Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu với mục tiêu nhằm mô tả đặc điểm dấu ấn miễn dịch, bất thường về di truyền tế bào trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho người lớn trước và sau điều trị. Nghiên cứu thực hiện bệnh nhân chẩn đoán bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL) người lớn từ 12/2009 đến 08/2012 tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Nghiên cứu Y học ĐẶC ĐIỂM DẤU ẤN MIỄN DỊCH VÀ DI TRUYỀN TẾ BÀO TRƯỚC VÀ SAU ĐIỀU TRỊ BỆNH BẠCH CẦU CẤP DỊNG LYMPHO NGƯỜI LỚN Huỳnh Văn Mẫn*, Phan Thị Xinh*, Nguyễn Phương Liên*, Nguyễn Hà Thanh**, Nguyễn Tấn Bỉnh* TĨM TẮT Mục tiêu: Mơ tả đặc điểm dấu ấn miễn dịch, bất thường về di truyền tế bào trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho người lớn trước và sau điều trị. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: bệnh nhân chẩn đoán bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL) người lớn từ 12/2009 đến 08/2012 tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP HCM có làm các xét nghiệm miễn dịch và di truyền trước và sau điều trị; phương pháp mơ tả loạt ca. Kết quả: 28 bệnh nhân có làm đầy đủ các xét nghiệm miễn dịch và di truyền trước và sau điều trị, tỷ lệ BBCDL T là 32%, tỷ lệ BBCDL B là 68%, tỷ lệ BBCDL Ph+ là 32%. Tỷ lệ chuyển vị t(4;11) và hoặc MLL‐ AF4+ là 11%, t(1;19) và hoặc E2A‐PBX1+ là 0%, t(12;21) và hoặc TEL/AML+là 0%. Sau điều trị, nhóm Ph+: 5 bệnh nhân cả FISH và RT‐PCR đều âm tính, 2 bệnh nhân FISH âm nhưng RT‐PCR còn dương yếu, 2 bệnh nhân chưa đánh giá sau điều trị; nhóm Ph‐: Tồn lưu tế bào ác tính sau giai đoạn tấn cơng (MRD‐ minimal residual disease): 0,003%‐1.014% tùy vào loại LAP (leukemic associated phenotyping). Ba bệnh nhân có MLL‐ AF4+ được xét nghiệm lại RT‐ PCR sau điều trị cho kết quả âm tính 2 bệnh nhân. Kết luận: Nghiên cứu bước đầu cho thấy kỹ thuật miễn dịch và di truyền giúp ích nhiều cho q trình chẩn đốn, phân loại và theo dõi điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho. Từ khóa: kỹ thuật miễn dịch, di truyền tế bào ABSTRACT IMMUNOPHENOTYPING AND GENETIC FEATURES BEFORE AND AFTER TREATMENT ADULTS ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA Huynh Van Man, Phan Thi Xinh, Nguyen Phuong Lien, Nguyen Ha Thanh, Nguyen Tan Binh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 132 ‐ 136 Objective: The description of immunophenotyping and genetic abnormalities in the adult acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients before and after treatment. Subjects and Methods: Patients diagnosed with adult ALL from 12/2009 to 08/2012 at the Blood Transfusion and Hematology Hospital of HCMC have to do tests mmunophenotyping and genetic before and after treatment; method described case series Results: 28 patients have made full immunophenotyping and genetics before and after treatment, the proportion of T‐ ALL was 32%, the proportion of B‐ALL was 68%, the proportion of Ph + ALL was 32%. The rate of t (4; 11) and or MLL‐AF4 + was 11%, t (1; 19) and or E2A‐PBX1 + was 0%, t (12; 21) and or TEL‐ AML + was 0%. After treatment, the Ph + group: 5 patients both FISH and RT‐PCR were negative, 2 patients with negative FISH, RT‐PCR weak positive, 2 patients have not evaluated; Ph‐ *Bệnh viện Truyền máu ‐ Huyết học ** Bộ môn Huyết học ‐ Truyền máu, Đại học Y Hà Nội Tác giả liên lạc: ThS. BS. Huỳnh Văn Mẫn ĐT:0975 449 818 Email: huynhvanman@yahoo.com 133 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 groups: MRD (minimal residual disease) after the induction phase: 0, 003% ‐1,014% depending on the type of LAP (leukemic associated phenotyping); Three patients with MLL‐AF4 + after treatment gave negative results for 2 cases. Conclusion: The study initially showed immunophenotyping and genetics much help for the diagnosis, classification and monitoring the treatment of ALL. Keywords: immunophenotyping, genetic ĐẶT VẤN ĐỀ ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL) là một rối loạn ác tính của tế bào đầu dòng lympho B và T. Cũng giống như các bệnh máu ác tính khác, khảo sát những bất thường nhiễm sắc thể (NST), gen và dấu ấn miễn dịch tại thời điểm chẩn đoán rất quan trọng cho phân loại dòng, phân nhóm tiên lượng, giúp lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp và là dấu ấn để theo dõi tồn lưu tế bào ác tính trong q trình điều trị (4). Tại Bệnh viện truyền máu ‐ huyết học TP HCM, chúng tôi tiến hành khảo sát các bất thường nhiễm sắc thể và gen bằng phương pháp FISH (Fluorescence in situ hybridization) và RT‐PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction), đặt biệt là nhiễm sắc thể Philadelphia (Ph+) trong BCCDL B để chọn phác đồ điều trị và theo dõi điều trị. Đối với trường hợp BCCDL B Ph‐ và BCCDL T thì chúng tơi theo dõi bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy (Flow cytometry‐ FCM). Thiết kế nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu tổng qt Mơ tả đặc điểm dấu ấn miễn dịch, bất thường về di truyền tế bào trong bệnh BCCDL người lớn trước và sau điều trị. ‐Mục tiêu cụ thể + Mô tả đặc điểm dấu ấn miễn dịch bệnh BCCDL người lớn trước và sau điều trị trong nhóm nghiên cứu. + Mơ tả đặc điểm bất thường về di truyền tế bào trong BCCDL người lớn trước và sau điều trị trong nhóm nghiên cứu. Chun Đề Truyền Máu – Huyết Học Mơ tả loạt ca. Đối tượng nghiên cứu + Tiêu chuẩn chọn bệnh Bệnh nhân được chẩn đốn BCCDL người lớn từ 09/2009 đến 07/2012 tại BV TMHH TP HCM thỏa các tiêu chuẩn: ‐ Có làm các xét nghiệm dấu ấn miễn dịch, sinh học phân tử ‐ Điều trị đặc hiệu theo phác đồ GRAALL 2005 + Tiêu chuẩn loại trừ ‐ Không điều trị đặc hiệu theo phác đồ GRAALL 2005 ‐ Không làm các xét nghiệm dấu ấn miễn dịch, sinh học phân tử Phương pháp nghiên cứu Thu thập số liệu dựa vào hồ sơ bệnh án trước và sau điều trị. Tiêu chuẩn đánh giá đánh giá lui bệnh dựa vào tiêu chuẩn của Hiệp hội chống ung thư quốc tế –UICC/WHO bằng lâm sàng, huyết‐tủy đồ, xét nghiệm nhiễm sắc thể (FISH), và RT‐PCR, xét nghiệm tồn lưu tế bào ác tính bằng kỷ thuật tế bào dòng chảy. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu Sử dụng phần mềm vi sinh SPSS 16.0 FOR WINDOW để xử lý và phân tích số liệu, với độ tin cậy 95%, ngưỡng P = 0.05 được chọn có ý nghĩa thống kê. 134 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 KẾT QUẢ Tổng cộng 28 bệnh nhân, tuổi bệnh nhân trong nhóm nghiên cứu từ 17‐59, trung bình 36 tuổi. Tỷ lệ nam: nữ là 1:1. Đặc điểm FISH và RT‐PCR ‐ Có 9 bệnh nhân (32%) có nhiễm sắc thể Philadelphia (+), RT‐PCR cho kết quả 6 bệnh nhân biểu hiện Minor BCR‐ABL (e1a2), 2 bệnh nhân biểu hiện Major BCR‐ABL (b3a2), 1 bệnh nhân biểu hiện cả Major BCR‐ABL (b2a2) và Minor BCR‐ABL (e1a2). ‐ 3 bệnh nhân (11%) có t (4;11), một bệnh nhân đa bội, một bệnh nhân có 3 NST 21, một bệnh nhân có 4 NST12 và 4 NST 21. ‐ 13 bệnh nhân còn lại chưa phát hiện bất thường. Bảng 1: kết quả sinh học phân tử Mã Giới Tuổi Kết lúc chẩn đoán bệnh nhân FISH RT-PCR: BCR-ABL BN Nam 35 Ph+ Minor (e1a2) BN Nam 55 Ph+ Minor (e1a2) BN Nữ 21 Ph+ Minor (e1a2) BN Nữ 49 Ph+ Major (b3a2) BN Nữ 25 Ph+ Minor (e1a2) BN Nữ 41 Ph+ Minor (e1a2) BN Nữ 28 Ph+ Minor (e1a2) BN Nam 54 Ph+ Major (b3a2) BN Nam 58 Ph+ Major Minor (e1a2 b2a2) BN 10 Nữ 51 NST 21 (-) (12,5%) BN 11 Nữ 42 t (4;11) MLL-AF4 (+) BN 12 Nam 41 4NST 12,21 BN 13 Nữ 36 t (4;11) MLL-AF4 (+) BN 14 Nữ 54 t (4;11) MLL-AF4 (+) BN 15 Nam 19 Đa bội Kết sau điều trị FISH RTPCR Ph(-) Ph(-) Ph(-) Ph- (+) yếu Ph(-) Ph- (+) yếu Ph(-) Chưa làm Chưa làm Tử vong (-) (-) Chưa làm (-) (-) (-) (+) Chưa làm Đặc điểm dấu ấn miễn dịch 135 Kết lúc chẩn đoán Pre-B Pre-B Mã bệnh Giới Tuổi Kết lúc Kết sau điều nhân chẩn đoán trị (MRD) BN Nữ 21 Pre-B/ CD 33+ Không làm BN Nữ 49 Common B Không làm BN Nữ 25 Common B Không làm BN Nữ 41 Common B Không làm BN Nữ 28 Common B Không làm BN Nam 54 Common B Không làm BN Nam 58 Common B Không làm BN 10 Nữ 51 Pro-B Tử vong sau công BN 11 Nữ 42 Pro-B 0.002% 0.010 % BN 12 Nam 41 Common B 0.005% 0.038% BN 13 Nữ 36 Mature B Tử vong sau công BN 14 Nữ 54 Mature 0,013 1,42% B/CD13+ BN 15 Nam 19 Common B 0,007 0,026% BN 16 Nam 33 Pre-T 0,001 0,002% BN 17 Nam 34 Common T 0,001 0,005% BN 18 Nữ 32 Pre-T 0,002 0,031% BN 19 Nam 29 Common T 0,003 0,042% BN 20 Nam 17 Common T 0.002% 0.024% BN 21 Nữ 24 Common B 0.014% 0.59% BN 22 Nam 23 Common T 0.005% 0.024 % BN 23 Nam 24 Common T 0.003% 0.016% BN 24 Nữ 23 Common B 0,004 0,041% BN 25 Nam 47 Early T 0% 0.003% BN 26 Nữ 59 Common T 0.045% 1.014% BN 27 Nữ 37 Common B Chưa làm BN 28 Nam 22 Commom B Chưa làm Bảng 3: phân loại dưới nhóm theo dấu ấn miễn dịch (DAMD) Phân loại DAMD Pro-B Common B Pre-B Mature B Pre-T Early T Common T Số bệnh nhân N=28 12 2 Tỷ lệ 7% 43% 11% 7% 7% 4% 21% Phân lớn bệnh nhân dòng B là Common B và dòng T là Common T Bảng 4: Tồn lưu tế bào ác tính dựa vào FCM Bảng 2: kết quả dấu ấn miễn dịch Mã bệnh Giới Tuổi nhân BN Nam 35 BN Nam 55 Nghiên cứu Y học Kết sau điều trị (MRD) Không làm Khơng làm Tồn lưu ác tính (MRD) < 0,01% (nguy thấp) 0,01-0,1% (nguy thấp) 0,1-1% (nguy trung bình) Số bệnh nhân N=15 Tỷ lệ 20% 60% 6,7% Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Nghiên cứu Y học ≥1% (nguy cao) 13,3% Sau điều trị, tồn lưu tế bào ác (minimal residue disease – MRD) tính dựa vào FCM chỉ thực hiện ở bệnh nhân Ph‐ và kết quả chủ yếu ở nhóm nguy cơ thấp. BÀN LUẬN * Trong nghiên cứu của chúng tôi, tất cả bệnh nhân BCCDL B đều làm RT‐PCR 4 tổ hợp gen: BCR/ABL, E2A/PBX1, MLL/AF4 và TEL/AML1; FISH 1 trong 4 chuyển đoạn t(9;22), t(1;19), t(4;11), t(12;21) tương ứng để khẳng định thêm. Bệnh nhân BCCDL T chúng tôi chưa triển khai kỹ thuật sinh học phân tử vì những đột biến ở dòng T tần suất thấp và phức tạp. Về nhiễm sắc thể đồ, do kỹ thuật chưa hoàn chỉnh nên nhiều trường hợp cấy khơng mọc vì vậy chúng tơi khơng nêu kết quả ở đây. Kỹ thuật real time PCR đánh giá sau điều trị chúng tôi chưa triển khai được. Tỷ lệ nhiễm sắc thể Ph+ khoảng 32%, tỷ lệ t(4;11) khoảng 11%, tương đương với các nghiên cứu khác và y văn(1,2,4). Vì số mẫu còn nhỏ nên chúng tơi chưa gặp trường hợp nào t (1; 19) và t (12; 21). Theo y văn tỷ lệ t(9;22) (ph+) khoảng 25‐30%, t(4;11) khoảng 3‐7%, t (1; 19) khoảng 2‐3% và t (12; 21) khoảng 0‐3%(8,4). Tình trạng đa bội và các bất thường khác chúng tơi chưa khảo sát bằng nhiễm sắc thể đồ cho tất cả các trường hợp. Sau điều trị, trong 9 bệnh nhân Ph+: 7 bệnh nhân lui bệnh hồn tồn về huyết tủy đồ, nhưng bảy bệnh nhân FISH âm, 2 bệnh nhân RT‐PCR còn dương, 2 bệnh nhân chưa hồn tất điều trị nên chưa đánh giá, 3 bệnh nhân có t(4;11) dương cũng lui bệnh hồn tồn về huyết tủy đồ, có 2 bệnh nhân FISH va RT‐PCR âm, một bệnh nhân FISH âm, tuy nhiên RT‐PCR còn dương. * Ứng dụng của kỹ thuật MFC trong việc phát hiện MRD ở những bệnh nhân bệnh BCCDL đạt lui bệnh về hình thái nhờ vào việc xác định những kiểu dấu ấn bất thường được gọi là những kiểu hình dấu ấn miễn dịch (DAMD) liên quan đến bệnh bạch cầu gọi tắt là Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học LAP (Leukemia‐associated phenotypes), chỉ hiện diện trên tế bào bạch cầu ác tính và khơng hiện diện hoặc hiện diện khơng thường xun trên tế bào tạo máu bình thường. Kỹ thuật MFC cho phép phát hiện 1 tế bào ác tính/10.000 tế bào tuỷ xương bình thường(5,7,6,9). Dựa vào các phương pháp luận khác nhau, người ta phân loại LAP như sau: kháng ngun khác dòng (cross‐lineage), sự biểu hiện kháng nguyên không đồng bộ (asynchronous), sự hiện diện quá mức (overexpression), sự vắng mặt một kháng nguyên đặc hiệu của dòng (antigen absent expression), kháng nguyên lạc chỗ (etopic antigen expression), kiểu phát xạ bất thường (aberrant light‐scatter patters)(5,7,6,9). Theo khảo sát của chúng tôi, tỷ lệ BCCDL B là 68%, BCCDL T là 32%, và tỷ lệ dưới nhóm tương với các nghiên cứu khác(3,6,9,4). Sau điều trị, 9 trường hợp Ph+ chúng tơi khơng khảo sát tồn lưu ác tính bằng tế bào dòng chảy, vì những trường hợp này đã được khảo sát bằng FISH và RT‐PCR. Có 2 trường hợp tử vong trong giai đoạn tấn công. Hai trường hợp chưa hồn tất điều trị nên chưa khảo sát tồn lưu ác tính. Có 15 trường hợp được khảo sát tồn lưu ác tính bằng kỷ thuật tế bào dòng chảy cho thấy 20% thuộc nhóm nguy cơ rất thấp, 60% thuộc nhóm nguy cơ thấp, 6,7% thuộc nhóm nguy cơ trung bình, 13,3% thuộc nhóm nguy cơ cao, khơng khác biệt so với các nghiên cứu khác(5,7,6). Vì có độ nhạy cao, kỹ thuật PCR vẫn đang là cơng cụ chính để phát hiện số lượng nhỏ tế bào MRD hiện nay. KẾT LUẬN Nghiên cứu bước đầu cho thấy kỹ thuật miễn dịch và di truyền giúp ích nhiều cho q trình chẩn đốn, phân loại và theo dõi điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho. Chúng tơi đề nghị hồn thiện kỷ thuật nhiễm sắc thể đồ, triển khai kỷ thuật real time PCR và nghiên cứu số mẫu lớn hơn, theo dõi thời gian sống, thời gian tái phát, để hoàn thiện hơn kỹ thuật sinh học 136 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 phân tử và dấu ấn miễn dịch phục vụ cho cơng tác chẩn đốn và điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho. TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Thị Vinh An, Phạm Quang Vinh (2011), “Các bất thường tế bào di truyền ở bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho tại bệnh viện Bạch Mai”, Y học thực hành (783), số 9/2011, tr 121‐ 123. Elia L, Mancini M, Moleti L, et al (2003), “A multiplex reverse transcriptase‐polymerase chain reaction strategy for the diagnostic molecular screening of chimeric genes: a clinical evaluation on 170 patients with acute lymphoblastic leukemia”, Haematologica,, 88 (3): 275‐279. Nguyễn Triệu Vân, Đỗ Trung Phấn, Nguyễn Anh Trí và cộng sự (2006), “Ứng dụng phương pháp miễn dịch trong chẩn đoán phân loại một số thể bệnh của lơ xê mi cấp”, Y học thực hành, 545, tr 90‐102. Pui CH, McGraw‐Hill (2006), William Hematology, chapter 91, 7th Edition, pp1321‐1342. Roshal M, Fromm JR, Winter S, Dunsmore K, Wood BL (2010), “Immaturity associated antigens are lost during induction for T cell lymphoblastic leukemia: implications for minimal residual disease detection”, Cytometry B Clin Cytom, 78 (3): 139‐146. Nghiên cứu Y học San Miguel JF, Ciudad J, Vidriales MB, Orfao A, Lucio P, Porwit‐MacDonald A, Gaipa G, van Wering E, van Dongen JJ (1999), “Immunophenotypical detection of minimal residual disease in acute leukemia”, Crit Rev Oncol Hematol; 32 (3): 175‐185. Shao H, Yuan CM, Xi L, Raffeld M, Morris JC, Janik JE, Stetler‐Stevenson M (2010), “Minimal residual disease detection by flow cytometry in adult T‐cell leukemia/lymphoma”, Am J Clin Pathol, 133 (4): 592‐601. Van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA, et al (1999), “Standardized RT‐PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Report of the BIOMED‐1 Concerted Action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia”, Leukemia, 13 (12): 1901‐1928. Vidriales MB, Perez JJ, Lopez‐Berges MC, Gutierrez N, Ciudad J, Lucio P, Vazquez L, Garcia‐Sanz R, del Canizo MC, Fernandez‐Calvo J, Ramos F, Rodriguez MJ, Calmuntia MJ, Porwith A, Orfao A, San‐Miguel JF (2003), “Minimal residual disease in adolescent (older than 14 years) and adult acute lymphoblastic leukemias: early immunophenotypic evaluation has high clinical value”, Blood, 101 (12): 4695‐4700. Ngày nhận bài báo: 15 tháng 8 năm 2013 Ngày phản biện: 04 tháng 9 năm 2013 Ngày bài báo được đăng: 22 tháng 10 năm 2013 137 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học ... tả đặc điểm dấu ấn miễn dịch, bất thường về di truyền tế bào trong bệnh BCCDL người lớn trước và sau điều trị. ‐Mục tiêu cụ thể + Mô tả đặc điểm dấu ấn miễn dịch bệnh ... dịch bệnh BCCDL người lớn trước và sau điều trị trong nhóm nghiên cứu. + Mơ tả đặc điểm bất thường về di truyền tế bào trong BCCDL người lớn trước và sau điều trị trong nhóm nghiên cứu. ... phân tử và dấu ấn miễn dịch phục vụ cho cơng tác chẩn đốn và điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho. TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Thị Vinh An, Phạm Quang Vinh (2011), “Các bất thường tế bào di truyền ở bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho tại