất mẫu chọn ngẫu nhiên từ liệu khoa từ 1996 đến 2008 Loại mô học giai đoạn ung thư xác định dựa phân loại Ung Thư Dạ dày Nhật Bản (17) xếp loại pTNM Khi mô học đồng niêm ung thư vùng xâm lấn, phần biệt hóa vùng niêm lấy để ngăn ngừa khả tái xâm lấn lớp niêm Trong ung thư xâm lấn, mẫu DNA lấy từ vùng niêm vùng xâm lấn This study included 28 surgically resected stomachs (Table 1) with 13 intramucosal TUBs and 15 invasive TUBs [6 submucosal and advanced cancers that invaded the muscularis propria or deeper tissues (the tubular component of each tumour was assessed to be more than 30%)] Each stomach was fixed in formalin and embedded in paraffin wax These were selected at random from the materials diagnosed in our department from 1996 to 2008 Histological types and tumour stages were determined according to the Japanese Classification of Gastric Cancer [19] and pTNM staging, respectively When a mucosal histological pattern was found to be heterogeneous in an individual invasive tumour, the part with the lowest grade of atypism was taken as the mucosal sample that can prevent the possibility of reinvasion of invasive cancer cells into the mucosa In invasive cancers, DNA samples were obtained from intramucosal and invasive parts Nhuộm hóa mơ miễn dịch Immunohistochemistry Nhuộm hóa mơ miễn dịch thực với kháng thể đơn dòng protein p53 (DO-7, 1:100; Dako, Glostrup, Đan Mạch) Sau bộc lộ kháng nguyên lát mô nước cất 121oC vòng phút, phức hợp miễn dịch phát phương pháp biotin-streptavidin-peroxidase gián tiếp dùng Histofine kit (Nichirei, Tokyo, Nhật Bản) phản ứng màu diaminobenzidine Các lát mô nhuộm tương phản với hematoxylin Các lam chứng âm khơng có kháng thể thứ lam chứng dương thực đồng thời Immunohistochemical staining was performed with monoclonal antibodies to p53 protein (DO-7, 1:100; Dako, Glostrup, Denmark) After antigen retrieval of tissue sections in distilled water at 121°C for min, immunoreactivity was detected by an indirect biotinstreptavidin- peroxidase method using the Histofine Kit (Nichirei, Tokyo, Japan) and diaminobenzidine reaction The sections were counterstained with haematoxylin Slides of the negative control without the primary antibody and those of the positive control were processed in parallel Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 195 Thông Tin Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Vi phẫu tích lazer chuẩn bị DNA Laser microdissection and DNA preparation Các tế bào u ly trích từ lát cắt 5µm dùng hệ thống lazer LMD6000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Đức) Với khối u, tế bào ung thư lấy từ vùng có diện tích >3mm2, nơi tế bào ung thư có mật độ >90% Các tế bào phá hủy proteinase K 200µl/ml 70 37oC, ly trích DNA phương pháp sử dụng phenol/chloroform Tumour cells were obtained from 5- μ m-thick tissue sections using a LMD6000 laser microdissection system (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) For individual tumours, cancer cells were obtained from areas >3 mm2, where cancer cells accounted for ≥90% of the total cell count These cancer cells were digested in 200 μl of proteinase K solution at a concentration of 200 μg/ml for approximately 70 h at 37°C, followed by phenol/chloroform DNA extraction Khuếch đại toàn gen Whole genome amplification DNA mẫu khuếch đại phản ứng chuỗi đoạn mồi polymerase oligonucleotide thối hóa (DOP-PCR) qua pha, mơ tả trên, cho sản phẩm PCR có kích thước 2kb, thích hợp để đánh dấu phương pháp nick-translation phân tích CGH Để chuẩn bị cho array CGH, DNA mẫu khuếch đại cách dùng kit GenomePlex Tissue Whole Genome Amplification (WGA2 Kit; Sigma, St Louis, USA) Với mẫu DNA không đủ để khuếch đại, thay WGA5 Kit (Sigma) Sample DNA was amplified using degenerate oligonucleotide- primed polymerase chain reaction (DOP-PCR) in phases, as described previously [20], which resulted in PCR products more than kb in size, suitable for nicktranslation labelling for CGH For array CGH, sample DNA was amplified using the GenomePlex Tissue Whole Genome Amplification Kit (WGA2 Kit; Sigma, St Louis, USA) [21] For some DNA samples that could not be sufficiently amplified, the WGA5 Kit (Sigma) was employed CGH (lai, đánh dấu DNA đoạn dò phân tích hình ảnh kỹ thuật số) CGH (hybridization, probe DNA labelling and digital image analysis) DNA tế bào ung thư DNA tế bào bình thường khuếch đại nhờ DOPPCR đánh dấu fluorescein-12-dUTP tetramethylrhodamine-5-dUTP (Roche, Mannheim, Đức), phương pháp nick translation Phương pháp lai phân tích hình ảnh thực mô tả trước Thêm số lượng DNA xác định qua tỉ số xanh/đỏ tương ứng >1.2 1.2 and 0.3219