CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -ĐHQG -HCM Cán hướng dẫn khoa học: GS TS Đống Thị Anh Đào Cán chấm nhận xét 1: PGS.TS Phạm Văn Hùng Cán chấm nhận xét 2: TS Tôn Nữ Minh Nguyệt Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP HCM ngày 12 tháng 01 năm 2017 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: Chủ tịch Hội đồng: PGS.TS Đồng Thị Thanh Thu Phản biện : PGS.TS Phạm Văn Hùng : TS Tôn Nữ Minh Phản biện Nguyệt : PGS.TS Phan Ngọc Hòa :TS Trần Thị ủy viên Ngọc Yên ủy viên, thư ký Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khỉ luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HỊA XÃ HỘI CHÚ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên : Trịnh Thị Thừa Ân Ngày, tháng, năm sinh: 29/03/1992 Nơi sinh: TP Hồ Chí Minh : Cơng nghệ thực phẩm Chuyên ngành MSHV : 7141006 Mã số : 60540101 I TÊN ĐỀ TÀI: Trích ly thu nhận Glycosaminoglycans từ sụn ức gà enzyme papain II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Tổng quan tài liệu nguyên liệu sụn ức gà enzyme dùng việc thủy phân - Phân tích số thành phần hóa học sụn ức gà - Thiết lập quy trình cơng nghệ trích ly, thu nhận glycosaminoglycans từ sụn ức gà - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng glycosaminoglycans thu nhận trình xử lý nguyên liệu, thủy phân, từ sụn ức gà - Tối ưu hóa q trình xử lý nhiệt sụn ức gà trình thủy phân sụn ức gà bang enzyme papain III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 04/07/2016 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 04/12/2016 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: GS TS Đống Thị Anh Đào Tp HCM, ngày 03 tháng 01 năm 2017 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) (Họ tên chữ ký) TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Để hồn thành tốt cơng trình nghiên cứu này, lời xin chân thành cảm ơn Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Kỹ thuật hóa học, Trường Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn thời hạn Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Bộ môn Công nghệ thực phẩm truyền đạt kiến thức bổ ích giải đáp thắc mắc suốt thời gian học vừa qua Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn tri ân sâu sắc đến cô GS.TS Đống Thị Anh Đào giao cho đề tài này, dẫn tận tình, định hướng rõ ràng để tìm phương pháp giải vấn đề cách khoa học hiệu Tôi xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Ngun - Quản lý phòng thí nghiệm B10 tạo điều kiện sở vật chất, trang thiết bị để tơi tiến hành thí nghiệm luận văn Bên cạnh đó, tơi xin cảm ơn anh chị, bạn học viên cao học, em sinh viên khóa KI 1, KI2 gắn bó giúp đỡ nhiều Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè thân hữu hỗ trợ, khích lệ tinh thần bên cạnh tơi lúc khó khăn Kính chúc sức khỏe đến q thầy cơ, gia đình bạn bè Trân trọng cảm ơn! TP Hồ Chí Minh, ngày 03 tháng 01 năm 2017 Học viên thực Trịnh Thị Thừa Ân TÓM TẮT Glycosaminoglycans (GAGs) hợp chất thiên nhiên, tham gia vào hoạt động cấu tạo mơ sụn, thu nhận từ mơ sụn động vật cá mập, heo, bò, gà, Trong GAGs chứa Chondroitin sulfate (CS) có tác dụng phòng ngừa hỗ trợ điều trị bệnh khớp Do việc trích ly thu nhận GAGs từ nguồn phụ phẩm ngành công nghiệp giết mổ gia súc, gia cầm cần thiết nhằm thay hàng ngoại nhập Kết thu sau tối ưu yếu tố trình xử lý nhiệt nguyên liệu 8Ố°C 21 phút trình thủy phân sụn ức gà enzyme papain pH = 7,1; hàm lượng enzyme/cơ chất = 0,62% w/wpro; nhiệt độ = Ố5°C; thời gian = 230 phút hàm lượng GAGs đạt 14,43% so với chất khô nguyên liệu Chế phẩm GAGs sấy khô kiểm tra HPLC cs chiếm khoảng 56,17% hàm lượng cs có ửong sụn ức gà đạt 8,11% tính theo chất khô sụn Khối lượng phân tử chế phẩm GAGs đạt 256,9 kDa Thành phần hóa học chế phẩm GAGs đạt với ẩm 12,2%; protein 8,42%; lipid 0%; tro 10,03%; carbohydrate 69,35% Từ khóa: Glycosaminoglycans,Chondroitin sulfate, papain, sụn ức gà, thủy phân ABSTRACT Glycosaminoglycans (GAGs) is a natural biocompound which joint to construct cartilage tissuses, it can be extracted from sharks, pigs, cows, chickens, ect GAGs has contented of Chondroitin sulfate (CS) which is a supplement of functional food used for preventing and supporting treatment of arthritis Therefore, GAGs extraction containing cs from byproducts and waste sources of the industry of cattle and poultry slaughter is necessary to substitute the exported material After optimizing factors of the material is heat treated at 86°c for 21 minutes and chicken keel hydrolysis by papain to obtain GAGs with pH at 7,1, ratio of enzyme content and substances at 0,62% w/wpo, temperature at 65°c and hydrolysis time of 230 minutes, GAGs content is obtained at 14,43% dry weight of raw material Analyses revealed that 56,17% of these dry preparation GAGs are cs by HPLC and cs content in chicken keel cartilage is 8,11% by dry weight cartilage Molecular weight of dry preparation GAGs is obtained at 259,6 kDa The content of chemical components of dry preparation GAGs are moisture 12,2%; protein 8,42%, lipid 0%; ash 10,03%; carbohydrate 69,35% Key words: Glycosaminoglycans, Chondroitin sulfate, papain, chicken keel cartilage, hydrolysis LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan công trình nghiên cứu thân Các kết nghiên cứu kết luận luận văn trung thực, không chép từ nguồn hình thức Việc tham khảo tài liệu liên quan trích dẫn nguồn cụ thể rõ ràng theo yêu cầu trích dẫn tài liệu tham khảo Tơi xin cam đoan! Tác giả luận văn Trịnh Thị Thừa Ân i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC HÌNH V DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ix Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Nội dung nghiên cứu 1.5 ứng dụng Chương 2: TỔNG QUAN 2.1 Sụn ức gà 2.2 Chăn nuôi Việt Nam 2.2.1 Tình hình chăn ni gà Việt Nam 2.2.2 Tình hình tiêu thụ thịt gà Việt Nam 2.3 Tổng quan Glycosaminoglycans 2.4 Tổng quan Chondroitin sulfate 10 2.4.1 Cấu tạo 10 2.4.2 Phân loại 11 2.4.3 Nguồn gốc 13 2.4.4 Chức 14 ii 2.5 Tổng quan enzyme protease 16 2.5.1 Khái quát protease 16 2.5.2 Sử dụng enzyme papain để thủy phân sụn ức gà 18 2.6 Tình hình nghiên cứu khoa học GAGs cs giới Việt Nam 19 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Vật liệu nghiên cứu 21 3.1.1 Sụn ức gà 21 3.1.2 Enzyme papain 21 3.1.3 Hóa chất dùng nghiên cứu 21 3.2 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 22 3.2.1 Dụng cụ 22 3.2.2 Thiết bị 22 3.3 Phương pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 23 3.3.2 Quy trình thủy phân sụn ức gà bang enzyme papain 24 3.3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 28 3.3.4 Phương pháp phân tích 43 3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 43 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 45 4.1 Thành phần sụn ức gà 45 4.2 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố ttong trình xử lý nhiệt sụn ức gà đến hàm lượng GAGs 46 4.2.1 Nhiệt độ trình xử lý nhiệt 46 iii 4.2.2 Thời gian trình xử lý nhiệt 48 4.2.3 Tối ưu hóa điều kiện trình xử lý nhiệt sụn ức gà 49 4.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nghiền đến hàm lượng GAGs 53 4.4 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ sụn:đệm đến hàm lượng GAGs 54 4.5 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng trình thủy phân đến hàm lượng GAGs 56 4.5.1 Khảo sát ảnh hưởng pH ửong trình thủy phân đến hàm lượng GAGs 56 4.5.2 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng E/S trình thủy phân đến hàm lượng GAGs 58 4.5.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ trình thủy phân đến hàm lượng GAGs 59 4.5.4 Khảo sát ảnh hưởng thời gian ửong trình thủy phân đến hàm lượng GAGs 61 4.5.5 Tối ưu điều kiện trình thủy phân 62 4.6 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng TCA trình kết tủa protein đến HGAGs (%) 69 4.7 Khảo sát ảnh hưởng Tỷ lệ dịch sau thẩm tích:ethanol trình kết tủa GAGs đến hàm lượng GAGs 71 4.8 Khảo sát ảnh hưởng thời gian bảo quản sụn ức gà đến hàm lượng GAGs 73 4.9 Phân tích chế phẩm GAGs thu trình nghiên cứu 74 4.9.1 Phân tích thành phần hóa học chế phẩm GAGs 74 4.9.2 Phân tích hàm lượng cs chế phẩm GAGs phương pháp HPLC 75 iv 4.9.3 Phân tích khối lượng phân tử chế phẩm GAGs phương pháp GPC 77 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79 5.1 Kết luận 79 5.2 Kiến nghị 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 PHỤ LỤC 88 A CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 88 B CÁC GIÁ TRỊ PHÂN TÍCH THỰC NGHIỆM 105 c CÁC BẢNG THỐNG KÊ 120 75 CHROMATOGRAPHY Hình 4.17: sắc ký đồ chế phẩm GAGs - HPLC Nhận xét: Từ hình 4.16 4.17 ta thấy, vị trí peak mẫu chế phẩm GAGs trùng với peak chất chuẩn chondroitin sulfate Ở sắc ký đồ chất chuẩn, chiều cao peak 2.982.215 với thời gian lưu 3,233 phút; mẫu chế phẩm GAGs có chiều cao peak 3.144.168 với thời gian lưu 3,227 phút Từ ta thấy rằng, ưong chế phẩm GAGs có chứa cs (Phụ lục B 16, B 17) Chất chuẩn tiêm vào máy có độ tinh khiết 85% Diện tích peak chất chuẩn 37.866.365 diện tích peak mẫu chế phẩm GAGs 43.170.110 Theo cơng thức tính phụ lục A.ll ta có, hàm lượng cs (%) có có chế phẩm GAGs sau: cs (%) = 43170110.80.0,85.250 37866365.196,5 (1 - 0,122) 200 ■100 = 56,17 Từ kết ửên cho thấy mẫu chế phẩm GAGs thu chứa 56,17% cs 43,83% lại thành phần khác, chứa GAG khác Hàm lượng cs có sụn ức gà tính theo cơng thức: 76 cs (%) = - = 8,11 (%) Trong đó: 56,17: Lượng cs chiếm chế phẩm GAGS 14,43: Hàm lượng GAGs có sụn (tính theo sụn khơ), từ kết đo quang với thuốc thử DMB Hàm lượng cs có sụn ức gà đạt 8,11% tính theo chất khô sụn, chế phẩm GAGs chưa trải qua q trình tinh nên hàm lượng cs thấp Hàm lượng cs đạt chế phẩm GAGs thấp kết nghiên cứu w Gamjanagoonchom cộng (2007), với hàm lượng cs sụn ức gà 14,08% [19], Hàm lượng cs có số nguyên liệu khác như: sụn cá tầm 26,51% [41], hải sâm giống p graeffei 11,00% [54], vây cá mập 9,6%, xương ức cá sấu 11,55% [19], Các nguyên liệu có giá thành cao có nguồn cung cấp hạn hẹp, sụn ức gà nguyên liệu dồi rẻ tiền Vì vậy, sụn ức gà nguồn nguyên liệu tiềm để sản xuất GAGs nói chung cs nói riêng 4.9.3 Phân tích khối lượng phân tử chế phẩm GAGs phương pháp GPC Từ kết phụ lục B 18 B 19, ta có khối lượng phân tử mẫu chế phẩm GAGs 256,9 kDa khối lượng phân tử mẫu cs thương mại 203,4 kDa Khối lượng phân tử mẫu chế phẩm lớn mẫu thương mại chế phẩm có độ tinh thấp, chứa protein thành phần khác Theo nghiên cứu X M Lou cộng (2002), GAGs từ sụn ức gà với độ tinh mẫu 75,5% có khối lượng phân tử tương ứng 48,5 kDa [20], cs ửong tự nhiên thường có khối lượng phân tử từ 50 - 200 kDa [55], Tùy thuộc vào loại nguyên liệu khác cs mà khối lượng phân tử khác [56], 77 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Trong nghiên cứu này, thiết lập quy trình cơng nghệ thu nhận GAGs từ sụn ức gà enzyme papain từ nhựa đu đủ (Carica papaya) Từ làm sở để khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân tác động tới hàm lượng GAGs xác định mức tối thích tương ứng với yếu tố ảnh hưởng Trong nghiên cứu điều kiện thích hợp để thủy phân sụn ức gà là: - Nhiệt độ trình xử lý nhiệt sụn: 8Ố°C - Thời gian trình xử lý nhiệt sụn: 21 phút - Thời gian trình nghiền sụn: 40 giây - Tỷ lệ sụn:đệm: 1:10 - pH: 7,1 - Hàm lượng E/S: 0,62% (w/wpro) - Nhiệt độ: 65°c - Thời gian thủy phân: 230 phút Tiến hành tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng ảnh hưởng đến trình thủy phân đạt hàm lượng GAGs tối ưu là: 14,43% Xác định hàm lượng TCA dùng cho trình loại protein 7%, tỷ lệ dung dịch cồn trình tủa GAGs 1:3 Và đồng thời xác định thời gian bảo quản sụn tốt tuần -18°c Chế phẩm GAGs nghiên cứu phân tích HPLC cs chiếm 56,17%, hàm lượng cs thơ thực sụn 8,11% tính theo chất khơ sụn Với mức độ thủy phân DH 21,58% Xác định khối lượng phân tử chế phẩm GAGs 256,9 kDa 78 Xác định thành phần hóa học chế phẩm GAGs: ẩm 12,2%; protein 8,42%; lipid 0%; tro 10,03%; carbohydrate 69,35% 5.2 Kiến nghị - Cần có nghiên cứu quy trình tinh chế phẩm GAGs nhằm thu nhận sản phẩm cs từ sụn ức gà - Nghiên cứu ứng dụng tạo loại thực phẩm chức làm giảm giá thành sản phẩm sản phẩm ngoại nhập - Cần có thêm nghiên cứu kiểm chứng lâm sàng tác dụng hiệu cs lên sụn khớp 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Chăn nuôi Việt Nam, “Kết sản xuất chăn nuôi 2010 - 2015 kế hoạch đến năm 2020”, 03/2016 Available: http ://charmuoivietnam.com/thong-ke-chan-nuoi/tk-thong-ke- chung/ [2] Tổng cục Thống kê, Niên giám thổng kê (Tóm tắt), NXB Thống Kê, pp 152, 2014 [3] Tổng Cục Thống kê, "Thống kê chăn nuôi Việt Nam 01/10/2015 số lượng đầu sản phẩm gia súc, gia cầm", 03/2016 [4] Anh Tùng (2015, 09), “Thịt gà Việt Nam”, Thông tin Khoa học & Công nghệ, [Online], 09 Available: httD://www.cesti.gov.vn/the-gioi-du-lieu/thit-ga-o-viet-nam.html [5] L B Jaques et al, “The structure of heparin Proton magnetic resonance spectral observations”, Biochemical And Biophysical Research Communications, vol 24 (3), pp 447 - 451, 1966 [6] T Nakano et al, “Extraction of Glycosaminoglycans from Chicken Eggshell”, Poultry Science, vol 80, pp 681 - 684, 2001 [7] T Nakano et al, “Extraction, Isolation and Analysis of Chondroitin Sulfate Glycosaminoglycans”, Recent Patents on Food, Nutrition & Agriculture, vol 2, pp 61 - 74, 2010 [8] M w King, “Glycosaminoglycans and proteoglycans”, 2010 Available: http://themedicalbiochemistrvpage.org/glvcans.html [9] M Vittayanont, T Jaroenviriyapap, “Production of crude chondroitin sulfate from duck trachea”, International Food Research Journal, vol 21 (2), pp 791-797, 2014 [10] T Hashiguchi et al, “Demonstration of the hepatocyte growth factor signaling pathway in the in vitro neuritogenic activity of chondroitin sulfate from ray fish cartilage”, Biochimica et Biophysica Acta, vol 1810, pp 406 - 413,2011 [11] R M Lauder, “Chondroitin sulphate: A complex molecule with potential 80 impacts on a wide range of biological systems”, Complementary Therapies in Medicine, vol 17, pp 56 - 62, 2009 [12] c Malavaki et al, “Recent Advances in the Structural Study of Functional Chondroitin Sulfate and Dermatan Sulfate in Health and Disease”, Connective Tissue Research, vol 49, pp 133 - 139, 2008 [13] B Anderson et al, “The 0-Serine Linkage in Peptides of Chondroitin 4- or 6-Sulfate”, The Journal of Biological Chemistry, vol 240 (1),1965 [14] p D Souich, “Immunomodulatory and anti-inflammatory effects of chondroitin sulphate”, Journal of Cellular and Molecular Medicin, vol 13 (8A),pp 1451-1463,2009 [15] N Volpi, “Analytical Aspects of Pharmaceutical Grade Chondroitin Sulfate”, Journal of Pharmaceutical Sciences, vol 96 (12), 2007 [16] J p Bali et al, “Biochemical Basis of the Pharmacologic Action of Chondroitin Sulfates on the Osteoarticular System”, Seminars in Arthritis and Rheumatism, vol 31 (1), pp 58 - 68, 2001 [17] Y Shi et al, “Chondroitin sulfate extraction, purification, microbial and chemical synthesis”, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, vol 89, pp 1445 - 1465, 2014 [18] J A Vazquez et al, “Chondroitin Sulfate, Hyaluronic Acid and Chitin/Chitosan Production Using Marine Waste Sources: Characteristics, Applications and Eco-Friendly Processes”, Marine Drugs, vol 11, pp 747 - 774, 2013 [19] w Gamjanagoonchom et al, “Determination of chondroitin sulfate from different sources of cartilage”, Chemical Engineering and Processing, vol 46, pp 465-471,2007 [20] X M Luo et al, “Chicken Keel Cartilage as a Source of Chondroitin Sulfate”, Poultry Science, vol 81, pp 1086 - 1089, 2002 [21] Food and Beverage Online, “Chondroitin Sulfate Extracted from Shark cartilage”, 2016 81 Available: httD://www.21food.com/oroducts/chondroitin-sulfate-extracted[22] T Pescatore et al, “Processing Chickens”, Animal and Food Science, pp 1-7, 2013 [23] J N Hathcock, A Shao,“Risk assessment for glucosamine and chondroitin sulfate”, Regulatory Toxicology and Pharmacology, vol 47, pp 78 - 83, 2007 [24] D Porter, “What does a Rheumatologist do?”, 12/2016 Available: http://www.porterrheumatologv.co.nz/What-is-rheumatology- •html [25] J M Pelletier et al, “Effects of chondroitin sulfate in the pathophysiology of the osteoarthritic joint”, Osteoarthritis Research Society Intemationnal, vol 18, pp 7-11, 2010 [26] B A Michel et al, “Chondroitins and Sulfate in Osteoarthritis of the Knee”, Arthritis & Rheumatism, vol 52 (3), pp 779 - 786, 2005 [27] J Yue et al, “Chondroitin sulfate and/or glucosamine hydrochloride for Kashin-Beck disease: a cluster-randomized, placebo-controlled study”, Osteoarthritis Research Society Intemationnal, vol 20, pp 622 - 629, 2012 [28] D Uebelhart et al, “Intermittent tteatment of knee osteoarthritis with oral chondroitin sulfate: a one-year, randomized, double-blind, multicenter study versus placebo”, Osteoarthritis Research Society Intemationnal, vol 12, pp 269 - 276, 2004 [29] Công ty cổ phần SMP, “MyVita Joint”, 12/2016 Available: http://mwitaioint.vn/mvvita-ioint- giup- giam-dau-khop-phuc-hoi[30] Công ty cổ phần dược phẩm TV.PHARM, “Glucosamine - F”, 12/2016 Available: http://www.tvpharm.com.vn/index.php/vi/nhom[31] Sức khỏe sắc đẹp vn, “Viên uống bổ xương khớp glucosamine- 82 chondroitin-msm 180 viên Mỹ”, 12/2016 Available: http://suckhoesacdep.vn/suc-khoe/vien-uong-bo-xuong-khop- [32] M B Limberg et al, “Topical Application of Hyaluronic Acid and Chondroitin Sulfate in the Treatment of Dry Eyes”, American Journal of Ophthalmology, vol 103, pp.194 - 197, 1987 [33] A J Barrett et al,“The MEROPS Database as a Protease Information System”, Journal of Structural Biology, vol 134, pp 95 - 102, 2001 [34] c L Otín et al, “Proteases Multifunctional Enzymes in Life and Disease”, The Journal Of Biological Chemistry, vol 283 (45), pp 30433 - 30437, 2008 [35] K Oda, “New families of carboxyl peptidases serine-carboxyl peptidases and glutamic peptidases”, The Journal of Biochemistry, vol 151 (1), 13-25, 2011 [36] N D Rawlings, A J Barrett, “Evolutionary families of peptidases”, Biochemical Journal, vol 290, pp 205 - 218, 1993 [37] N D Rawlings, A J Barrett, “Families of Cysteine Peptidase” in Methods in Enzymology, vol 244, Academic Press, 1994, pp 461 - 486 [38] p Kaul et al, “Effect of metal ions on structure and activity of papain from Carica papaya’’, Nahrung/Food, vol 46 (1), pp 2-6, 2002 [39] M J Harrison et al, “Catalytic Mechanism of the Enzyme Papain: Predictions with a Hybrid Quantum Mechanical/Molecular Mechanical Potential”, Journal of the American Chemical Society, vol 119, pp 12285 12291, 1997 [40] J Xie et al, “An efficient preparation of chondroitin sulfate and collagen peptides from shark cartilage”, International Food Research Journal, vol 21 (3), pp 1171 - 1175, 2014 [41] A Srichamroen et al, “Chondroitin sulfate extraction from broiler chicken cartilage by tissue autolysis”, Food Science and Technology, vol 50, pp 607 612, 2013 83 [42] T Zhao et al,“Extraction, purification and characterisation of chondroitin sulfate in Chinese sturgeon cartilage”, Journal of the Science of Food and Agriculture, vol 93, pp 1633 - 1640, 2013 [43] s L Xiong et al, “Isolation and Characteristic of Chondroitin Sulfate from Grass Carp Scales”, Advanced Materials Research, vols 391 - 392 , pp 10031007,2012 [43] s c Shin et al, “Study on Extraction of Mucopolysaccharide-protein Containing Chondroitin Sulfate from Chicken Keel Cartilage”, Asian Australasian Journal of Animal Sciences, vol 19 (4), pp 601 - 604, 2006 [44] V.H Bắc et al, "Nghiên cứu tách chiết chondroitin sulfate tù xuơng sụn cá đuối (dasyatis kuhlii) cá nhám (carcharhinus sorrah) cơng nghệ sinh học", Tạp chí viện nghiên củu hải sản, vol 16, pp 26 - 30, 2010 [45] V Gargiulo et al, “Structural analysis of chondroitin sulfate from Scyliorhinus Canicula A useful source of this polysaccharide”, Oxford Journals, vol 19 (12), pp 1485 - 1491, 2009 [46] T Nakano et al, “Study of Sulfated Glycosaminoglycans from Porcine Skeletal Muscle Epimysium Including Analysis of Iduronosyl and Glucuronosyl Residues in Galactosaminoglycan Fractions”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol 4, pp 1424 - 1434, 1996 [47] A Bensadoun, “Assay of Proteins in the Presence of Interfering Materials”, Analytical Biochemistry, vol 70, pp 241 - 250, 1976 [48] J.A Vazquez et al, "Optimisation of the extraction and purification of chondroitin sulphate from head by-products of Prionace glauca by envfronmental friendly processes", Food Chemistry, vol 198, pp 28 - 35, 2016 [49] c Y Cheng et al, "Optimization of microwave-assisted extraction of chondroitin sulfate from tilapia byproduct by response surface methodology," Consumer Electronics, Communications and Networks (CECNet), pp 1462 1465, 2011 [50] c Kun-Nan and c Ming-Ju, "Statistical Optimization: Response Surface 84 Methodology Optimization in Food Engineering" in Optimization in Food Engineering, vol 6, Ferruh Erdogdu, Ed New York, USA: Taylor & Francis Group, 2008, pp 115-141 [51] R E Brown, “Protein Measurement Using Bicinchoninic Acid: Elimination of Interfering Substances”, Analytical Biochemistry, vol 180, pp 136-139,1989 [52] T Nakano et al,“Extraction, isolation and analysis of chondroitin sulfate from broiler chicken biomass”, Process Biochemistry, vol 47, 1909 - 1918, 2012 [53] H M Khan et al, “Extraction and Biochemical Characterization of Sulphated Glycosaminoglycans from Chicken Keel Cartilage”, Pakistan Veterinary Journal, vol 33 (4), pp 471 - 475, 2013 [54] s Chen et al,“Comparison of structures and anticoagulant activities of fucosylated chondroitin sulfates from different sea cucumbers”, Carbohydrate Polymers, vol 83, pp 688 - 696, 2011 [55] s K Tat et al,“Variable Effects of Different Chondroitin Sulfate Compounds on Human Osteoarthritic Cartilage/Chondrocytes: Relevance of Purity and Production Process”, The Journal of Rheumatology, vol 37 (3), pp 656-664,2010 [56] J M Pelletier et al,“Discrepancies in Composition and Biological Effects of Different Formulations of Chondroitin Sulfate”, Molecules, vol 20, pp 42774289, 2015 [57] A o Adebowale et al, “Analysis of Glucosamine and Chondroitin Sulfate Content in Marketed Products and the Caco-2 Permeability of Chondroitin Sulfate Raw Materials”, vol 3, pp 37 - 44, 2000 [58] AOAC Official Method 934.01, Moisture in Animal Feed, 1990 [59] ISO 7514:1990, Instant tea in solid form - Determination of total ash, 1990 Available: http://channuoivietnam.com/thong-ke-chan-nuoi/ [60] AO AC Official Method 2003.06, Crude Fat in Feeds, Cereal Grains, and 85 Forages, 2003 [61] AO AC Official Methods 2001.11, Protein (Crude) in Animal Feed, Forage (Plant Tissuse), Grain, and Oilseeds, 2001 [62] o H Lowry et al, “Protein Measurement With The Folin Phenol Reagent”, The Joumalof Biological Chemistry, pp 265 - 275, 1951 [63] R w Famdale et al, “Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue”, Biochimica et Biophysica Acta, vol 883, pp 173 - 177, 1986 PHỤ LỤC A CÁC PHVƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Phụ lục A.1 Phuong pháp xác định ẩm [58] - Thiết bị, dụng cụ, vật liệu Tủ sây Cốc sứ Nguyên tắc Dùng nhiệt để làm bay nước có mẫu Từ chênh lệch khối lượng mẫu trước sau sấy, tính độ ẩm mẫu sấy mẫu từ 100°C đến 105°C đến khối lượng khơng đổi, lượng nước tự có mẫu bốc hết - Tiến hành thí nghiệm Xác định khối lượng khô tuyệt đối cốc sứ cách sấy cốc sứ 105°C Tại thời điểm sấy cuối cùng, đậy nắp cốc sứ chuyển vào bình hút ẩm để làm nguội tới nhiệt độ phòng, sau tiến hành cân (trước cân mở nắp cốc sứ để làm cân áp suất đậy lại ngay) Cân g mẫu thử vào cốc cân, mở nắp cho vào ừong tủ sấy, sấy nhiệt độ 105 °C Sau tiếng, cân khối lượng mẫu lần sau 30 phút cân lại mẫu lần chênh lệch lần cân liên tiếp không lớn 86 0,05% - Cơng thức tính tốn m _m i _ x(%) = ——- X 100% mx Trong : mi khối lượng mẫu thử trước sấy, g m2 khối lượng mẫu thử sau sấy, g Phụ lục A.2 Phuong pháp xác định hàm lượng tro [59] - Thiết bị, dụng cụ, vật liệu Chén nung sứ Bếp điện Lò nung điều chỉnh nhiệt độ (từ 500°C đến 600°C) Cân phân tích Bình hút ẩm - Ho ú chất HNO3 đậm đặc H2O2 - Nguyên tẳc Dùng sức nóng (từ 500°C đến 600°C) nung cháy hồn tồn chất hữu Phần lại đem cân tính phần trăm tro có thực phẩm - Tiến hành Nung chén rửa từ 500°C đến 600°C đến trọng lượng không đổi Để nguội bình hút ẩm cân cân phân tích xác đến 0,0001 g Cho vào chén khoảng 5g mẫu cân số.Tiến hành nung bếp điện đến tạo tro đen Sau cho tất vào lò nung tăng nhiệt độ dần lên từ 500°C đến 600°C Nung tro trắng, nghĩa loại hết chất hữu cơ, thường từ đến Trong trường hợp tro đen, lấy để nguội, cho thêm vài giọt HNO3 87 đậm đặc H2O2 nung cho trắng Để nguội bình hút ẩm cân cân phân tích Tiếp tục nung thêm nhiệt độ vòng 30 phút để nguội bình hút ẩm cân khối lượng không đổi Kết hai lần nung cân liên tiếp khơng cách q 0,0005 g cho mẫu Tính kết Gi - G x(%) = * X 100 m Trong : G khối lượng chén nung, g G1 khối lượng chén nung ho tổng số, g m khối lượng mẫu thử, g Phụ lục A.3 Phuong pháp xác định hàm lượng béo [60] - Thiết bị, dụng cụ, vật liệu Bộ trích ly soxhlet Tủ sây Bình hút ẩm - Hố chất Dumg mơi Hexan Tiến hành thí nghiệm Sấy khơ nguyền liệu đến khối lượng khơng đổi Cân xác g nguyên liệu nghiền nhỏ, cho vào bao giấy sấy khô biết khối lượng Đặt bao giấy vào trụ chiết Lắp trụ chiết vào bình cầu gắn ống sinh hàn Qua đầu ống sinh hàn, dùng phễu cho dung môi vào trụ chiết cho lượng dung mơi chảy xuống bình cầu lượng ttên phễu đủ ngập mẫu Dùng bơng làm nút đầu ống sinh hàn Mở nước lạnh vào ống sinh hàn Mở công tắc đèn nhốt đầu trích lipid Điều chỉnh nhiệt độ trích cho chu kỳ hồn lưu dung mơi đạt từ lần đến lần ttong Chiết ttong trích ly hồn tồn hết chất béo Thử cách lấy vài giọt dung môi cuối ống xiphong 88 nhỏ lên giấy lọc, dung môi bay khơng để lại vết dầu loang kết thúc Cho dung mơi chảy xuống hết bình cầu Lấy bao giấy ra, đặt tủ hotte cho bay hết dung môi nhiệt độ thường cho vào tủ sấy, sấy từ 100°C đến 105°C 1,5 Để nguội ửong bình hút ẩm, cân xác định khối lượng - Cơng thức tính Mi - M2 _ X(%) = X 100 m Trong : Ml: khối lượng bao giấy mẫu ban đầu, g M2 : khối lượng bao giấy mẫu sau trích lipid sấy khơ, g m : khối lượng mẫu ban đầu, g Phụ lục A.4 Phương pháp Kjeldahl [61] - Nguyên tẳc Khi đốt nóng mẫu đem phân tích với H2SO4 đậm đặc, hợp chất dễ bị oxy hóa Carbon hydro thành co2 H2O, nitơ sau giải phóng dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan ừong dung dịch Đuổi NH3 khỏi dung dịch NaOH đồng thời chưng cất thu hồi NH3 lượng dư H2SO4 0,1 N lại dung dịch NaOH chuẩn, qua tính lượng nitơ có mẫu ngun liệu thí nghiệm - Tính kết N (a-bx^)x0,0014xVxl00 ưxm Trong đó: N: Hàm lượng Nitơ tính phần trăm khối lượng a: Số mL dung dịch chuẩn H2SO4 O,1N đem hấp thụ NH3 b: Số mL NaOH 0,1 N tiêu tốn cho chuẩn độ m: Khối lượng mẫu đem vơ hóa mẫu,g V: Tổng thể tích định mức dung dịch vơ vơ hóa (100 mL) v: Tổng thể tích dung dịch vơ hóa mẫu cần phân tích(10 mL) 0,0014: 89 Lượng gam nitơ tương ứng với H2SO4 O,1N K: Hệ số điều chỉnh nồng độ NaOH 0,1 N Hàm lượng protein thô: Protein (%) = nitơ (%) X 6,25 Phụ lục A.5 Phuong pháp xác định hàm lượng protein hòa tan theo phưong pháp Lowry [62] - Nguyên tẳc Phương pháp dựa sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphomolipden - photphovonphramat (thuốc thử Folin - ciocalteu) tạo phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại bước sóng 660 nm Cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein phạm vi định Dựa vào mức độ hấp thụ quang học protein chuẩn, ta xác định hàm lượng protein ttong mẫu nghiên cứu - Hoá chất cẩn dùng Dung dịch A: g NaOH 0,1 M 20g Na2CO3 2% pha 1000 mL nước cất Dung dịch B: 0,5 g CuSO4.5H2O 0,5% pha dung dịch Natri Xitrat 1% dung dịch Natri, Kali Tartrate 1% ... nhận glycosaminoglycans từ sụn ức gà - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng glycosaminoglycans thu nhận trình xử lý nguyên liệu, thủy phân, từ sụn ức gà - Tối ưu hóa q trình xử lý nhiệt sụn. .. glycosaminoglycans từ sụn ức gà - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng glycosaminoglycans thu nhận trình xử lý nguyên liệu, thủy phân, từ sụn ức gà - Tối ưu hóa q trình xử lý nhiệt sụn ức gà trình... cho ngành y tế việc điều ửị bệnh xương khớp 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Tìm điều kiện thu n lợi để trích ly thu nhận glycosaminoglycans từ sụn ức gà enzyme papain Tối ưu hóa trình xử lý nhiệt sụn