Đang tải... (xem toàn văn)
Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng coixol trong Cam thảo nam. Áp dụng quy trình đã xây dựng và thẩm định để định lượng coixol trong các mẫu thu hái ở các thời điểm và địa phương khác nhau.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COIXOL TRONG CAM THẢO NAM (SCOPARIA DULCIS L., SCROPULARIACEAE) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Phạm Thị Thanh Hương*, Trần Thị Vân Anh* TÓMTẮT Mở đầu: Cam thảo nam (Scoparia dulcis L Scrophulariaceae) dược liệu sử dụng phổ biến tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng chưa nâng cao Đề tài thực nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng coixol (một alcaloid Cam thảo nam) phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao nhằm nâng cao tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu Mục tiêu: Xây dựng thẩm định qui trình định lượng coixol Cam thảo nam Áp dụng qui trình xây dựng thẩm định để định lượng coixol mẫu thu hái thời điểm địa phương khác Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu hàm lượng coixol có Cam thảo nam Nghiên cứu điều kiện quy trình xử lý mẫu điều kiện sắc kí để định lượng coixol S dulcis phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao Kết quả: Xác định điều kiện phân tích sắc kí: Cột Cosmosil 2,5 Chlolester (75 x 2,0 mm; 2,5 µm); nhiệt độ cột 35 oC; tốc độ dòng: 0,45 mL/phút; thể tích tiêm mẫu µl; bước sóng phát hiện: 230 nm; chương trình rửa giải (A: nước, B: ACN) 0-3 phút: % B, 3-14 phút: 5-15 % B, 14-15 phút; 15-90 % B, 15-24 phút; 90 % B Qui trình định lượng đạt tiêu đánh giá tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, độ đúng, độ xác tính tuyến tính Đã áp dụng quy trình xây dựng thẩm định để khảo sát hàm lượng coixol mẫu Cam thảo nam thu hái thời điểm địa phương khác Hàm lượng coixol mẫu dao động khoảng 0,61 – 2,14 mg/g Kết luận: Đề tài xây dựng qui trình định lượng coixol Cam thảo nam phương pháp UPLC-PDA làm sở cho việc nâng cao tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu Từ khóa: Cam thảo nam, định lượng coixol, UPLC ABSTRACT QUANTIFICATION OF COIXOL IN SCOPARIA DULCIS BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY Pham Thi Thanh Huong, Tran Thi Van Anh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 101-107 Background: Sweet-broom (Scoparia dulcis L., Scrophulariaceae) is used widely as a medicinal herb; however, the quality control standards of S dulcis have not been improved Therefore, the aim of this study is to develop a method for the quantification of coixol (a major alkaloid in S dulcis) by UPLC-PDA Objectives: This research aims to develop and validate a method for the determination of coixol in S dulcis and apply the method for quantifying of coixol in different materials Methods: The subject of this study was the content of coixol in S dulcis The method for preparation samples and the UPLC chromatographic conditions for determination of coixol in S dulcis were studied * Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Trần Thị Vân Anh ĐT: 0918852989 Chuyên Đề Dược Email: ttvananh@ump.edu.vn 101 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Results: A simple UPLC method was developed for quantitative determination of coixol in S dulcis following chromatographic conditions: Cosmosil 2,5 Cholester column (2,0 ID x 75 mm; 2,5 µm), mobile phase in gradient mode including mixture of water (A) and acetonitrile (B) with the program - min.: % B, - 14 min.: – 15 % B, 14 - 15 min.: 15 – 90 % B, 24 min.: 90 % B, flow rate of 0.45 mL/min., detection wavelength of 230 nm This procedure meets all requirements of system suitability and quantitative method validation such as linearity, specificity, precision and accuracy This method was applied for analyzing different S dulcis samples The contents of coixol in S dulcis were in range 0.61 –2.14 mg/g Conclusion: The validated method for determination of coixol in S dulcis could be used in quality control of herbal materials Key words: Scoparia dulcis, quantification of coixol, UPLC ĐẶTVẤNĐỀ ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Cam thảo nam (Scoparia dulcis L Scrophulariaceae) dược liệu sử dụng lâu đời y học dân gian Việt Nam nước giới Ấn Độ, Brazil, Colombia, Nhật Bản…với công dụng trị tiểu đường, trị loét dày, trị rắn cắn, giảm đau, hạ sốt, làm mát thể…(7) Cam thảo nam sử dụng phổ biến, nhiên tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng S dulcis chưa nâng cao Trong Dược điển Việt Nam V ban hành năm 2018, chuyên luận Cam thảo nam dừng tiêu định lượng chất chiết dược liệu(2) Đối tượng nghiên cứu Nhiều nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học S dulcis đa dạng gồm nhiều nhóm hợp chất khác terpenoid, alcaloid, flavonoid số chất khác(6) Trong đó, coixol alcaloid S dulcis với nhiều tác dụng dược lý chứng minh hạ đường huyết, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus HIV, điều hòa tiết chất nhầy đường hơ hấp, điều hòa thần kinh(1,3,5,6,8) Coixol đáp ứng tiêu chí chất marker sử dụng việc tiêu chuẩn hóa dược liệu S dulcis Để nâng cao tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng dược liệu, đề tài thực nhằm tạo sở cho việc bổ sung tiêu định lượng phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao chuyên luận kiểm nghiệm dược liệu Cam thảo nam (CTN) 102 Coixol mẫu CTN (tồn cây) thu hái Tp Hồ Chí Minh 12 tháng (10/2017- 9/2018), mẫu thu hái 11 tỉnh vào tháng 3/2018 (HT: Hà Tĩnh, KH: Khánh Hòa, LĐ: Lâm Đồng, ĐL: Đắc Lắc; GL: Gia Lai; TN: Tây Ninh; BD: Bình Dương; ĐN-1: Biên Hòa-Đồng Nai, ĐN-2: Cẩm MỹĐồng Nai; LA: Long An) Mẫu xay nhỏ, rây qua rây 0,425 mm xác định khối lượng làm khơ Thiết bị phân tích Hệ thống sắc kí lỏng hiệu cao Acquity UPLC (Waters), đầu dò PDA; cột Cosmosil 2,5 Cholester (75 x 2,0 mm; 2,5 µm); cân phân tích Sartorius BP-221S (0,01 mg) Dung mơi-hóa chất Acetonitril, methanol đạt chuẩn HPLC (Merck); nước cất lần dùng cho sắc kí lỏng; Chất đối chiếu coixol phân lập từ S dulcis đạt độ tinh khiết (98,1%) Phương pháp nghiên cứu Khảo sát qui trình chiết xuất coixol từ CTN: khảo sát yếu tố bao gồm dung môi chiết, thời gian chiết, số lần chiết) Sử dụng mẫu CTN thu hái vào tháng 10/2018 TP Hồ Chí Minh để thực khảo sát Dựa sắc ký đồ kiểm tra pic coixol với mẫu đối chiếu; so sánh diện tích pic coixol lần thử nghiệm Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Xây dựng thẩm định qui trình định lượng coixol CTN: thăm dò điều kiện sắc kí (pha động, kỹ thuật rửa giải) với mục đích tách pic coixol hồn tồn (Rs>1,5) với pic lân cận mẫu thử Qui trình thẩm định tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ xác độ theo hướng dẫn ICH(4) Hàm lượng coixol S dulcis tính theo cơng thức: Với : hàm lượng coixol có dược liệu (mg/g), : Diện tích pic mẫu thử (µV x s), : Diện tích pic mẫu chuẩn (µV x s), Nồng độ mẫu chuẩn (mg/ml), : Độ pha loãng mẫu đo, : Khối lượng dược liệu (mg), : Độ ẩm dược liệu (%), : Hàm lượng chất đối chiếu (%) Áp dụng quy trình xây dựng thẩm định để khảo sát hàm lượng coixol mẫu Cam thảo nam thu hái Tp Hồ Chí Minh 12 tháng (10/2017 – 9/2017) mẫu Cam thảo nam thu hái tạo 12 địa phương vào tháng 3/2018 KẾTLUẬN Kết khảo sát quy trình chiết xuất coixol từ CTN Thăm dò dung mơi chiết Cân xác 30 mg dược liệu Cam thảo nam vào ống nghiệm có nắp vặn, thêm xác 1,5 ml dung môi (acetonitril/MeOH 100%/ MeOH-H2O (9:1)/ MeOH-H2O (8:2) Siêu âm 30 phút, lọc dịch chiết qua màng lọc 0,22 µm, dịch lọc tiêm vào máy UPLC phân tích Kết chọn dung mơi MeOH chiết coixol mẫu tốt Thăm dò thời gian chiết Sử dụng MeOH 100% làm dung môi chiết, thay đổi thời gian chiết (25 phút/45 Chuyên Đề Dược Nghiên cứu Y học phút/65 phút/85 phút) nhiệt độ 40 oC Kết chọn thời gian chiết 45 phút tối ưu Thăm dò nhiệt độ chiết Sử dụng MeOH 100% làm dung môi chiết, chiết 45 phút với nhiệt độ thay đổi (35 oC/40 oC/50 oC/60 oC) Kết khảo sát cho thấy chiết nhiệt độ 40 oC cho diện tích pic coixol lớn Thăm dò tỉ lệ dung mơi; dược liệu, số lần chiết Chiết mẫu dược liệu với tỉ lệ dược liệu: dung môi (30 mg: 1,5 ml) lần chiết 1, 2, có diện pic coixol Để thuận lợi cho việc xử lý mẫu, tăng tỉ lệ dược liệu: dung môi (30 mg: ml), sau chiết lần với điều kiện chọn, mẫu ly tâm, bã dược liệu chiết lần lần với ml dung môi Kết cho thấy lần chiết thứ 2, pic coixol chiếm 1,84% Như chiết kiệt coixol lần chiết, thuận tiện cho việc xử lý mẫu Kết khảo sát điều kiện chiết coixol từ dược liệu (quy trình xử lý mẫu) trình bày tóm tắt Bảng Bảng 1: Kết khảo sát điều kiện xử lý mẫu ACN 100% Diện tích pic coixol 176637 Thời gian chiết 25 phút Diện tích pic coixol 250877 o Nhiệt độ chiết 35 C Diện tích pic coixol 277383 Số lần chiết Lần MeOH MeOH MeOH 100% 90% 80% 267393 2657908 259075 45 phút 65 phút 85 phút 253807 25342 245027 o o o 40 C 50 C 60 C 281318 244950 234015 Lần Lần Khơng 64780 1220 Diện tích pic coixol phát (98,15% (1,84%) Dung môi Từ kết khảo sát, qui trình chiết coixol xác định: Cân xác 30 mg bột dược liệu CTN cho vào ống nghiệm có nắp ml, thêm xác ml methanol 100%, siêu âm 45 phút 40 oC Lọc qua màng lọc milipore cellulose acetate 0,22 µm, dịch lọc tiêm vào hệ thống sắc kí, phân tích theo điều kiện chọn 103 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Khảo sát điều kiện sắc kí tách pic coixol tronng mẫu thử Sau tiến hành thăm dò, điều kiện sắc kí lựa chọn sau: cột Cosmosil 2,5 Cholester (75 x 2,0 mm; 2,5 µm), nhiệt độ cột 30 oC, tốc độ dòng: 0,45 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 1µl, bước sóng phát 230 nm, pha động A (H2O), B (ACN), chương trình rửa giải – phút: 5% B, – 14 phút: -15 % B, 14 – 15 phút: 15-90 % B, 15 – 24 phút: 90% B Cân cột vòng phút lần chạy liên tiếp Kết thẩm định qui trình Tính phù hợp hệ thống Tiến hành phân tích lần mẫu CTN chiết theo qui trình để kiểm tra tính phù hợp hệ thống Phép thử có giá trị pic coixol pic lân cận tách hoàn toàn (Rs>1,5) Kết thực nghiệm cho thấy giá trị RSD % thời gian lưu diện tích pic 1,5 (Bảng 2) Như quy trình đạt tính phù hợp hệ thống Bảng 2: Kết thẩm định tính phù hợp hệ thống quy trình Lần tiêm mẫu Lần Lần Lần Lần Lần Lần TB SD RSD% Yêu cầu S 71216 73501 73884 73706 73220 74371 73316 1099,2 1,499 RSD < 2% Rt 10,40 10,38 10,40 10,41 10,39 10,391 10,394 0,0138 0,133 RSD < 2% N 19036,37 19147,83 19176,85 19311,4 19178,6 19063,23 19152,38 97,97997 0,511581 RSD < 2% k' 44,22 44,10 44,24 44,27 44,17 44,18 44,20 As 1,17 1,16 1,17 1,16 1,12 1,19 1,16303 α 1,25 1,25 1,33 1,33 1,33 1,25 1,29 Rs 4,74 5,11 9,07 9,15 9,33 4,66 7,01 Đạt Đạt Đạt Đạt 0,8 < As < 1,5 1,05 < a < Rs > 1,5 ’ k >1 Độ đặc hiệu Sắc kí đồ mẫu trắng Sắc kí đồ mẫu đối chiếu Sắc kí đồ mẫu thử Sắc kí đồ mẫu thử thêm đối chiếu Hình 1: Kết khảo sát tính đặc hiệu 104 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Triển khai sắc kí mẫu trắng, mẫu đối chiếu, mẫu thử mẫu thử thêm chất đối chiếu Quan sát thời gian lưu diện tích pic coixol mẫu Sắc kí đồ mẫu trắng khơng xuất pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu mẫu đối chiếu coixol, mẫu thử mẫu thêm chất đối chiếu có pic với thời gian lưu tương ứng với pic coixol, thêm chất đối chiếu vào mẫu thử, diện tích pic coixol tăng lên (Hình 1) Phổ UV-Vis pic coixol mẫu thử tương ứng với mẫu đối chiếu; pic coixol mẫu thử, mẫu đối chiếu, mẫu thử thêm chất đối chiếu đạt độ tinh khiết kiểm tra phần mềm Empower Tính tuyến tính Nồng độ khảo sát từ 1,0 đến 500 µg/mL Kết khảo sát cho thấy phương trình hồi qui y=10586x+5847,5 với hệ số tương quan R2 = 0,9998 (Hình 2) Theo trắc nghiệm t, hệ số a có ý nghĩa, hệ số b khơng có ý nghĩa Theo trắc nghiệm F phương trình tương thích với độ tin cậy 95% Như phương trình tuyến tính coixol ӯ = 10586X Nồng độ (µg/ml) 500 250 100 50 25 10 Diện tích đỉnh 5316897 2600811 1096068 553902 262399 110423 58272 9479 Nghiên cứu Y học Độ lặp lại Tiến hành xử lý sắc ký mẫu thử khác để thẩm định độ lặp lại Bảng trình bày kết thực khảo sát độ lặp lại, RSD hàm lượng coixol mẫu < 2% Kết cho thấy qui trình đạt độ lặp lại Bảng 3: Kết thẩm định độ lặp lại Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu TB SD RSD% Khối lượng mẫu (mg) Diện tích pic 30,0 30,0 300 30,0 30,0 30,0 71388 71466 73542 70715 73916 71766 72132,17 1289,162 1,787 Hàm lượng g/mg 0,80 0,80 0,82 0,79 0,82 0,80 0,805 0,012 1,787 Độ Sử dụng phương pháp thêm dung dịch chuẩn vào dung dịch thử tỷ lệ nồng độ để thẩm định độ Bảng trình bày kết khảo sát độ Nhận xét: Tỷ lệ phục hồi nằm khoảng 99,0 % -106,0 % Như qui trình có độ cao Bảng 4: Kết khảo sát độ Tỷ lệ % chuẩn KL thêm KL tìm Trung phục hồi thêm vào vào (µg) thấy (µg) bình % (%) 195 197 101,03 100,51 80% 195 201 103,08 RSD = 2,33 % 195 190 97,44 244 259 106,15 105,46 100 % 244 254 104,10 RSD = 0,97 % 244 259 106,15 295 303 102,71 104,41 120 % 295 309 104,75 RSD = 1,27 % 295 312 105,76 Áp dụng qui trình định lượng mẫu CTN Áp dụng qui trình tiến hành định lượng mẫu Cam thảo nam thu hái Tp HỒ CHÍ MINH 12 tháng (10/2017 -9/2018) mẫu Cam thảo nam thu hái địa phương Hình 2: Tương quan nồng độ diện tíc pic coixol Chuyên Đề Dược 105 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 khác vào tháng 3/2018 (kết trình bày Hình Hình 4) Hình 3: Khảo sát hàm lượng coixol mẫu Cam thảo nam thu hái 12 tháng TP Hồ Chí Minh Hình 4: Hàm lượng coixol mẫu CTN thu hái địa phương khác (3/2018) cao khoảng tháng 12-3, đề BÀNLUẬN xuất việc thu hái S dulcis nên tập trung vào Khảo sát hàm lượng coixol CTN theo thời gian thời gian thu hái cho thấy có thay đổi, từ Khảo sát hàm lượng coixol theo địa điểm tháng 12 - tháng 3, hàm lượng coixol dao động thu hái 12 tỉnh cho thấy hàm lượng coixol khoảng 1,9 -2,4 mg/g, từ tháng hàm mẫu S dulcis dao động khoảng lượng coixol mẫu bắt đầu giảm, 0,46 - 2,14 mg/g Hàm lượng coixol cao khoảng tháng - tháng 10 hàm lượng coixol với mẫu thu hái tỉnh Bình Dương (2,14 thấp < 1,0 mg/g Thời điểm thu hái thường mg/g), thấp tỉnh Gia Lai (0,46 mg/g) hướng dẫn tài liệu là: mùa Như vậy, hàm lượng coixol S dulcis thay xuân đến mùa hạ(2), qua kết khảo sát cho đổi theo vùng địa lý thu hái Các mẫu thu hái thấy hàm lượng coixol mẫu S dulcis 106 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 tỉnh phía Nam (Bình Dương, Đồng Nai, Long An, Bà Rịa – Vũng Tàu, TP Hồ Chí Minh) có hàm lượng cao tỉnh Tây Nguyên (Đắc Lắc, Gia Lai) KẾTLUẬN Qui trình định lượng coixol CTN xây dựng thẩm định đạt yêu cầu tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại, độ Qui trình áp dụng khảo sát hàm lượng coixol mẫu CTN thu hái TP Hồ Chí Minh 12 tháng mẫu thu hái tỉnh Kết cho thấy hàm lượng coixol CTN cao vào tháng 12-tháng 3, mẫu khảo sát hàm lượng coixol thay đổi khoảng 0,61 – 2,14 mg/g Nghiên cứu Y học Tandem Mass Spectrometry and UV Detection”, Biomedical chromatography, 31(10) Bộ Y tế (2018), Dược Điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 1096-1097 Hayashi T, Gotoh K, Ohnishi K, et al (1994), “6-Methoxy2-benzoxazolinone in Scoparia dulcis and its production by cultured tissues” Phytochemistry, 37(6), pp.1611-1614 International Conference on Harmonization (ICH), Q2B: Validation of Analytical Procedures: Methodology, May 1997 Jae H, Jiho L, Su R, Park H (2014), “Suppressive effects of coixol, glyceryl trilinoleate and natural products derived from Coix lachryma-jobi var ma-yuen on gene expression, production and secretion of airway MUC5AC mucin”, Archives of Pharmacal Research, 38(5), pp.620-627 Mishra MR, Behera RK, Jha S, et al (2011), “A brief review on phytoconstituents and ethnopharmacology of Scoparia dulcis Linn (Scrophulariaceae)”, International Journal of Phytomedicine, 3(4), pp.422-438 Report TD (2002), “Technical Data Report for Vassourinha (Scoparia dulcis)”, Austin, Texas: Sage Press Sharma KR, Adhikari A, Hafizur RM, et al (2015), “Potent insulin secretagogue from Scoparia dulcis L of nepalese origin”, Phytotherapy Research, 29(10), pp.1672-1675 Đề tài góp phần tạo sở cho việc nâng cao tiêu chuẩn kiểm nghiệm CTN Ngày nhận báo: 18/10/2018 TÀILIỆUTHAMKHẢO Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2018 Ngày báo đăng: 15/03/2019 Ali A, Haq FU, Arfeen Q, Sharma KR, Adhikari A, Musharraf SG (2017), “Sensitive Quantification of Coixol, a Potent Insulin Secretagogue, in Scoparia dulcis Extract using High Performance Liquid Chromatography combined with Chuyên Đề Dược 107 ... thể…(7) Cam thảo nam sử dụng phổ biến, nhiên tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng S dulcis chưa nâng cao Trong Dược điển Việt Nam V ban hành năm 2018, chuyên luận Cam thảo nam dừng tiêu định lượng chất... 105,76 Áp dụng qui trình định lượng mẫu CTN Áp dụng qui trình tiến hành định lượng mẫu Cam thảo nam thu hái Tp HỒ CHÍ MINH 12 tháng (10/2017 -9/2018) mẫu Cam thảo nam thu hái địa phương Hình 2: Tương... loãng mẫu đo, : Khối lượng dược liệu (mg), : Độ ẩm dược liệu (%), : Hàm lượng chất đối chiếu (%) Áp dụng quy trình xây dựng thẩm định để khảo sát hàm lượng coixol mẫu Cam thảo nam thu hái Tp Hồ