Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết nghiên cứu về tác dụng ức chế của Hopeaphenol và Malibatol A tách từ vỏ cây sao đen đối với Enzim màng và quá trình đường phân của vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus Mutans. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu.
31(3): 65-70 Tạp chí Sinh học 9-2009 TáC DụNG ứC CHế CủA HOPEAPHENOL Và MALIBATOL A TáCH Từ Vỏ CÂY SAO ĐEN ĐốI VớI ENZIM MàNG Và QUá TRìNH ĐƯờNG PH¢N CđA VI KHN G¢Y S¢U R¡NG Streptococcus mutans NGUN QUANG HUY, PHAN TUấN NGHĩA Trờng đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG HN Theo số liệu điều tra gần Viện Răng Hàm Mặt Trung Ương, khoảng 90% dân số Việt Nam mắc bệnh miệng, phổ biến sâu viêm quanh Bệnh sâu bệnh truyền nhiễm vi khuẩn đờng miệng gây Bệnh sâu gây ảnh hởng tới sức khỏe ngời bệnh, chữa trị bệnh sâu có chi phí cao Trong số vi khuẩn đờng miệng Streptococcus mutans đợc coi nguyên nhân gây bệnh sâu vi khuẩn có khả sinh axit chịu axit [1, 4] Các nghiên cứu giới cho thấy, việc sử dụng chất kháng khuẩn biện pháp hữu hiệu để phòng ngừa sâu bệnh miệng [8, 9] Hiện nay, fluo đợc cho chất kháng khuẩn chống sâu có hiệu cao đợc sử dụng rộng r i sản phẩm vệ sinh bảo vệ Tuy nhiên, tình trạng nhiễm fluo đợc phát cộng đồng dân c đ khiến nhà nghiên cứu phải cân nhắc việc sử dụng fluo tìm thêm chất để sử dụng kết hợp với fluo nồng độ thấp mà có hiệu việc chống sâu Chất kháng khuẩn tự nhiên đ thu hút đợc quan tâm nhiều nhà khoa học giới Việt Nam [3, 8, 10] Tại Việt Nam, kết ®iỊu tra cho thÊy nhiỊu c©y thc d©n gian nh− đen, sắn thuyền, măng cụt có hoạt tính ức chÕ sinh axit vµ diƯt vi khn S mutans [9, 10] Tác dụng chống sâu dịch chiết thực vật đợc phát có liên quan đến khả ức chế enzim tham gia trình sinh axit, chịu axit, tiêu thụ oxy hay enzim chống tổn thơng oxy hóa [6] Kết nghiên cứu trớc [10] cho thấy dịch chiết ethanol từ vỏ đen có tác dụng øc chÕ sinh axit, diƯt vi khn S mutans GÇn phơng pháp sắc ký, khối phổ, cộng hởng từ hạt nhân đ tách, tinh xác định đợc cấu trúc hai chất thuộc nhóm polyphenol từ vỏ đen hopeaphenol (C56H42O12) malibatol A (C28H20O7) [11] Trong báo này, trình bày kết nghiên cứu ảnh hởng hopeaphenol malibatol A tách đợc từ vỏ đen lên số trình sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn gây sâu S mutans GS-5 Các kết nghiên cứu góp phần hiểu rõ chế tác dụng hopeaphenol malibatol A S mutans làm sở cho việc ứng dụng chất vào sản phẩm bảo vệ miệng Từ khoá: Streptococcus mutans, sâu răng, hopeaphenol, malibatol A I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Nguyên liệu Chủng vi khuẩn Streptococcus mutans GS-5 quà tặng giáo s Robert E Marquis, Trờng Đại học Rochester, Mỹ Hopeaphenol malibatol A đợc tách chiết từ vỏ đen theo quy trình Nguyễn Quang Huy cs [11] Phơng pháp a Giữ nuôi cấy c¸c chđng vi khn C¸c chđng vi khn dïng cho nghiên cứu đợc giữ cấy chuyển hàng tuần lên môi trờng thạch TSA (tryptic soy agar) hàng Difco (Mỹ) Tế bào đợc nuôi tĩnh hay nuôi cấy lắc 37C môi trờng chứa 3% trypton, 0,5% dịch chiết nấm men 1% glucose b Chuẩn bị dịch tế bào thấm Tế bào sau nuôi đợc rửa dung dịch muối khoáng 1x (50 mM KCl, mM 65 Tác dụng gây chết S mutans đợc tiến hành theo phơng pháp Phan cs [12] Tác dụng gây chết chất nghiên cứu đợc đánh giá giá trị D= LogN/No, No số vi khuẩn ban đầu, N số vi khuẩn thời điểm nghiên cứu Giá trị D tơng ứng với LogN/No = -1 thời gian cần thiết để 90% quần thể vi khuẩn bị tiêu diệt d Các phơng pháp nghiên cứu enzim Hoạt tính NADH oxidase đợc xác định 25C theo phơng pháp Poole Claiborne [14] Hoạt độ enzim ATPase đợc xác định theo phơng pháp Sturr Marquis [15] Hoạt độ enzim phospho transferase system (PTS) đợc xác định theo phơng pháp Belli tập thể [2] Hoạt độ enzim pyruvate kinase (PK) đợc xác định nh mô tả Phan Marquis [13 ], hoạt độ lactate dehydrogenase đợc xác định theo phơng pháp Iwami cs [5] II KếT QUả Và THảO LUậN Tác dơng cđa hopeaphenol vµ malibatol A øc chÕ sinh axit diệt vi khuẩn S mutans GS-5 a Tách dụng øc chÕ sù sinh axit cña S mutans GS-5 tõ hopeaphenol malibatol A Khả gây sâu S mutans gắn liền với đặc tính sinh axit mạnh môi trờng d thừa đờng, vậy, tìm hiểu tác dụng ức chế khả sinh axit S mutans thờng thí nghiệm khởi đầu nghiên cứu chất chống sâu Kết hình cho thấy hopeaphenol malibatol A cã t¸c dơng øc chÕ sinh axit cđa S 66 mutans GS-5 Víi nång ®é mM sau 90 phút thí nghiệm pH mẫu nghiên cứu dao ®éng kho¶ng tõ 4,9 ®Õn 5,1 ë mẫu đối chứng giá trị pH cuối 3,8 Hopeaphenol malibatol A có hoạt tính ức chế sinh axit S mutans tơng đơng với phân đoạn tách đợc từ dịch chiết vỏ măng cụt nghiên cứu Nguyễn Thị Mai Phơng cs [9] 7.5 6.5 Giá trị pH MgCl2) đợc hoà lại đệm Tris- HCl 50 mM, pH 7,5 có bæ sung MgCl2 mM, KCl 50 mM cho mật độ tế bào tơng đơng OD700 = 14, bổ sung thªm 10% toluen, đ ë 37°C chuyển sang làm đông đá nitơ lỏng phút, bớc làm đông-làm tan đợc lặp lại hai lần, toluen sau đợc loại bỏ ly tâm Kết tủa tế bào đợc hòa tan trở lại ®Ưm Tris-HCl pH 7,5 víi thĨ tÝch b»ng 1/10 thể tích ban đầu Dịch tế bào chuẩn bị đợc sư dơng c¸c thÝ nghiƯm víi enzim c T¸c dụng diệt khuẩn chất nghiên cứu 5.5 4.5 3.5 20 40 60 80 100 Thời gian (phút) Hình Tác dụng hopeaphenol malibatol A lªn sù sinh axit cđa S mutans GS-5 §èi chøng ( ); hopeaphenol ( ); malibatol A ( ) b T¸c dơng diƯt khn S mutans cđa hopeaphenol vµ malibatol A ThÝ nghiƯm diƯt khn S mutans GS-5 đợc tiến hành pH pH Kết nghiên cứu cho thấy, hopeaphenol với nồng độ mM có giá trị D tơng ứng pH 45 phút pH 60 Víi nång ®é mM malibatol A cã giá trị D tơng ứng 16 32 phút pH pH (hình 2) Kết cho thấy, hopeaphenol malibatol A có tác dụng ức chế sinh axit mà có tác dụng diệt vi khuẩn S mutans Khả giết S mutans cđa hopeaphenol còng nh− malibatol A ë pH cao so với pH tơng tự nh kết thu đợc từ dịch chiết vỏ đen [10] Khả diệt S mutans pH tốt so với pH hopeaphenol malibatol A đáng quan tâm men bị bào mòn môi trờng axit S mutans sinh thân lại sống đợc môi trờng nµy 0 -1 -1 log N/No log N/No -2 -3 -2 -3 15 30 45 60 15 30 Thêi gian (phót) 45 60 Thêi gian (phót) H×nh Khả diệt S mutans GS-5 pH (trái) pH (phải) hopeaphenol, malibatol A Đối chøng ( ); hopeaphenol 0,75 mM ( ), mM ( ); malibatol A mM (), mM ( ) Tác dụng hopeaphenol malibatol A lên số enzim quan trọng S mutans Khả thích nghi môi trờng axit S mutans liên quan đến nhiều chế khác nhau, quan trọng hoạt động bơm proton hệ thống F-ATPase Hệ thống có chức bơm proton ngoài, trì pH nội bào ổn định tế bào S mutans môi trờng ngoại bào bị axit hóa [1, 15] Đờng phân khả sử dụng đờng glucose chức vi khuẩn gây bệnh sâu giúp chúng tồn sinh trởng môi trờng axit [2] Việc nghiên cứu ảnh hởng chất tinh lên hoạt độ enzim trình đờng phân, vận chuyển đờng sở cho việc giải thích chế tác dụng chất lên S mutans [7, 13] Để kiểm tra giả thiết này, đ nghiên cứu tác dụng hopeaphenol malibatol A lên sè enzim quan träng cđa S mutans lµ F-ATPase, phospho transferase, pyruvate kinase, lactate dehydrogenase NADH oxidase a Tác dụng hopeaphenol malibatol A lên hoạt độ ATPase hopeaphenol nång ®é 1,3 mM hay malibatol A nång ®é 0,75 mM ức chế 50% hoạt độ ATPase S mutans GS-5 Với nồng độ hopeaphenol malibatol A mM hoạt độ ATPase bị ức chế tới 80% Tác dụng ức chế ATPase hopeaphenol malibatol A giải thích phần tác dụng diệt vi khuẩn S mutans GS-5 pH axit dịch chiết vỏ đen nghiên cứu trớc [10] F-ATPase enzim màng tế bào, có vai trò quan trọng trình vận chuyển proton qua màng, liên quan đến khả chịu axit S mutans Kết nghiên cứu ảnh hởng hopeaphenol malibatol A lên hoạt độ F-ATPase (hình 3) cho thấy Hopeaphenol ( ); malibatol A ( ) 100 Hoạt độ lại (%) 80 60 40 20 0 Nồng độ (mM) Hình ảnh hởng hopeaphenol malibatol A lên hoạt độ ATPase S mutans GS-5 b Tác dụng hopeaphenol malibatol A lên hoạt độ phosphotranspherase (PTS) Enzim chuyển gốc phosphate (PTS) có vai trò việc phosphoryl hoá glucose 67 hoạt độ enzyme lại (%) S mutans Do đ tiến hành tìm hiểu tác dụng hopeaphenol malibatol A lên hoạt độ enzim S mutans GS-5 Tế bào thấm đợc ủ với hopeaphenol hay malibatol A nồng độ khác 10 phút, sau hoạt độ enzim lại đợc xác định Kết thí nghiệm (hình 4) cho thấy hai hợp chất nồng độ 0,75 mM đ ức chế đợc 50% hoạt độ PTS Với nồng độ hợp chất tăng 1,5 mM hoạt độ PTS lại dới 30% Tác dụng ức chế PTS góp phần giải thích nguyên nhân hopeaphenol malibatol A dịch chiết Sao đen ức chế sinh axit cña S mutans GS-5 100 80 60 40 20 0 0.5 1.5 nång ®é (mM) Chúng tiến hành nghiên cứu ảnh hởng hopeaphenol vµ malibatol A tíi lactate dehydrogenase, lµ enzim xóc tác cho phản ứng chuyển hoá pyruvate thành lactate với có mặt NADH Khả ức chế hoạt ®é cđa hopeaphenol, malibatol A ®èi víi lactate dehydrogenase lµ thấp so với tác dụng chúng lên F-ATPase hay PTS Với nồng độ tơng ứng 2,5 mM 2,3 mM hopeaphenol malibatol A, 50% hoạt độ enzim lactate dehydrogenase bị ức chế (hình 5) d Tác dụng hopeaphenol malibatol A lên hoạt độ pyruvate kinase Pyruvate kinase enzim trình đờng phân Enzim xúc tác cho phản ứng chuyển hoá phosphoenol pyruvate có mặt ADP thành pyruvate ATP Tơng tự nh lactate dehydrogenase, nồng độ tơng ứng 2,5 mM 2,2 mM, hopeaphenol malibatol A ức chế 50% hoạt độ cđa pyruvate kinase (h×nh 6) ViƯc øc chÕ pyruvate kinase hopeaphenol, malibatol A góp phần giải thích dịch chiết Sao đen nh hợp chất đ ức chế trình sản xuất axit S mutans GS-5 Hình ảnh hởng hopeaphenol malibatol A lên hoạt độ enzim phosphotranspherase S mutans GS-5 Hoạt độ lại (%) Hopeaphenol ( 100 ); malibatol A ( ) c Tác dụng hopeaphenol malibatol A lên hoạt độ lactate dehydrogenase Hoạt độ lại (%) 100 60 40 20 80 60 Nồng độ (mM) 40 Hình ảnh hởng hopeaphenol malibatol A lên hoạt độ piruvate kinase cña S mutans GS-5 20 0 Nồng độ (mM) Hình ảnh hởng hopeaphenol malibatol A lên hoạt độ lactate dehydrogenase S mutans GS-5 Hopeaphenol ( ); malibatol A ( ) 68 80 Hopeaphenol ( ); malibatol A ( ) e T¸c dơng hopeaphenol malibatol A lên hoạt độ NADH oxidase Trong trình hô hấp vi khuẩn xoang miệng sinh gốc oxy hoạt động có khả gây tổn thơng oxy hoá lên tế bào [7, 14] Hot ủ cũn li (%) Để bảo vệ tế bào khỏi tổn thơng oxy hoá, hàng loạt enzim bảo vệ đ đợc sinh tổng hợp có NADH oxidase (NOX) Nhờ NADH oxidase, trình khử đơn trị oxy đợc hạn chế, hạn chế trình hình thành gốc oxy hoạt động Do vậy, NADH oxidase enzim chủ yếu tiêu thụ oxy vi khuẩn S mutans đợc xem có vai trò chống tổn thơng oxy hoá Kết thu đợc (hình 7) cho thấy NADH oxidase đ bị tới 50% hoạt ®é cã mỈt hopeaphenol ë nång ®é 1,5 mM malibatol A nồng độ mM Nh vậy, NOX nhạy cảm với hopeaphenol malibatol A chịu axit NADH oxidase liên quan đến trình tiêu thụ oxy TàI LIệU THAM KHảO Bender G R et al., 1986: Infect Immun., 53: 331-338 Belli W A and Marquis R E., 1994: Oral Microbiol Immunol., 9: 29-34 Chen C P et al., Ethnopharmacol., 27: 285-295 1989: J Hamada S and Slade H D., 1980: Microbiol Rev., 44: 331-384 90 Iwami Y et al., 1992: Oral Microbiol Immunol., 7: 304-308 70 Murata R M et al., 2008: FEMS Microbiol Lett., 282:174-181 50 30 Nguyễn Thị Mai Phơng, Robert E Marquis, 2006: Tạp chÝ Sinh häc, 28: 6670 10 Ngun ThÞ Mai Phơng, Bùi Tuyết Anh, 2007: Tạp chí Dợc liệu, 12: 19-23 Nồng độ (mM) H×nh ảnh hởng hopeaphenol malibatol A lên hoạt độ NADH oxidase cđa S mutans GS-5 Ngun ThÞ Mai Phơng cs., 2004: Tạp chí Dợc học, 44: 18-21 10 Nguyễn Quang Huy cs., 2005: Tạp chí Dợc häc, 45: 13-19 Hopeaphenol ( ); malibatol A ( ) 11 Nguyễn Quang Huy cs., 2007: Tạp chí Dợc häc, 47: 37-39 III KÕT LUËN 12 Phan T N et al., 2000: Arch Microbial., 174: 248-255 Hopea phenol, malibatol A có tác dụng ức chế sinh axit giết vi khuÈn S mutans 13 Phan T N and Marquis R E., 2006: Can J Microbiol., 52: 977-983 C¬ chÕ tác dụng hopea phenol, malibatol A lên S mutans chất ức chế hoạt độ enzim phosphoryl hoá đờng, lactate dehydrogenase, pyruvate kinase liên quan đến trình sinh axit, ATPase liên quan đến trình 14 Pool L B and Claiborne A., 1986: J Biol Chem., 261: 14525-14533 15 Sturr M G and Marquis R E., 1992: Appl Environ Microbiol., 58: 2287-2291 69 EFFECTS OF HOPEAPHENOL AND MALIBATOL A ISOLATED FROM BARK OF Hopea odorata Roxb ON MEMBRANE ENZYMES AND GLYCOLYSIS OF Streptococcus mutans NGUYEN QUANG HUY, PHAN TUAN NGHIA Summary Hopeaphenol and malibatol A isolated from the bark of Hopea odorata Roxb were found to have a multitarget effect for the dental caries pathogen Streptococcus mutans Hopeaphenol and malibatol A at a concentration of mM inhibited acid production by Streptococcus mutans GS-5 in a pH-drop assay with excess glucose Both the compounds at milimolar concentrations were also found to be highly lethal for S mutans GS-5 and their lethal effect at pH was stronger than that at pH Our further studies indicated that hopeaphenol and malibatol A in the same range of concentrations inhibited the activity of membrane enzymes (F-ATPase, phosphoenol pyruvate: phosphotransferase system), glycolyic enzymes (pyruvate kinase, lactate dehydrogenase) and NADH oxidase of S mutans The obtained results suggested that the two compounds could have a potential use in oral care products Ngµy nhËn bµi: 29-4-2009 70 ... cứu tác dụng hopeaphenol malibatol A lên số enzim quan träng c a S mutans lµ F-ATPase, phospho transferase, pyruvate kinase, lactate dehydrogenase NADH oxidase a Tác dụng hopeaphenol malibatol A. .. ATPase hopeaphenol nồng ®é 1,3 mM hay malibatol A nång ®é 0,75 mM ức chế 50% hoạt độ ATPase S mutans GS-5 Với nồng độ hopeaphenol malibatol A mM hoạt độ ATPase bị ức chế tới 80% Tác dụng ức chế. .. hopeaphenol malibatol A, 50% hoạt độ enzim lactate dehydrogenase bị ức chế (hình 5) d Tác dụng hopeaphenol malibatol A lên hoạt độ pyruvate kinase Pyruvate kinase enzim trình đờng phân Enzim xúc tác