Đang tải... (xem toàn văn)
Paclitaxel (PTX), hoạt chất phân lập từ vỏ cây thông đỏ taxus brevifolia. Hiện nay có một số chế phẩm chứa PTX dưới dạng phức chất với hydroxypropyl-β-cyclodextrin. Nghiên cứu này nhằm mục đích xây dựng phương pháp định lượng hàm lượng PTX trong chế phẩm nghiên cứu NC-10 chứa phức chất của PTXhydroxypropyl-β-cyclodextrin.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PACLITAXEL TRONG PHỨC CHẤT VỚI HYDROXYPROPYL-β-CYCLODEXTRIN CỦA THUỐC TIÊM TRUYỀN 30 mg/5 ml Nguyễn Thanh Hà*, Lương Khánh Duy**, Lê Minh Trí**, Nguyễn Thiện Hải**, Lê Nguyễn Nguyệt Minh** TÓM TẮT Mục tiêu: Paclitaxel (PTX), hoạt chất phân lập từ vỏ thông đỏ Taxus brevifolia Hiện có số chế phẩm chứa PTX dạng phức chất với hydroxypropyl-β-cyclodextrin Nghiên cứu nhằm mục đích xây dựng phương pháp định lượng hàm lượng PTX chế phẩm nghiên cứu NC-10 chứa phức chất PTXhydroxypropyl-β-cyclodextrin Phương pháp: HPLC với cột pha đảo Pentafluorophenyl-propyl L43 (250 mm x mm, µm), đầu dò PDA, bước sóng phát 227 nm, pha động: hỗn hợp nước - acetonitrile theo tỉ lệ thể tích 55:45, tốc độ dòng: 1,2 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 10 µl, nhiệt độ cột: 25 oC, chương trình gradient dung môi Kết quả: nghiên cứu cho thấy phương pháp xây dựng để kiểm nghiệm PTX chế phẩm NC-10 có tính đặc hiệu tương thích tốt Đỉnh PTX mẫu chuẩn mẫu thử ổn định với thời gian lưu tR = 11,8 ± 0,1 phút, mẫu trắng xuất pic tR >20 phút hồn tồn khơng ảnh hưởng đến kết định lượng, phương pháp có độ xác cao với RSD=1,14%, độ lập lại trung bình 100,57% (RSD=0,992%) với khoảng tuyến tính 0,1-1,32 mg/ml (phương trình hồi quy Y=17239637,68x với R2=0,9997) Như phương pháp đáp ứng yêu cầu quy trình kiểm nghiệm dược phẩm Kết luận: Kết cho thấy phương pháp áp dụng tốt để kiểm nghiệm chế phẩm chứa PTX tương tự Từ khoá: paclitaxel, HPLC, hydroxypropyl-β-cyclodextrin ABSTRACT DETERMINATION PACLITAXEL IN COMPLEX WITH HYDROXYPROPYL-β-CYCLODEXTRIN OF INFUSION 30 MG/ ML Nguyen Thanh Ha, Le Minh Tri, Nguyen Thien Hai, Luong Khanh Duy, Le Nguyen Nguyet Minh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: 368 - 373 Objectives: Paclitaxel (PTX) was originally isolated from the bark of Pacific yew tree, Taxus brevifolia Inclusion complexes of PTX and hydroxypropyl-β-cyclodextrin are in several commercially available formulations This study to aim at determination PTX’s content in complex with hydroxypropyl-β-cyclodextrine (NC-10) Methods: HPLC method for determination of PTX in a research product (NC-10) was developed: pentafluorophenyl-propyl L43 column (250 mm x mm, µm), PDA detector (227 nm), gradient mobile phase : water:acetonitrile from 55:45 to 65:35 over 20 minutes, flow rate: 1,2 ml/min, injection volumn: 10 µl, column temprature: 25 oC Results: the method demonstrated selectivity with no interfering peaks eluting near the vicinity of drug peak The peaks of PTX in the chromatograme of standard and sample are stable (Rt =11.8 ± 0.1 min), Rt of blanc is > * Viện kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh** Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS TS Lê Minh Trí ĐT: 0903718190 Email: leminhtri1099@gmail.com 368 Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học 20 The method was validated for specificity, accuracy the developed method exhibited linearity over an analytical range of 0,1-1,32 mg/ml with regression equation Y=17239637,68X (R2=0,9997, RSD=1,14%), the average repeatability is 100,57% (RSD=0,992%) Conclusion: the method demonstrated selectivity with no interfering peaks eluting near the vicinity of drug peak The method was validated for specificity, accuracy and can be apply for determination of paclitaxel content in similar pharmaceutical formulations Keywords: paclitaxel, HPLC, hydroxypropyl-β-cyclodextrin HPLC), NaCl (Merck, Đức, tinh khiết phân ĐẶT VẤN ĐỀ tích) Paclitaxel (PTX), hoạt chất phân lập từ vỏ Chất chuẩn: chuẩn làm việc paclitaxel Ý, thông đỏ Taxus brevifolia, chứng minh hàm lượng: 98,80% mang lại hiệu cao trị liệu ung thư Mẫu thử: thuốc tiêm truyền NC-01 (mẫu buồng trứng, ung thư vú, ung thư phổi ung nghiên cứu chứa paclitaxel 30 mg/5 ml dạng thư cổ tử cung PTX không hấp thu qua đường phức với hydroxypropyl-β-cyclodextrin) tiêu hoá nên sử dụng đường tiêm Mẫu giả dược: chất phụ gia, tá dược truyền tĩnh mạch Hiện có nhiều chế pha động phẩm chứa PTX thị trường thường bào chế có dung mơi trợ tan Cremophor LH40 Phương pháp nghiên cứu Một số chế phẩm khác đắt tiền chứa PTX Điều kiện sắc ký(3) dạng phức chất với hydroxypropyl-β- Cột pha đảo Pentafluorophenyl-propyl L43 cyclodextrin nhằm giảm độc tính gan (250 mm x mm, µm) Cremophor LH 40(1,2,4) Nghiên cứu nhằm - Đầu dò: PDA, bước sóng phát 227 nm mục đích xây dựng phương pháp định lượng hàm lượng PTX chế phẩm chứa phức - Pha động: hỗn hợp nước - acetonitril theo tỉ chất PTX- hydroxypropyl-β-cyclodextrin với lệ thể tích 55:45 mục tiêu sau : - Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút - Xây dựng phương pháp định lượng PTX chế phẩm tiêm truyền - Thẩm định phương pháp định lượng (tính tương thích, tính đặc hiệu, độ xác, độ đúng) theo yêu cầu ICH NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hố chất, dung mơi, máy móc trang thiết bị Trang thiết bị Máy HPLC Shimadzu đầu dò PDA, dụng cụ lọc 0,45 µm, máy ly tâm Hố chất Paclitaxel (Cty Jingi Wen, lơ 20090312, Trung Quốc) Tween 80 (Pháp, dược dụng), hydroxypropyl-β-cyclodextrin (Roquette, Pháp), Acetonitril, Ethanol tuyệt đối (Đức, dùng cho Chuyên Đề Dược Học - Thể tích tiêm mẫu: 10 µl - Nhiệt độ cột: 25 oC - Chương trình Gradient dung mơi Bảng Chương trình gradient dung mơi Thời gian (phút) Tỉ lệ acetonitril (%) 0→13 45 13→20 45→65 20→23 65 23→30 65→45 Tỉ lệ nước (%) 55 55→35 35 35→55 Tính đặc hiệu Chuẩn bị mẫu - Dung dịch mẫu thử: hút xác ml dung dịch thử (có nồng độ 30 mg PTX /5 ml) Thêm ml cồn tuyệt đối Pha loãng dung dịch với pha động thành 20 ml Dung dịch sau pha có nồng độ PTX 0,3 mg/ml lọc qua màng 0,45 µm đem định lượng 369 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 - Dung dịch chuẩn: cân xác mg PTX chuẩn, thêm ml cồn tuyệt đối Pha lỗng xác thành 20 ml pha động để thu dung dịch chuẩn có nồng độ PTX 0,3 mg/ml Dung dịch lọc qua màng 0,45 µm đem định lượng Mẫu trắng chuẩn bị mẫu thử khơng có PTX (chứa tween 80, hydroxypropyl-β-cyclodextrin, ethanol tuyệt đối, nước cất) Tiến hành phân tích mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu trắng phương pháp sắc ký lựa chọn Yêu cầu kết sắc ký đồ phân tích mẫu thử phải có đỉnh PTX mẫu chuẩn với thời gian lưu, sắc ký đồ mẫu trắng phải khơng có đỉnh PTX thời gian lưu mẫu chuẩn thử Sự tương thích hệ thống Chuẩn bị mẫu: dung dịch mẫu chuẩn dung dịch mẫu thử chuẩn bị giống Tiến hành: sắc ký lần cho mẫu chuẩn mẫu thử theo điều kiện Tính tương thích hệ thống khảo sát với thông số sắc ký: thời gian lưu (tR); diện tích đỉnh (S); số đĩa lý thuyết (N) Tính xác Mẫu chuẩn: pha tương tự để dung dịch có nồng độ PTX 0,3 mg/ml Mẫu thử: pha PTX nước cất, hydroxypropyl-β-cyclodextrin, ethanol, tween 80 để có nồng độ 0,3 mg/ml Chuẩn bị dung dịch mẫu thử có nồng độ 0,3 mg/ml Tiến hành sắc ký theo điều kiện sắc ký khảo sát - Yêu cầu: phương pháp định lượng đạt độ xác tính giá trị thống kê hàm lượng hoạt chất xác định mẫu có RSD ≤ 2% Độ Tiến hành: Để thử độ quy trình thử nghiệm, thêm lượng chất chuẩn vào mẫu thử Lượng chất chuẩn thêm vào tương đương với 80%, 100%, 120% hàm lượng hoạt chất tương ứng mẫu thử Lần lượt thực mẫu thêm 80%, 100%, 120% chất chuẩn Chuẩn bị mẫu - Dung dịch mẹ pha (0,3 mg/ml) - Dung dịch gốc pha từ dung dịch mẹ sau : hút ml dung dịch mẹ cho vào bình Tính tuyến tính khoảng xác định định mức ml, điền đầy đến vạch hỗn hợp Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: PTX hòa tan hỗn hợp theo thể tích nước – acetonitrile (50: 50) để dãy nồng độ trình bày bảng nước-ethanol (1:1), dung dịch lọc qua - Tiến hành sắc ký lần cho mẫu Ghi lại sắc ký đồ giá trị diện tích đỉnh - Xác định tương quan nồng độ diện tích đỉnh dung dịch màng 0,45 µm, đem định lượng - Dung dịch chuẩn thêm vào: PTX cân xác cho vào bình định mức 20 ml, bổ sung hỗn hợp nước : ethanol (1:1) đến vạch theo bảng - Tính tỉ lệ phục hồi lượng chất chuẩn thêm - Vẽ đường biểu diễn tương quan nồng độ diện tích đỉnh vào so với tỉ lệ phục hồi lý thuyết - Sử dụng “phân tích hồi quy” với trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa hệ số trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp phương trình hồi quy tỷ lệ phục hồi thực nghiệm nằm 370 - Yêu cầu: Phương pháp định lượng đạt độ giới hạn cho phép 98-102% tỷ lệ phục hồi lý thuyết Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 KẾT QUẢ VÀ BÀNLUẬN Nồng độ (mg/ml) Tính tương thích 0,7 0,9 1,1 1,3 Bảng Giá trị thống kê thông số sắc ký ứng với đỉnh PTX mẫu chuẩn Mẫu STD STD STD STD STD STD TB SD RSD% tR 11,507 11,489 11,541 11,623 11,666 11,697 11,587 0,087 0,750 S 5215573 5235917 5223867 5206310 5211583 5210498 5217291 108857 0,209 As 1,046 1,044 1,045 1,046 1,051 1,052 1,047 0,003 0,318 N 9256,417 9234,290 9277,664 9299,074 9315,946 9318,460 9283,642 33,783 0,364 Bảng Giá trị thống kê thông số sắc ký ứng với đỉnh PTX mẫu thử Mẫu Thử Thử Thử Thử Thử Thử TB SD RSD% tR 11,644 11,652 11,633 11,633 11,616 11,618 11,633 0,014 0,121 S 5146776 5143571 5184469 5168846 5188677 5192659 5170833 21478,49 0,415 As 1,061 1,061 1,063 1,065 1,065 1,064 1,050 0,002 0,155 N 9814,101 9810,821 9877,472 9903,311 9862,884 9896,824 9860,902 40,164 0,407 Nhận xét: độ lệch chuẩn tương đối RSD % thông sắc ký phân tích mẫu chuẩn mẫu thử < 2% Kết luận: quy trình định lượng đạt tính tương thích hệ thống quy trình định lượng hoạt chất chế phẩm Tính đặc hiệu Kết cho thấy phương pháp có tính đặc hiệu, pic PTX dung dịch mẫu chuẩn thử có tR # 11,8±0,1 phút Các pic tá dược mẫu placebo mẫu thử không ảnh hưởng đến việc định lượng PTX chế phẩm Tính tuyến tính khoảng xác định Bảng Dãy nồng độ PTX thẩm định tính tuyến tính Nồng độ (mg/ml) 0,1 0,3 0,5 Lượng cân PTX (mg) 10 15 10 Chuyên Đề Dược Học Thể tích vừa đủ (ml) 100 50 20 Nghiên cứu Y học Lượng cân PTX (mg) 14 18 22 26 Thể tích vừa đủ (ml) 20 20 20 20 + Trắc nghiệm t (phân phối Student) Giả thuyết: H0: Bj = “Hệ số Bj khơng có ý nghĩa thống kê” HA: Bj ≠ “Hệ số Bj có ý nghĩa thống kê” Nếu F < F 0,05 ⇒ chấp nhận giả thuyết H0 Nếu F > F 0,05 ⇒ chấp nhận giả thuyết HA Bảng Tương quan nồng độ diện tích đỉnh Nồng độ (mg/ml) 0,100 0,298 0,485 0,705 0,905 1,115 1,320 Diện tích đỉnh 1766212 5218124 8465164 12591484 15719650 19326958 22778857 Bảng Kết xử lý thống kê dựa vào công cụ Regression (MS – Excel) Hệ số tương quan Hệ số a Giá trị t1 hệ số a Hệ số bo Giá trị t0 hệ số bo Giá trị F Giá trị F0.05 Giá trị t0.05 0,9997 17239637,68 121,34 129930,64 1,12 14723,28 6,61 2,57 Nhận xét F = 14723,28 > F0.05 = 6,61 Vậy phương trình hồi qui có tính tương thích t0 = 1,12 < t0.05 = 2,57 Vậy hệ số bo khơng có ý nghĩa t1 = 121,34 > t0.05 = 2,57 Vậy hệ số a có ý nghĩa Phương trình hồi qui tuyến tính độ hấp thu nồng độ PTX (từ 0,1 mg/ml đến 1,3 mg/ml) mơi trường nước – acetonitrile tỉ lệ thể tích : 1, định lượng phương pháp chọn sau: Y = 17239637,68X (với R2 = 0,9997) 371 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học Kết luận: có tương quan tuyến tính nồng độ độ hấp thu paclitaxel bước sóng 227 nm khoảng nồng độ 0,1-1,3 mg/ml nước : acetonitrile theo tỉ lệ thể tích : Độ Bảng Lượng cân PTX pha dung dịch chuẩn thêm vào Ký hiệu bình STD 80% STD 100% STD 120% Tính xác Bảng Kết khảo sát độ xác mẫu thử PTX Mẫu Thử Thử Thử Thử Thử Thử TB SD RSD% S 5038351 5006389 5000658 5021361 5123997 5126538 5052882,33 57578,15 1,14 PTX (mg) 9,6 12,0 14,4 - Tiến hành thêm chuẩn vào dung dịch gốc bảng Bảng Lượng chuẩn thêm vào dung dịch gốc Lượng thêm vào so với nồng độ bình gốc Bình mẹ (ml) STD 80% (ml) STD 100% (ml) STD 120% (ml) Nước - ethanol (1:1) (ml) vừa đủ Nhận xét: Kết giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD =1,14% < 2% Vậy quy trình định lượng paclitaxel chế phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao đạt yêu cầu độ xác quy trình kiểm nghiệm dược phẩm 80% 100% 120% 0 2 0 5 - Ứng với hàm lượng chuẩn thêm vào có bình pha, dung dịch lọc qua màng 0,45 µm - Tiến hành sắc ký mẫu thêm chuẩn mẫu lần lấy trung bình mẫu từ bình dung dịch gốc Bảng 10 Kết thử nghiệm độ phương pháp Tỷ lệ chất chuẩn Lượng chất chuẩn thêm Lượng lý thuyết Lượng tìm thấy Tỷ lệ phục hồi thêm vào (%) vào (mg) (mg) (mg) (%) 80 100 120 0,096 0,212 0,215 101,42 0,096 0,212 0,213 100,47 0,096 0,212 0,214 100,94 0,12 0,236 0,232 98,31 0,12 0,236 0,240 101,69 0,12 0,236 0,236 100,00 0,144 0,26 0,261 100,38 0,144 0,26 0,262 100,77 0,144 0,26 0,263 101,15 Tỷ lệ phục hồi lý thuyết (%) Kết thống kê - Tỷ lệ phục hồi TB: 100,57% - SD: 0,998 - RSD: 0,992% 98 - 102 Ghi : diện tích pic kết trung bình lần đo - Tỷ lệ phục hồi TB: 99,34% - SD: 0,998 - RSD: 0,992% mẫu khoảng cho phép (100% ± 2%) Vậy phương pháp định lượng Paclitaxel phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao đạt yêu cầu độ Nhận xét: Kết cho thấy độ phục hồi 372 Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học Hình Sắc ký đồ mẫu chuẩn paclitaxel mẫu thử Hình Sắc ký đồ mẫu trắng chứa tá dược KẾT LUẬN VÀ BÀN LUẬN Kết nghiên cứu cho thấy phương pháp xây dựng để kiểm nghiệm PTX chế phẩm nghiên cứu NC-10 có tính đặc hiệu tương thích tốt Đỉnh PTX mẫu chuẩn mẫu thử ổn định với tR = 11,8 ± 0,1 phút, mẫu trắng xuất pic tR > 20 phút hồn tồn khơng ảnh hưởng đến kết định lượng, phương pháp có độ xác cao với RSD = 1,14%, độ lập lại trung bình 100,57% (RSD = 0,992%) với khoảng tuyến tính 0,1-1,32 mg/ml (phương trình hồi quy y = 17239637,68x với R2 = 0,9997) Như phương pháp đáp ứng yêu cầu quy trình kiểm nghiệm dược phẩm Chun Đề Dược Học Nghiên cứu có mục đích xây dựng phương pháp kiểm nghiệm chế phẩm PTX dạng tạo phức hồ tan với hydroxypropyl-βcyclodextrin NC-10 nhóm tác giả nhằm chuẩn bị hoàn chỉnh cho đề tài nghiên cứu bào chế thuốc tiêm truyền chứa PTX hoà tan khơng dùng chất trung gian hồ tan gây độc tính gan Kết cho thấy phương pháp áp dụng tốt để kiểm nghiệm chế phẩm chứa PTX tương tự TÀI LIỆU THAM KHẢO Hamada H, Ishihara K, Masuoka N, Mikuni K, Nakajima N (2006), “Enhancement of water-solubility and bioactivity of paclitaxel using modified cyclodextrins”, Journal of Bioschience and Bioenginerring, 102(4), 369-371 Strickley RG (2004), “Solubilizing excipients in oral and injectable formulations”, Pharmaceutical Research, 21(2), 201- 230 United State Pharmacopoeia (USP34-NF29) (2012), CD-ROM Stella V, Mathew A (1990), “Derivatives of taxol, pharmaceutical compositions thereof and methods for the preparation thereof”, United States Patent, US 960 790 Ngày nhận báo: 14.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 27.12.2012 Ngày báo đăng: 10.03.2014 373 ... - Xây dựng phương pháp định lượng PTX chế phẩm tiêm truyền - Thẩm định phương pháp định lượng (tính tương thích, tính đặc hiệu, độ xác, độ đúng) theo yêu cầu ICH NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP... phát 227 nm mục đích xây dựng phương pháp định lượng hàm lượng PTX chế phẩm chứa phức - Pha động: hỗn hợp nước - acetonitril theo tỉ chất PTX- hydroxypropyl- β- cyclodextrin với lệ thể tích 55:45... đích xây dựng phương pháp kiểm nghiệm chế phẩm PTX dạng tạo phức hồ tan với hydroxypropyl- cyclodextrin NC-10 nhóm tác giả nhằm chuẩn bị hoàn chỉnh cho đề tài nghiên cứu bào chế thuốc tiêm truyền