Đang tải... (xem toàn văn)
Protein trong nấm có giá trị dinh dưỡng cao hơn so với hầu hết các protein thực vật. Protein khi đi vào cơ thể được chuyển hóa thành các axit amin, trong đó có 9 axit amin thiết yếu. Nhằm giúp các bạn hiểu hơn về vấn đề này, mời các bạn cùng tham khảo nội dung bài báo cáo đồ án tốt nghiệp Nghiên cứu xác định các loại axit amin trong một số loài nấm lớn ở khu vực Bắc Trung Bộ bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) dưới đây.
BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC LOẠI AXIT AMIN TRONG MỘT SỐ LỒI NẤM LỚN Ở KHU VỰC BẮC TRUNG BỘ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)” GVHD: Th.S Hồng Văn Trung SVTH: Nguyễn Duy Trọng Hồng Thị Nga Lớp: 51K_CNTP MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Với cấu trúc địa chất độc đáo, địa lý thủy văn đa dạng, khí hậu nhiệt đới gió mùa đã góp phần tạo nên sự đa dạng của hệ nấm Việt Nam, đây là nguồn có giá trị tài ngun rất to lớn Hiện nay khơng chỉ ở Việt Nam mà trên thế giới đều cơng nhận giá trị khoa học các lồi nấm, nấm được coi là một thực phẩm chức năng, có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống con người, chúng là nguồn thực phẩm giàu chất dinh dưỡng, nguồn dược phẩm q. Protein trong nấm có giá trị dinh dưỡng cao hơn so với hầu hết các protein thực vật. Protein khi đi vào cơ thể được chuyển hóa thành các axit amin, trong đó có 9 axit amin thiết yếu. Axit amin là thành phần quan trọng thực hiện các chức năng đa dạng của cơ thể, là tiền thân của nhiều sinh chất quan trọng trong cơ thể sống. Vì vậy việc xác định axit amin trong nấm là rất cần thiết Trong những năm gần đây, HPLC được ứng dụng rộng rãi trong phân tích, đánh giá chất lượng thực phẩm như axit amin, vitamin, kháng sinh, phụ gia thực phẩm Xuất phát từ thực tế đó, chúng tơi lựa chọn đề tài : “Nghiên cứu xác định hàm lượng các axit amin trong một số lồi nấm lớn ở vùng Bắc Trung Bộ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC” 2. Mục đích nghiên cứu Xây dựng phương pháp tách và định lượng đồng thời các axit amin trong các loại nấm khác nhau, cung cấp số liệu về thành phần dinh dưỡng (axit amin) trong một số loại nấm được nghiên cứu 3. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu xác định các axit amin nấm tự nhiên được thu thập từ rừng Quốc gia Pù Mát, Phong Nha Kẻ Bàng thuộc vùng Bắc Trung Bộ Tuần hoàn vật chất Dược phẩm, chống lão hóa Ngăn ngừa, điều trị bệnh NẤM Các chất có hoạt tính sinh học cao Thực phẩm giàu dinh dưỡng Vitamin, khống chất 1.3. Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC Chú thích: 1. Bình chứa dung mơi pha động 2. Bộ phận khử khí 3. Bơm cao áp 4. Bộ phận tiêm mẫu 5. Cột sắc ký 6. Đầu dò 7. Hệ thống máy tính 8. Máy in 1.2. Axit amin H R N C H H H O C H O N _ R + C O C H H O H Bảng 1.1: Cấu trúc của 17 axit amin tiêu chuẩn LAlanin LArginin LHistidin LMethionin LLeucin LLysin Axit LAspartic LCystin Axit LGlutamic Lisoleucin LPhenylalanin LProlin LSerin LThrionin LTyrosin LValin LGlycin Chương 2. PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Thu thập mẫu nấm Các mẫu Nấm Thượng hoàng, nấm PL1, nấm PL2, nấm PL3, nấm PL4 được thu thập từ các rừng Quốc Gia Pù Mát và rừng Phong Nha Kẻ Bàng vào 82013. Sau khi đưa về phòng thí nghiệm được làm khơ và bảo quản ở nhiệt độ phòng Hình 2.1: Mẫu nấm PL1 Hình 2.2: mẫu nấm PL2 Hình 2.3: mẫu nấm PL3 Hình 2.4: Mẫu nấm PL4 Hình 2.5: Mẫu nấm Thượng hồng 2.6: Mẫu nấm Linh Chi 2.2 Quy trình phân tích Bảng 3.5: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp TT Axit amin LOD (pmol) LOQ (pmol) 1 Asp 0,0019 0,0063 2 Glu 0,0027 0,0090 3 Ser 0,0021 0,0070 4 His 0,0060 0,0200 5 Gly 0,0037 0,0125 6 Thr 0,0025 0,0084 7 Ala 0,0006 0,0020 8 Try 0,0046 0,0153 9 Cyssscys 0,0029 0,0097 10 Val 0,0036 0,0120 11 Met 0,0010 0,0033 12 Phe 0,0022 0,0073 13 Ile 0,0013 0,0043 14 Leu 0,0014 0,0047 15 Lys 0,0015 0,005 16 Pro 0,0029 0,0097 3.5. Độ thu hồi của phương pháp Dựa vào việc thêm chuẩn vào mẫu thực cùng với làm mẫu thực khơng thêm chuẩn song song chúng tơi tiến hành tính độ thu hồi như sau : Hiệu suất thu hồi H% Cs m C so Cm 100 Tiến hành thí nghiệm trên nấm Thượng hồng, nấm Thượng hồng thêm chuẩn 25pmol, thực hiện phân tích 5 lần lặp lại và lấy kết quả trung bình. Các kết quả được chỉ ra ở bảng 3.6 Bảng 3.6: Hiệu suất thu hồi của axit amin trong nấm Thượng Hồng Cso+mẫu Axit amin g / ml Cmẫu ( g / ml ) Cso ( g / ml ) H (%) Asp 20,4077 16,1328 3,2028 133,47 Glu KPH KPH 3,5528 KPH Ser 6,4624 3,9026 2,5776 99,31 His 16,1418 12,5187 3,8410 94,32 Gly 4,2489 2,6338 1,8349 88,02 Thr KPH 0,2749 2,9451 KPH Ala 7,8525 5,5600 2,2060 103,92 Arg Tyr 4,9700 0,6301 4,5359 95,68 Cys – ss – Cys 8,3112 5,4216 3,0462 94,86 Val 9,0238 6,2981 2,9727 94,88 Met 4,4149 1,0545 3,7433 89,77 Phe 13,4033 8,8533 4,1191 110,46 Ile 3,4496 0,4465 3,2420 92,63 Leu 7,9043 5,0144 3,2500 88,92 Lys 7,0297 3,4539 3,6675 97,50 Pro 8,4506 5,6383 2,9027 96,88 Hình 3.10: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm Thượng hồng Hình 3.11: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân nấm Thượng hồng thêm Bảng 3.7: Hàm lượng axit amin trong nấm Thượng hồng TT Axit amin Diện tích Thr Hàm lượng ( g / g ) 23,0217 134,44516 3.6. Xác đị1 nh hàm lượng các axit amin trong các m ẫu n527,4791 ấm 4615,22412 2 Val 3 Met 773,26526 88,3166 4 Ile 506.93848 37,3953 5 Leu 3684,11597 419,9665 6 Phe 3645,38525 741,4824 7 Lys 834,16046 289,2747 8 His 3816,34302 1048,4690 Tổng axit amin thiết yếu 3175,4053 9 Asp 6654,29736 1351,1558 10 Glu KPH KPH 11 Ser 3118,96802 326,8509 12 Gly 3090,88110 220,5863 13 Cys – ss – Cys 1194,14832 454,0703 14 Ala 8312,14355 469,0075 15 Arg 16 Tyr 344,86682 52,7696 17 Pro 4175,47900 472,2161 Tổng axit amin không thiết yếu 3346,6565 Tổng 6522,0618 EAA/TAA 48,68% Bảng 3.8: Hàm lượng (μg/g) axit amin trong các mẫu nấm TT 1 2 3 4 5 6 7 8 Axit amin Thr 119 Val 117 Met 149 Ile 131 Leu 131 Phe 165 Lys 146 His 155 Nấm Nấm Nấm Nấm Nấm Linh PL1 PL2 PL4 PL3 Linh Chi Chi Đen 0.5313 0.7976 0.9042 0.9842 0.5479 0.5019 KPH 7.32 7.62 KPH 27,96 69.56 2039.50 KPH 1195.31 1197.4 1498,76 2717.84 149.43 51.90 15.11 9.36 321,18 148.73 729.08 108.66 219.41 251.45 396,45 1294.49 1785.60 537.61 1052.79 1062.11 952,02 2271.51 3175.21 747.98 1624.62 1737.25 2258.77 888.37 493.46 207.77 690.36 483.99 672.97 453.82 4348.93 1037.40 2488.49 2510,92 2421.66 4863.67 12721.1 2698,64 7365.71 7252.48 8549.77 12707.9 Tổng axit amin thiết yếu Bảng 3.9: Hàm lượng (μg/g) axit amin trong các mẫu nấm Asp 9 3876.80 882.97 1812.52 1797.90 1558.60 4190.67 KPH KPH KPH KPH KPH KPH 1286.11 0 771.86 762.50 277.79 1008.87 1052.69 KPH 560.67 609.05 313.02 1033.28 3082.47 1980.87 1410.38 1955.63 1018.8 3804.60 1192.51 270.37 723.62 685.38 935.96 491.86 _ _ _ _ _ _ 266.17 83.64 102.65 108.27 130.41 459.84 1511.82 556.47 825.85 973.07 1251.27 2638.57 12268.7 3774.32 6207.55 6891.8 5485.85 13627.9 Tổng 24989.8 6472.96 13573.26 14144.8 14035.62 26335.8 EAA/TAA 50.91% 41.69% 54.27 % 51.28% 60.91 48.25 133 10 11 12 Glu 147 Ser 105 Gly 75 Cys – 13 ss – Cys 121 14 15 16 17 Ala 89 Arg 174 Tyr 181 Pro 115 Tổng axit amin khơng thiết yếu Bảng 3.10: Hàm lượng (μg/g) axit amin trong các mẫu nấm theo phương pháp xử lí mẫu khác nhau Nấ m PL3 Nấm Nấm PL1 TT Nấm PL1 Nấm PL1 Axit amin PL2 HL ĐK HL CK HL T Thượng Hoà ng Nấ m PL2 HL HL T CK HL T HL T Nấ m PL4 HL CK Thr 114,34 KPH 24,04 KPH 0 0 Val 1647,34 2019,58 2582,3 1997,9 2401,8 Met 300,80 217,27 107,05 369,65 418,02 128,03 106,10 234,19 Ile 160,42 198,67 232,34 286,23 KPH Leu 1219,18 1433,88 464,26 2318,08 3120,5 462,75 2544,2 1251,18 Phe 135,11 1555,73 481,56 2389,19 2987,1 498,79 2543,5 1233,3 Lys 667,68 627,64 201,09 861,04 1091,0 319,69 751,48 1011,4 His 1817,90 1688,69 783,28 2587,22 3407,9 1246,9 2770,8 2055,3 4415,43 7369,22 2061,28 10777,1 13893,1 2656,16 10713,9 8187,2 Tổng axit amin thiết yếu Asp 1386,88 1203,08 296,17 2285,56 2818,5 749,18 2860,2 1202,9 10 Glu KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH 11 Ser KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH 12 Gly KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH 4951,88 3601,55 2701,1 4531,36 5943,4 3059,7 1439,6 5905,8 13 Cys – ss – Cys 14 Ala KPH KPH 0 0 15 Arg _ _ _ _ _ _ _ _ 16 Tyr 614,84 608,27 294,29 364,36 921,29 279,65 272,96 1033,8 17 Pro 4988,89 3460,9 1536,1 5020,9 4633,5 3519,9 3852,8 5634,6 11942,49 8873,8 4827,66 12202,18 14316,7 7608,43 8425,56 13777,1 Tổng 16357,92 16243,02 8888,94 22979,28 28209,8 10264,6 19139,4 21964,3 EAA/TAA 26,99% 45,37% 29,92% 46,90% 49,25% 25,88% 55,98% 37,28% Tổng axit amin khơng thiết yếu Hình 3.12: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm PL1 Hình 3.13: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm PL2 Hình 3.14: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm PL3 Hình 3.15: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm PL4 Hình 3.16: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm Linh chi KẾT LUẬN 1. Khảo sát tối ưu hóa một số điều kiện trong quy trình thủy phân xử lý mẫu xác định hàm lượng axit amin trong nấm: + Thời gian thủy phân mẫu tối ưu là 24h + Nồng độ HCl thủy phân tối ưu là 6M 2. Đã xây dựng được phương trình đường chuẩn của các axit amin và xác định được khoảng nồng độ nghiên cứu nằm trong khoảng tuyến tính 3. Xác định được giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ của phương pháp là rất nhỏ: LOD từ 0,0006 0,006 pmol, LOQ từ 0,002 0,0153pmol 4. Quy trình phân tích đưa ra đã được đánh giá bằng đường chuẩn, độ thu hồi. Độ thu hồi với các loại axit amin nằm trong khoảng 85,6 – 1 33,8% trong vùng đường chuẩn tuyến tính KẾT LUẬN 5. Xác định được hàm lượng axit amin thủy phân trong 7 mẫu nấm tự nhiên, cụ thể: Hàm lượng axit amin thủy TT Mẫu nấm phân(μg/g) 1. Nấm PL1 24989.8 2. Nấm PL2 6472.96 3. Nấm PL3 13573.26 4. Nấm PL4 14144.8 5. Nấm Thượng hoàng 6522.06 6. Nấm Linh chi 7. Nấm Linh chi đen 14035.62 26335.8 Từ các kết quả thu được chúng tơi thấy phương pháp phân tích hàm lượng axit amin trong các mẫu nấm với độ tin cậy cao và đề nghị được áp dụng phương pháp phân tích axit amin này cho nhiều đối tượng thực phẩm khác nhau ... đề tài : Nghiên cứu xác định hàm lượng các axit amin trong một số lồi nấm lớn ở vùng Bắc Trung Bộ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC” 2. Mục đích nghiên cứu Xây dựng phương pháp tách và định lượng đồng thời các axit amin ... Xây dựng phương pháp tách và định lượng đồng thời các axit amin trong các loại nấm khác nhau, cung cấp số liệu về thành phần dinh dưỡng (axit amin) trong một số loại nấm được nghiên cứu 3. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu xác ... 6955,32373 Hình 3.3: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn các axit amin ở nồng độ 10pmol Hình 3.4: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn các axit amin ở nồng độ 25pmol Hình 3.5: Sắc đồ chạy hỗn hợp chuẩn các axit amin ở nồng độ 100pmol