Đang tải... (xem toàn văn)
Quả Dành dành (Gardenia Fructus) với thành phần hóa học đặc trưng là các iridoid glycosid (trong đó 2 hoạt chất có hàm lượng cao là geniposid và gardenosid) được sử dụng từ bao đời nay với tác dụng điều trị tăng huyết áp. Dược điển Trung Quốc 2015 sử dụng geniposid là chất đánh dấu để kiểm nghiệm dược liệu Dành dành. Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào trong nước công bố quy trình định lượng geniposid trong cao khô Dành dành.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GENIPOSID TRONG CAO KHƠ DÀNH DÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Trần Thanh Tâm*, Nguyễn Đức Hạnh**, Huỳnh Trần Quốc Dũng***, Nguyễn Đức Tuấn** TÓMTẮT Mở đầu – Mục tiêu: Quả Dành dành (Gardenia Fructus) với thành phần hóa học đặc trưng iridoid glycosid (trong hoạt chất có hàm lượng cao geniposid gardenosid) sử dụng từ bao đời với tác dụng điều trị tăng huyết áp Dược điển Trung Quốc 2015 sử dụng geniposid chất đánh dấu để kiểm nghiệm dược liệu Dành dành Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nước cơng bố quy trình định lượng geniposid cao khơ Dành dành Vì vậy, việc xây dựng quy trình định lượng geniposid cao khô Dành dành phương pháp HPLC cần thiết, góp phần kiểm sốt chất lượng ngun liệu cao khô Dành dành trước đưa vào sản xuất thành phẩm Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: Cao khô Dành dành công ty cổ phần BV Pharma cung cấp Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát số điều kiện sắc ký pha động, cột sắc ký để phân tách geniposid cao khô Dành dành; Khảo sát số điều kiện chiết gineposid cao khô Dành dành dung môi chiết, tỷ lệ cao dung môi, thời gian chiết siêu âm; Thẩm định quy trình định lượng geniposid cao khô dành dành phương pháp HPLC-DAD theo hướng dẫn ICH bao gồm tính phù hợp hệ thống, tính chọn lọc, tính tuyến tính miền giá trị, độ xác, độ độ bền Kết quả: Đã xác định được điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng geniposid cao khô Dành dành phương pháp HPLC-DAD sau: cột sắc ký Gemini NX C18 (250 x 4,6 mm; µm), bước sóng phát 240 nm, pha động acetonitril – nước (15:85), thể tích tiêm mẫu 20 µl, tốc độ dòng 1,0 ml/phút Quy trình phân tích thẩm định đạt tính phù hợp hệ thống, có tính đặc hiệu, tính tuyến tính (ŷ = 0,4761x, R2 = 1,0000; 19,4 - 193,8 ppm) miền giá trị (61 – 92 ppm), độ lặp lại (RSD = 0,57%), độ xác trung gian (RSD = 0,49 %), độ với tỷ lệ hồi phục khoảng 100,27 – 101,46% độ bền với thay đổi cho phép thành phần acetonitril pha động ± 4% Kết luận: Quy trình định lượng geniposid cao khô Dành dành phương pháp HPLC-DAD xây dựng thẩm định thành công Quy trình áp dụng để định lượng geniposid cao khơ Dành dành, góp phần vào cơng tác kiểm tra chất lượng từ khâu nguyên liệu ban đầu Từ khóa: Gardenia Fructus, geniposid ABSTRACT DEVELOPMENT OF HPLC METHOD FOR DETERMINATION OF GENIPOSIDE IN GARDENIA FRUCTUS DRY EXTRACT Tran Thanh Tam, Nguyen Duc Hanh, Huynh Tran Quoc Dung, Nguyen Duc Tuan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 132 – 142 Background – Objectives: Gardenia Fructus has iridoid glycosides as the special chemical components in which geniposide and gardenoside have high content Gardenia Fructus have been used for * Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm – Mỹ phẩm Đồng Tháp Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh ***Bệnh viện Y học cổ truyền TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn ĐT: 0913799068 ** 132 Email: ductuan@ump.edu.vn Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học treatment of hypertension for many years In the Chinese Pharmacopoeia, the quality control index of Gardenia jasminoides is the content of geniposide So far, there has been no publication for quantitative determination of geniposide in Gardenia Fructus dry extract Therefore, this study was carried out with the aim of HPLC method development for determination of geniposide in Gardenia Fructus dry extract that contribute to quality control of the input herbal materials Method: The object of this study is Gardenia Fructus dry extract, which was supplied by BV Pharma joint-stock company Method: Several chromatographic conditions such as mobile phase and C18 column with different suppliers for separation of geniposide in Gardenia Fructus dry extract, and several extraction conditions such as solvent, ratio of solvent and dry extract, and extraction time by ultrasonic, were investigated Finally, the analytical procedure was validated according to ICH guidelines, including system suitability, selectivity, linearity and range, precision, accuracy and ruggedness Results: The appropriate chromatographic conditions for quantification of geniposide in Gardenia Fructus dry extract were obtained on Gemini-NX C18 column (250 x 4.6 mm; µm), DAD detector with detection wavelength at 240 nm, mixture of acetonitrile and water (15:85) as mobile phase, injection volume of 20 µL, flow rate of 1.0 ml/min Validation results showed that the method was suitable for the HPLC system, selective, linear (ŷ = 0.4761x, R2 = 1.0000, 19.4 – 193.8 ppm) and range (61 – 92 ppm), repeatability (RSD = 0.57%), intermediate precision (RSD = 0,49%), accurate with the recoveries in the range of 100.27 – 101.46% of the expected values The method was also ruggedness with the accepted fluctuation of acetonitrile within 4% in mobile phase Conclusion: The RP-HPLC method for determination of geniposide in Gardenia Fructus dry extract was successfully developed and validated The method can be applied for quantification of geniposide in Gardenia Fructus dry extracts that contribute to quality control of the input herbal materials Keywords: Gardenia Fructus, geniposide ĐẶTVẤNĐỀ Dành dành (Gardenia jasminoides Ellis., Rubiaceae), loài trồng phát triển tốt tỉnh miền Bắc nước ta, bật màu xanh bóng hoa thơm trắng ngần Đặc biệt, Dành dành với thành phần hóa học đặc trưng iridoid glycosid (trong hoạt chất có hàm lượng cao geniposid gardenosid) sử dụng từ lâu đời phương thuốc quý việc điều trị bệnh viêm gan, hạ huyết áp, đái tháo đường, lợi tiểu(4)…Dược điển Trung Quốc 2015 sử dụng geniposid chất đánh dấu để kiểm nghiệm dược liệu Dành dành Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nước cơng bố quy trình định lượng geniposid cao khơ Dành dành Vì vậy, việc xây dựng quy trình định lượng geniposid cao khô Dành dành phương pháp HPLC Chuyên Đề Dược cần thiết, góp phần kiểm sốt chất lượng ngun liệu cao khô Dành dành trước đưa vào sản xuất thành phẩm ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Cao khô Dành dành công ty cổ phần BV Pharma cung cấp Nguyên vật liệu Chất đối chiếu Geniposid (GP), hàm lượng 99,26%, Ban Nghiên Cứu Khoa Học – Thư Viện, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh cung cấp Trang thiết bị Hệ thống UHPLC Dionex Ultimate 3000, detector DAD – 3000 RS, cột sắc ký Gemini NX C18 (250 x 4,6 mm; µm) tiền cột Gemini NX C18 (4,0 x 3,0 mm; µm), cột Zorbax XDB C18 (250 x 4,6 mm; µm) tiền cột Zorbax 133 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 XDB C18 (12,5 x 4,6 mm; µm), cân phân tích A&D GH-202, bể siêu âm S60H – Elma lệ chiết phương pháp siêu âm Hóa chất dung mơ Acetonitril methanol đạt tiêu chuẩn dùng sắc ký lỏng (Merck) nước cất lần đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký lỏng Chọn tỷ lệ cao dung môi chiết theo tiêu chí Phương pháp nghiên cứu Khảo sát điều kiện HPLC định lượng geniposid cao khô Dành dành: Dựa vào cấu trúc hóa học GP tham khảo số tài liệu(3,5), kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo với đầu dò DAD lựa chọn với điều kiện sắc ký ban đầu sau: cột pha đảo C18 (250 x 4,6 mm; µm) tiền cột tương ứng, thể tích tiêm 20 µl, bước sóng phát bước sóng hấp thụ cực đại geniposid, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, pha động: acetonitril – nước Tiến hành khảo sát pha động cột sắc ký Qua khảo sát thực nghiệm, chọn điều kiện sắc ký thích hợp cho pic geniposid đạt độ tinh khiết (theo phổ UV-Vis), tách hồn tồn khỏi pic tạp (nếu có) có hệ số bất đối nằm khoảng 0,8 – 1,5 Khảo sát quy trình xử lý mẫu Khảo sát dung môi chiết GP Chiết lượng cao với dung môi khác methanol, methanol 70%, 50%, 30% (tỷ lệ cao dung môi chiết cố định) siêu âm 10 phút, chuẩn bị mẫu thử riêng biệt cho dung môi Tiến hành sắc ký dịch chiết Chọn dung môi chiết GP theo tiêu chí sau: diện tích pic chiều cao pic lớn nhất, hệ số bất đối nằm khoảng 0,8 – 1,5; độ phân giải lớn 1,5; pic GP tinh khiết (theo phổ UV-Vis) nồng độ methanol cao Khảo sát tỷ lệ cao dung môi chiết GP 10 phút Tiến hành sắc ký dịch chiết sau: hàm lượng GP chiết cao chiều cao pic GP khoảng 0,2 – 0,8 AU Khảo sát thời gian chiết Từ tỷ lệ cao dung môi chiết lựa chọn, tiến hành chiết siêu âm thời điểm 3, 5, 10 phút Chuẩn bị mẫu thử riêng biệt cho thời điểm Tiến hành sắc ký dịch chiết Chọn thời gian chiết cho hàm lượng GP chiết cao Thẩm định quy trình định lượng GP cao khơ Dành dành Quy trình định lượng geniposid cao Dành dành thẩm định theo hướng dẫn ICH(2) tính phù hợp hệ thống, tính chọn lọc, tính tuyến tính miền giá trị, độ xác, độ độ bền Chuẩn bị mẫu Mẫu đối chiếu GP gốc: Hòa tan lượng chất đối chiếu GP methanol 50% để dung dịch có nồng độ khoảng 2600 ppm Mẫu đối chiếu GP: Pha loãng mẫu đối chiếu GP gốc với methanol 50% để thu mẫu đối chiếu GP có nồng độ khoảng 77,5 ppm Mẫu thử: Được chuẩn bị dựa vào điều kiện khảo sát quy trình xử lý mẫu Mẫu trắng: dung mơi chiết pha động KẾTQUẢ Khảo sát điều kiện HPLC định lượng geniposid cao khô Dành dành Tiến hành khảo sát pha động acetonitril nước với tỷ lệ khác Hình minh họa Khảo sát tỷ lệ cao dung môi chiết sắc ký đồ mẫu đối chiếu, mẫu thử phổ UV lựa chọn theo tỷ lệ 1:1, 1:2 1:4 thời gian lưu GP với tỷ lệ pha động Chuẩn bị mẫu thử riêng biệt cho tỷ acetonitril – nước (15:85) 134 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Hình 1: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu, mẫu thử phổ UV thời gian lưu GP pic tạp khác Như vậy, pha động ACN – Nhận xét: Phổ UV thời gian lưu GP H2O (15:85) lựa chọn mẫu đối chiếu có cực đại hấp thụ 240 nm nên lựa chọn để định lượng GP Pic GP đạt độ tinh khiết (peak purity match = 1000), có hệ số bất đối 1,1 tách hồn tồn Hình Bảng minh họa kết khảo sát cột sắc ký pha đảo C18 từ hai nguồn cung cấp khác Hình 2: Sắc ký đồ mẫu thử khảo sát cột sắc ký Chuyên Đề Dược 135 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Bảng 1: Thông số sắc ký GP tương ứng với cột sắc ký khảo sát (n=3) Cột Zorbax XDB C18 Gemini NX C18 tR (Phút) 7,047 7,389 S (mAU*phút) 75,825 75,653 H (mAU) 377,258 442,885 As Rs1 Rs2 Nbk Độ tinh khiết 1,4 1,1 3,4 3,4 4,9 4,7 8765 12538 1000 1000 Rs1: độ phân giải GP pic liền trước Rs2: độ phân giải giửa GP pic liền sau Nhận xét: Pic GP đạt độ tinh khiết, có thời gian lưu (tR), diện tích pic (S) độ phân giải khơng khác nhiều hai cột Với cột Gemini NX C18, hệ số bất đối (As) pic GP 1,1; số đĩa lý thuyết biểu kiến (Nbk) lớn hơn, chiều cao pic (H) GP gấp 1,2 lần so với cột Zorbax XDB C18 Như vậy, cột Gemini NX C18 lựa chọn Khảo sát quy trình xử lý mẫu Khảo sát dung mơi chiết GP Hình Bảng minh họa kết khảo sát dung môi chiết GP Dung môi chiết Methanol Methanol 70% Methanol 50% Methanol 30% Hàm lượng GP (mg/g) 116,84 128,56 142,24 142,19 Hình 3: Hàm lượng GP chiết với dung môi chiết khác Bảng 2: Thông số sắc ký GP tương ứng với dung môi chiết khảo sát (n=3) Dung môi Methanol Methanol 70% Methanol 50% Methanol 30% tR (phút) 7,328 7,343 7,354 7,355 S (mAU*phút) 31,528 34,688 38,329 38,162 Nhận xét: Cả dung môi methanol, methanol 70%, 50%, 30% chiết GP, nhiên diện tích chiều cao pic GP chiết tăng dần theo thứ tự methanol < methanol 70% < methanol 50 % methanol 30%; Pic GP tinh khiết, đạt hệ số bất đối tách hoàn toàn pic tạp Như vậy, methanol 50% chọn làm dung môi chiết GP cao Dành dành 136 H (mAU) 157,172 201,762 227,751 227,243 As Rs1 Rs2 Nbk Độ tinh khiết 0,94 1,05 1,06 1,07 4,0 4,5 4,4 4,4 3,5 4,6 4,8 4,8 8878 12194 12715 12808 1000 1000 1000 1000 Khảo sát tỷ lệ cao dung mơi chiết GP Hình Bảng minh họa kết khảo sát tỷ lệ cao dung môi chiết GP Tỷ lệ cao dung môi (mg/ml) 1:1 1:2 1:4 Hàm lượng GP (mg/g) 142,27 142,24 142,36 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Hình 4: Hàm lượng GP chiết với tỷ lệ cao dung môi chiết khác Bảng 3: Thông số sắc ký GP tương ứng với tỷ lệ cao dung môi chiết khác (n=3) Tỷ̉ ̣ lệ cao dung môi chiết (mg/ml) 1:1 1:2 1:4 tR (Phút) 7,344 7,354 7,343 S (mAU*phút) 76,931 38,329 19,129 H (mAU) 448,304 227,751 114,887 Nhận xét: Các thông số sắc ký GP đạt hàm lượng GP chiết với tỷ lệ cao dung môi chiết khảo sát tương đương nhau, tiến hành sắc ký dịch chiết lần không phát GP, chứng tỏ GP chiết kiệt từ cao khô Dành dành Với tỷ lệ cao dung môi chiết 1:2, chiều cao pic GP khoảng 227 mAU cao qui tỷ lệ cao dung mơi chiết 1:1 Ngồi ra, tín hiệu chiều cao khoảng 0,23 AU tín hiệu nằm khoảng tuyến tính theo định luật Lambert-Beer sử dụng đầu dò DAD As Rs1 Rs2 Nbk Độ tinh khiết 1,06 1,06 1,06 4,6 4,4 4,6 4,7 4,8 5,2 12781 12715 12915 1000 1000 1000 thích hợp cho trình định lượng cao dược liệu Như vậy, tỷ lệ cao dung môi chiết 1:2 lựa chọn Khảo sát thời gian chiết siêu âm Hình Bảng minh họa kết khảo sát thời gian chiết GP cao Dành dành Thời gian chiết siêu âm phút phút 10 phút Hàm lượng GP (mg/g) 142,24 142,15 142,24 Hình 5: Hàm lượng GP chiết với thời gian chiết khác Chuyên Đề Dược 137 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Bảng 4: Thông số sắc ký GP tương ứng với thời gian chiết khác (n=3) Thời gian chiết siêu âm phút phút 10 phút tR (Phút) 7,344 7,341 7,354 * S (mAU*phút) 38,330 38,407 38,329 H (mAU) 228,556 228,172 227,751 As Rs1 Rs2 Nbk Độ tinh khiết 1,06 1,05 1,06 4,6 4,7 4,4 4,7 4,8 4,8 12781 12690 12715 1000 1000 1000 Nhận xét: Hàm lượng GP chiết với sắc ký Gemini NX C18 (250 x 4,6 mm; µm), thời gian chiết khảo sát tương đương đầu dò DAD với bước sóng phát 240 nm, Như vậy, thời gian chiết siêu âm phút thể tích tiêm 20 µl, pha động ACN – H2O lựa chọn (15:85, tt/tt), tốc độ dòng ml/phút, thời gian Tóm lại, geniposid cao khô Dành sắc ký 11 phút dành chiết với tỷ lệ cao methanol 50% Thẩm định quy trình 1:2, chiết lần phương pháp siêu âm Tính phù hợp hệ thống Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống trình bày Bảng phút Điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng GP cao khơ Dành dành cột Bảng 5: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu đối chiếu GP mẫu thử (n=6) Mẫu Đối chiếu Thử Giá trị thống kê TB RSD TB RSD tR (Phút) 7,373 0,10% 7,373 0,13% S (mAU*phút) 37,028 0,14% 36,686 0,09% H (mAU) 218,613 0,30% 216,835 0,39% As Rs1 Rs2 1,1 1,1 Nbk 12791 4,5 7,2 12712 Nhận xét: RSD thời gian lưu, diện pic GP mẫu đối chiếu Sắc ký đồ tích chiều cao pic GP mẫu đối chiếu mẫu thử xuất pic có thời gian lưu mẫu thử nhỏ 2,0%; Độ phân giải tương đương với pic GP sắc ký đồ pic GP mẫu thử lớn 1,5 hệ số bất mẫu đối chiếu Trên sắc ký đồ mẫu thử, đối pic GP nằm khoảng 0,8 – 1,5 Như pic GP tách hoàn toàn pic tạp Khi vậy, quy trình định lượng GP cao khơ thêm chất đối chiếu GP vào mẫu thử Dành dành đạt tính phù hợp hệ thống diện tích chiều cao pic GP tăng Phổ Tính chọn lọc UV thời gian lưu GP mẫu thử Hình minh họa kết khảo sát tính mẫu đối chiếu giống có cực chọn lọc quy trình định lượng GP đại hấp thụ 240 nm Pic GP sắc cao khô Dành dành Kết khảo ký đồ mẫu đối chiếu mẫu thử tinh sát tính chọn lọc cho thấy sắc ký đồ mẫu khiết (theo phổ UV) Như vậy, quy trình trắng khơng xuất pic khoảng định lượng GP cao khô Dành dành thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu đạt tính chọn lọc 138 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Hình 6: Kết khảo sát tính chọn lọc phương pháp định lượng GP (a)mẫu trắng, (b) mẫu đối chiếu, (c) mẫu thử, (d) mẫu thử thêm chất đối chiếu, (e) phổ UV thời gian lưu GP mẫu đối chiếu, (f) phổ UV thời gian lưu GP mẫu thử, (g) sắc ký đồ chiều mẫu đối chiếu, (h) sắc ký đồ chiều mẫu thử Chuyên Đề Dược 139 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Tính tuyến tính Kết khảo sát mối tương quan diện tích pic nồng độ GP trình bày Bảng Bảng 6: Kết khảo sát tính tuyến tính GP Nồng độ GP (ppm) - X 19,4 38,8 77,5 116,3 155,0 193,8 Diện tích pic (mAU*phút) - Y 9,222 18,393 36,973 55,384 73,871 92,198 Nhận xét: Hệ số b = 0,0037 có p = 0,94 > 0,05 nên khơng có ý nghĩa Hệ số tương quan bình phương r2 = 1,0000 có tương quan tuyến tính nồng độ GP diện tích pic Vậy phương trình hồi quy xác định nồng y = 0,4761x + 0,0037 R = 1,0000 độ GP theo diện tích pic ŷ = 0,4761x Độ xác Kết thẩm định độ lặp lại độ xác trung gian quy trình định lượng GP cao Dành dành trình bày Bảng Bảng 7: Kết thẩm định độ lặp lại độ xác trung gian quy trình định lượng GP cao khơ Dành dành (n=9) Người phân tích Người phân tích 2: Ngày phân tích: 21/05/2018 Ngày phân tích: 22/05/2018 n Hệ thống HPLC: Ultimate 3000 Hệ thống HPLC: Ultimate 3000 Khối lượng cao Diện tích pic Hàm lượng GP Khối lượng cao Diện tích pic Hàm lượng GP (mg) (mAU*phút) (mg/g) (mg) (mAU*phút) (mg/g) 19,8 28,386 150,0 20,3 28,748 151,3 19,9 28,353 149,1 20,4 28,828 151,0 19,7 28,294 150,3 20,3 28,821 151,7 24,6 35,278 150,1 25,4 35,867 150,9 24,6 35,248 150,0 25,5 35,908 150,5 24,5 35,261 150,6 25,2 35,741 151,6 29,9 43,253 151,4 31,2 43,802 150,0 29,9 43,249 151,4 31,5 44,567 151,2 29,8 43,214 151,8 31,2 44,141 151,2 Trung bình: 150,5 (mg/g) Trung bình: 151,1 (mg/g) RSD: 0,57% RSD: 0,37% Kết phân tích 02 người phân tích - Trung bình: 150,8 (mg/g) - RSD: 0,49% Độ sai khác kết định lượng trung bình - Giữa hai người phân tích: 0,26% - Giữa người phân tích với kết trung bình hai người phân tích + Người phân tích 1: -0,18% + Người phân tích 2: +0,08% Nhận xét: RSD hàm lượng GP Độ cao khô Dành dành mẫu thử Kết thẩm định độ quy người phân tích nhỏ 2,0%; Độ sai lệch trình định lượng GP cao Dành dành hàm lượng GP người phân tích nhỏ trình bày Bảng 2,0% Như vậy, quy trình định lượng GP cao khơ Dành dành đạt độ xác 140 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Bảng 8: Kết thẩm định độ quy trình định lượng GP cao khô Dành dành (n=9) Mẫu n 80% Khối lượng cao (mg) 25,0 25,1 25,0 100% 25,1 25,0 25,3 120% 25,1 25,0 24,9 Lượng chất đối chiếu thêm vào (mg) 3,10 3,10 3,10 TB RSD 3,76 3,76 3,76 TB RSD 4,52 4,52 4,52 TB RSD Nhận xét: Tại mức nồng độ, tỷ lệ thu hồi nằm khoảng 98 – 102% RSD GP mức nồng độ nhỏ 2,0% Như vậy, quy trình định lượng GP cao khô Dành dành đạt độ Dựa theo kết thẩm định độ xác Diện tích pic (mAU*phút) 65,486 65,422 65,506 Lượng chất đối chiếu tìm lại (mg) 72,259 72,305 72,271 3,81 3,83 3,78 79,563 79,464 79,469 4,58 4,58 4,60 3,11 3,09 3,12 Tỷ lệ thu hồi (%) 100,47 99,77 100,54 100,26 0,43% 101,35 101,88 100,58 101,27 0,64% 101,28 101,38 101,73 101,46 0,23% độ đúng, miền giá trị quy trình định lượng từ 61 – 92 ppm Độ bền Kết thẩm định độ bền trình bày Hình Bảng Hình 7: Sắc ký đồ mẫu thử cao Dành dành thẩm định độ bền Bảng 9: Thông số sắc ký GP thẩm định độ bền (n=3) Pha động ACN – H2O Giá trị thống (tt/tt) kê 11:89 19:81 TB RSD TB RSD tR (Phút) 14,496 0,11% 4,722 0,21% S (mAU*phút) 34,962 0,08% 35,462 0,12% H (mAU) 100,430 0,63% 350,982 0,47% As Rs1 Rs2 Nbk 1,1 5,3 5,5 11621 1,1 1,5 4,4 14345 Nhận xét: Khi thay đổi tỷ lệ ACN ± 4% so với điều kiện pha động ban đầu thơng số sắc ký đáp ứng yêu cầu tính phù hợp hệ thống đạt tính phù hợp hệ thống, có tính chọn lọc, khoảng tuyến tính rộng, đạt độ xác độ theo Hướng dẫn ICH Như vậy, quy trình định lượng GP cao khô Dành dành phương pháp HPLC-DAD Phổ UV thời gian lưu GP khoảng bước sóng 200 – 400 nm có cực đại Chuyên Đề Dược BÀNLUẬN 141 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 hấp thụ 240 nm, nên chọn làm bước sóng để định lượng GP, bước sóng tương tự với bước sóng sử dụng để định lượng GP dịch chiết Dành dành(1,3,5) Kết khảo sát cột sắc ký cho thấy cột Gemini NX C18 thích hợp cho q trình định lượng GP cao khơ Dành dành so với cột Zorbax Eclipse XDB C18 (chỉ ổn định khoảng pH – 9) Điều giải thích cột Gemini sản xuất theo công nghệ TWIN - NX (Two-In-One): giai đoạn cuối trình sản xuất hạt silica, lớp silica hữu đặc biệt thêm vào để tạo loại hạt hoàn toàn với cấu trúc silica bên không bị biến đổi nên trì độ bền học hiệu tốt, lớp silica hữu bên bảo vệ phân tử silica khỏi tác nhân hóa học Những liên kết chéo silosan thay liên kết với gốc ethylen nên giúp hạt silica bền vững môi trường pH cao Thêm vào đó, việc liên kết nhóm trimethylsilosan nhóm silanol tự dẫn đến nhóm silanol khơng thể tương tác với chất phân tích nên cải thiện tình trạng pic bị kéo đuôi Cao khô Dành dành chiết dung môi nước, nên dung môi methanol với nồng độ khác (100%, 70%, 50%, 30%) sử dụng làm dung môi chiết xuất GP để giảm tạp phân cực, nồng độ methanol cao, tạp phân cực dịch chiết giảm Các kết khảo sát ban đầu việc lựa chọn dung môi chiết phương pháp sắc ký lớp mỏng cho thấy dịch chiết có cường độ màu vết GP, số lượng tạp cường độ màu tạp không khác Tuy nhiên, phân tích dịch chiết 142 phương pháp HPLC thấy khác biệt hàm lượng GP chiết dung môi KẾTLUẬN Quy trình định lượng geniposid cao khơ Dành dành phương pháp HPLC với đầu dò DAD xây dựng thẩm định, sử dụng chương trình rửa giải đẳng dòng pha động đơn giản (acetonitril nước) Quy trình chứng minh đạt tính chọn lọc, tính phù hợp hệ thống, tính tuyến tính (ŷ = 0,4761x, R2 = 1,0000; 19,4 – 193,8 ppm) miền giá trị (61 – 92 ppm), độ lặp lại (RSD = 0,57%), độ xác trung gian (RSD = 0,49 %), độ với tỷ lệ hồi phục khoảng 100,27 – 101,46% độ bền với thay đổi cho phép thành phần acetonitril pha động ± 4% Quy trình áp dụng để định lượng geniposid cao khơ Dành dành, góp phần vào công tác kiểm tra chất lượng từ khâu nguyên liệu ban đầu TÀILIỆUTHAMKHẢO Bộ Y tế (2017) Dược điển Việt Nam V, tr 1132-1133 Nhà xuất Y học Hà Nội, Hà Nội ICH Harmonised tripartite guideline (2005) Validation of analytical procedures: text and methodology, pp – 13 Pharmacopedia of The people’s Republic of China (2015), pp 182-183, 207-208 Viện Dược liệu (2004) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 1, tr 596-600, 800-807 Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Wang XS, Wu YF, Dai SL, Chen R, Shao Y (2012) Ultrasound-assisted extraction of geniposide from Gardenia jasminoides Ultrasonics Sonochemistry, 19: pp 1155–1159 Ngày nhận báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2018 Ngày báo đăng: 15/03/2019 Chuyên Đề Dược ... chiết Chọn thời gian chiết cho hàm lượng GP chiết cao Thẩm định quy trình định lượng GP cao khơ Dành dành Quy trình định lượng geniposid cao Dành dành thẩm định theo hướng dẫn ICH(2) tính phù... 142 phương pháp HPLC thấy khác biệt hàm lượng GP chiết dung môi KẾTLUẬN Quy trình định lượng geniposid cao khơ Dành dành phương pháp HPLC với đầu dò DAD xây dựng thẩm định, sử dụng chương trình. .. Kết thẩm định độ lặp lại độ xác trung gian quy trình định lượng GP cao Dành dành trình bày Bảng Bảng 7: Kết thẩm định độ lặp lại độ xác trung gian quy trình định lượng GP cao khơ Dành dành (n=9)