Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết trình bày các kết quả nghiên cứu về khả năng trao đổi Nitơ vô cơ của một số chủng vi khuẩn quang hợp biểu phân lập được ở Việt Nam. Để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
25(3): 98-104 9-2003 Tạp chí Sinh học khả sử dụng nguồn nitơ vô vi khuẩn quang hợp phân lập đợc Việt nam Đỗ Thị Tố Uyên, Trần Văn Nhị, Nguyễn Ngọc Dũng Viện Công nghệ sinh học Diethelm Kleiner Trờng đại học Tổng hợp Bayreuth, CHLB Đức Giống nh nhiều loại vi khuẩn khác, vi khuẩn quang hợp (VKQH) thờng sử dụng amôn làm nguồn nitơ cho sinh trởng số loài có khả sử dụng nitrat làm nguồn N [1] Rất nhiều loài thuộc nhóm vi khuẩn tía không lu huỳnh có khả cố định nitơ phân tử [2] Các nguồn nitơ đợc hấp thụ vào tế bào nhiều đờng khác tùy thuộc hệ thống enzym loài điều chỉnh hoạt động enzym tùy thuộc vào cân NH4+ bên bên tế bào [3] Sự đồng hóa NH4+ xảy tế bào nhờ hệ thống enzym phụ thuộc lợng khử glutamin synthetaza/glutamat synthaza (GS/ GOGAT) nồng độ amôn môi trờng thấp, môi trờng d thừa amôn enzym glutamat dehydrogenaza (GluDH) đợc tổng hợp để thay hay bổ sung cho hệ thống [3] Trong năm gân đây, nớc ta VKQH đ đợc phân lập nghiên cứu chơng trình nghiên cứu đa dạng sinh học định hớng cho việc ứng dụng chúng [4, 5, 6] Trong báo này, trình bày kết nghiên cứu khả trao đổi nitơ vô số chủng VKQH tiêu biểu phân lập đợc i phơng pháp nghiên cứu Đối tợng nghiên cứu 10 chủngVKQH đợc phân lập từ thủy vực tích lũy nớc thải giàu hữu nitơ liên kết, chủng VKQH cã ngn gèc tõ n−íc biĨn lµ Rhodopseudomonas acidophila 24 Rhodobacter capsulatus SL1 nhận từ Trờng đại học Thanh Đảo (Sơn Đông, Trung Quốc) Chúng đợc nuôi môi trờng AT [7] lỏng hay thạch dới ánh sáng đèn sợi đốt nhiệt độ 28o-32oC khí nitơ Sự sinh trởng chủngVKQH đợc quan sát đĩa thạch hay đánh giá mật độ quang học dịch nuôi máy quang phổ bớc sóng 660 nm Hàm lợng amôn (NH4+) đợc xác định theo phơng pháp microbiuret [8] Hoạt động hệ thống vận chuyển amôn (NH4+-transport system) đợc đánh giá theo hấp thụ 14C-methylamin Hàm lợng 14C-methylamin đợc xác định phơng pháp đếm đồng vị phóng xạ theo nguyên lý nhấp nháy lỏng [9] Khả cố định nitơ phân tử đợc xác định qua khả khử axêtylen thành êtylen Lợng êtylen tạo đợc xác định phơng pháp sắc ký khÝ theo nguyªn lý ion hãa ngän lưa [10] Enzym đợc tách khỏi tế bào nhờ thiết bị ph¸ mÉu French Pressure (ViƯn Vi sinh vËt häc, Tr−êng đại học Tổng hợp Bayreuth, CHLB Đức) áp suất 16000psi ly tâm 13000 v/phút để loại xác tế bào Hoạt tính enzym glutamat synthaza GOGAT (EC.2.6.1.53) glutamat dehydrogenaza GluDH (EC1.4.1.3) đợc đánh giá theo tốc độ oxy hóa NADPH (hoặc NADH) thành NADP (hoặc NAD) Hàm lợng NADPH (hoặc NADH) đợc xác định theo mật độ quang học 340 nm [11] Công trình đợc hỗ trợ kinh phí Chơng trình nghiên cứu 98 Hoạt tính sinh tổng hợp glutamin synthetaza GS (EC 6.3.1.2) đợc đánh giá thông qua phản ứng tạo -glutamylhydroxamat Hàm lợng glutamylhydroxamat đợc xác định theo hấp thụ ánh sáng bớc sóng 500 nm phức hợp màu đỏ(đợc tạo thành kết hợp với ion Fe III) Phơng pháp xác định dựa theo phơng pháp Shaprio Stadtman [11] có cải biên Hàm lợng protein đợc xác định theo phơng pháp Lowry [12] ii Kết thảo luận Khả sử dụng số nguồn nitơ vô cho sinh trởng chủng VKQH Các chủng thí nghiệm đợc nuôi cấy điều kiện kỵ khí đĩa thạch dới khí nitơ bổ sung thêm amôn nitrat (2 mM theo N) công thức đối chứng, nguồn N khí nitơ phân tử Kết theo dõi sinh trởng sau ngày nuôi cấy đợc trình bày bảng Bảng Khả sinh trởng chủng VKQH số nguồn nitơ vô Chủng thí nghiệm T4 T17 7II 10I SH RV HP P§ §N 40 R acidophila 24 R.capsulatus SL1 Nguån nit¬ N2 + + + + + + + + + + + + NH4+ ++ ++ ++ + ++ + ++ ++ + + + + NO3+ + + + + + + + + + + + Kết thu đợc cho thấy chủng thí nghiệm sinh trởng đợc môi trờng chứa nitơ phân tử nguồn N Điều nói lên khí nitơ đóng vai trò làm nguồn nitơ dinh dỡng cho vi khuẩn sinh trởng nhờ trình cố định nitơ phân tử Khả nhiều loài vi khuẩn tía không lu huỳnh đ đợc đề cập tới nhiều công trình công bố trớc đây[1, 13] Kết cho thấy tất chủng sinh trởng đợc môi trờng có bổ sung thêm NO3- Theo khóa phân loại Bergey [1], có số chủng thuộc loài Rhodobacter capsulatus, R sphaeroides R Veldkampii có khả đồng hóa đợc nitrat Sự sinh trởng chủng VKQH mà quan sát đợc có mặt nitơ phân tử [2, 14, 15] Nh đ biết, amôn nguồn nitơ đợc sử dụng phổ biến nhiều vi khuẩn, nhiên kết bảng cho thấy khả đồng hóa amôn chủng vi khn thÝ nghiƯm kh«ng gièng Sù sinh tr−ëng chủng T4, T17, 7II, SH, HP, PĐ cao so với chủng lại Sự khác liên quan tới chế điều hòa chuyển hóa amôn chức vận chuyển amôn qua màng mang tính đặc thù chủng, loài [3] Nh vậy, từ kết nêu cho thấy chủng VKQH thí nghiệm có khả sử dụng nitơ phân tử cho sinh trởng khả đồng hóa amôn khác Sự có mặt nguồn nitơ liên kết ảnh hởng mạnh tới khả cố định nitơ Khả cố định nitơ phân tử môi trờng chứa nguồn N vô khác Để đánh giá hoạt tính cố định nitơ phân tử chủng nghiên cứu có mặt nguồn nitơ vô khác, nuôi cấy chúng môi trờng AT lỏng chứa amôn nitrat với nồng độ mM theo N công thức đối chứng, nguồn nitơ nitơ phân tử Sau 24 nuôi cấy, mẫu đợc ủ với C2H2 vòng 20h sau tiến hành xác định hàm lợng êtylen tạo thành Kết đợc trình bày bảng Kết thu đợc cho thấy khả cố định nitơ phân tử chủng khác Sau 24 nuôi cấy môi trờng có chứa amôn nitrat với nồng độ ban đầu mM (theo N) trình cố định nitơ phân tử xảy tất chủng Hoạt tính enzym nitrogenaza chủng khác sinh trởng môi trờng chứa nguồn N khác cao môi trờng chứa nitơ phân tử làm nguồn N Sự sinh trởng tất 99 chủng mạnh môi trờng chứa amôn Khi có mặt nitrat, tích lũy sinh khối chủng T4, 7II, PĐ 40 gia tăng hoạt tính cố định nitơ bị giảm hẳn so với môi trờng có nitơ phân tử Hiện tợng liên quan tới khả đồng hóa nitrat chủng Hoạt tính cố định nitơ nh tích lũy sinh khèi cđa chđng n−íc mỈn R acidophila 24 R.capsulatus SL1 không khác biệt nguồn N khác Bảng Hoạt tính cố định nitơ phân tử chủng vi khuẩn quang hợp môi trờng có chứa số nguồn nitơ liên kết ChØ sè M«i tr−êng N2 ∆OD660 Chđng M«i tr−êng KNO3 M«i tr−êng NH4Cl C2H4 (nmol/ C2H4(nmol/ C2H4 (nmol/ ∆OD660 ∆OD660 mgprotein/h) mgprotein/h) mgprotein/h) T4 0,419 26,87 0,470 1,100 0,630 4,900 T17 0,654 45,32 0,625 11,800 0,703 27,470 7II 0,732 18,45 0,768 13,770 0,850 10,750 10I 0,690 18,71 0,700 0,218 0,890 2,230 SH 0,759 2,07 0,679 1,910 0,818 0,718 RV 0,849 11,45 0,700 3,120 0,921 7,060 HP 0,633 41,24 0,570 9,730 0,876 23,250 P§ 0,523 14,65 0,600 0,280 0,570 3,860 §N 0,648 48,93 0,593 26,110 0,677 28,380 40 0,493 22,70 0,548 1,020 0,700 11,100 R acidophila 24 0,787 30,91 0,788 27,300 0,829 30,900 R.capsulatus SL1 0,854 20,44 0,735 20,000 0,833 21,300 Nh vậy, trình cố định nitơ xảy nuôi chủng thí nghiệm môi trờng chứa nitrat hay amôn nồng độ ban đầu mM theo N Theo nhiều tài liệu công bố trớc trình cố định nitơ phân tử nhạy cảm với nguồn nitơ liên kết khác đặc biệt amôn [16, 17, 18] Để xác định ảnh hởng nồng độ amôn đến hoạt tính cố định nitơ phân tử chủng VKQH nghiên cứu, đ đánh giá hoạt tính nitrogenaza sau 24h nuôi cấy chúng môi trờng chứa amôn với nồng độ ban đầu khác Kết xác định hàm lợng C2H4 tạo thành sau 20h ủ mẫu với axêtylen đợc trình bày bảng Từ bảng 3, ta thấy nồng độ amôn ban đầu mM, hoạt tính cố định nitơ hầu hết 100 chủng thí nghiệm bị giảm so với môi trờng chứa nitơ phân tử dạng khí nồng độ mM NH4+ hoạt tính nitrogenaza chủng T17, PĐ, 40 R.capsulatus SL1 bị ức chế hoàn toàn, xác định đợc hoạt tính cố định nitơ chủng lại với mức độ suy giảm khác so với môi trờng không chứa amôn Khi nồng độ amôn môi trờng ban đầu cao (10 mM), hoạt tính nitrogenaza tất chủng nghiên cứu không xác định đợc Kết khẳng định có mặt amôn môi trờng nuôi cấy đ làm giảm hoạt tính cố định nitơ phân tử chủng VKQH thí nghiệm khoảng nồng độ amôn ức chế hoàn toàn hoạt tính enzym khác chủng khác Bảng ảnh hởng hàm lợng amôn ban đầu đến hoạt tính cố định nitơ phân tử (nmolC2H4/mgPr/h) chủng thí nghiệm Hàm lợng amôn (NH4+) ban đầu (mM) Chủng 10 T4 49,38 40,77 7,50 T17 41,12 18,68 0,00 7II 158,72 39,00 23,16 10I 85,70 39,70 17,65 SH 79,70 47,85 16,03 RV 129,21 60,65 27,70 HP 149,36 81,40 45,95 P§ 80,21 12,26 0,00 §N 149,00 65,70 49,66 40 43,60 31,65 0,00 R acidophila 24 127,10 113,20 13,81 R.capsulatus SL1 22,18 17,12 0,00 Để xác định biến động trình tích lũy sinh khối, cố định nitơ phân tử đồng hóa amôn theo thời gian, chủng điển hình T17 đ đợc nuôi cấy môi trờng chứa hàm lợng NH4+ (mM) NH4+ ban đầu mM Kết theo dõi biến động hàm lợng amôn hàm lợng C2H4 tạo thành theo thời gian chủng đợc trình bày hình C2H4 (nmol/mgPr/h) ∆OD 90 4.5 80 70 3.5 60 50 2.5 40 30 NH4Cl 1.5 OD 20 C2H4 10 0.5 0 12 24 36 48 60 72 Hình Biến động trình tích lũy sinh khối (OD), nồng độ NH4+ ho¹t tÝnh nitrogenaza cđa chđng T17 theo thêi gian 101 Từ hình 1, ta thấy hoạt tính cố định nitơ gia tăng theo thời gian nuôi cấy hàm lợng amôn lại giảm dần đ đợc sử dụng làm nguồn N cho sinh trởng Sự biến động đ đợc nhà nghiên cứu trớc đề cập tới nghiên cứu ảnh hởng amôn đến chế điều chỉnh tổng hợp nitrogenaza [15, 19] Trong điều kiện thí nghiệm đ tiến hành hoạt tính nitrogenaza chủng T17 bắt đầu đợc gia tăng nồng độ amôn môi trờng nuôi giảm xuống đến 2,3 mM (sau 12 nuôi cấy) tăng mạnh < 0,3 mM (sau 24 giê nu«i cÊy) Gièng nh nhiều vi khuẩn khác, amôn nguồn N a thích VKQH ảnh hởng mạnh tới khả cố định nitơ phân tử chủng VKQH phân lập đợc Việt Nam Mức độ ảnh hởng tùy thuộc vào chủng, loài Để tiếp tục tìm hiểu khả sử dụng NH4+ chủng VKQH nghiên cứu, đ xác định hoạt tính số enzym tham gia vào trình đồng hóa dạng nitơ Hoạt động enzym đờng đồng hóa amôn VKQH Amôn đợc vận chuyển vào tế bào vi khuẩn theo hai hình thức vận chuyển: thụ động theo gradient nồng độ (khi hàm lợng NH4+ môi trờng cao) vận chuyển tích cực nhờ hệ thống vận chuyển NH4+ đặc hiệu (NH4+ transport system) nồng độ môi trờng bị giảm thiểu [20] Khi có mặt NH4+ tế bào, enzym tham gia vào trình đồng hóa amôn (GS, GOGAT, GluDH) đợc tổng hợp Sự điều chỉnh tổng hợp nh hoạt tính enzym lại phụ thuộc vào mức độ amôn tế bào [3] Chúng đ tiến hành nuôi cấy chủng môi trờng AT lỏng chứa hàm lợng amôn giới hạn mM Khi sinh trởng đạt tới đầu pha dừng (4 ngày), tế bào đợc tách khỏi môi trờng ly tâm 13.000 v/phút để tiến hành xác định hoạt tính enzym Kết đợc trình bày bảng Bảng Hoạt tính enzym đờng đồng hóa amôn VKQH Chủng Hấp thụ 14CH3NH3 (pmol/mgpr/min) GOGAT (mU/mgpr/min) GluDH mU/mgpr/min) NADPH NADH NADPH NADH GS mU/mgpr/min) Mg++ Mn++ T4 203 23 24 134 3,7 3,2 T17 50 10 41 40 7II 45 23 17 43 56 10I 68,2 12 16 12 52 72 SH 112,5 10 33 30 19 16,7 RV 29,4 9 29 37 14,3 HP 29 20 30 P§ 89,2 0 0 10 §N 127,8 13 11 22 88 45 75 40 42,9 0 23 196 24 R acidophila 24 53,8 0 0 113 118 R capsulatus SL1 0 22 10 23 36 KÕt qu¶ ë b¶ng cho thấy, trừ chủng HP R acidophila 24, hoạt tính hấp thụ 14C methylamin xác định đợc đa số chủng thí 102 nghiệm, chứng hoạt động hệ thống vận chuyển NH4+ đặc hiệu Hoạt động hệ thống VKQH thuộc họ Rhodospirilaceae đ đợc Kleiner cs đề cập tới trớc [8] Kết thu đợc cho thấy phần lớn chủng VKQH nghiên cứu có chứa đầy đủ enzym đờng đồng hóa amôn, trừ chủng PĐ R acidophila 24 không quan sát đợc hoạt tính GOGAT nh GluDH Tuy nhiên, hoạt tính enzym phụ thuộc nhiều vào nguồn lợng khử đợc sử dụng Hoạt tính GOGAT phụ thuộc NADH không xác định đợc chủng T17 HP chúng lại có biểu hoạt tính enzym có mặt chất khử NADPH Đặc tính đợc sử dụng phân loại VKQH theo số tài liệu công bố trớc GOGAT phụ thuộc NADH đợc tìm thấy Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter capsulatus GOGAT phụ thuộc NADPH đợc tìm thấy Rhodopseudomonas acidophila, R palustris [21, 22, 23, 24] Ho¹t tính tổng hợp glutamin synthetaza GS đợc tìm thấy tất chủng thí nghiệm Tuy nhiên, hoạt tính biểu dạng: phụ thuộc Mg++ (GSMg) phụ thuộc Mn++ (GSMn) khác ë c¸c chđng Tû lƯ GSMg /GSMn > ë c¸c chđng T4, SH, RV, T17 ë c¸c chủng lại tỷ lệ lại nhỏ Theo Shaprio cs [10], Mg++ Mn++ cofactơ enzym GS trạng thái deadenylyl hóa adenylyl hóa tơng ứng Theo Cardenas cs., GS đợc deadenylyl hóa trạng thái hoạt hóa ngợc lại dạng anylyl hóa GS trạng thái bất hoạt [25] Nhìn chung, điều kiện mà tiến hành thí nghiệm, chủng VKQH nghiên cứu tồn đầy đủ enzym đờng đồng hóa amôn đặc trng tế bào vi sinh vật Điều cho thấy dù sinh trởng điều kiện chúng thỏa m n nhu cầu dinh dỡng nitơ theo nhiều cách khác III Kết luận Các chủng VKQH nghiên cứu có khả sử dụng nitơ phân tử làm nguồn N cho sinh trởng Quá trình sinh trởng chúng không gia tăng đáng kể bổ sung NO3- nhng phát triển mạnh môi trờng có bổ sung NH4+ Hoạt tính cố định nitơ phân tử chủng VKQH nghiên cứu cao sau 24h sinh trởng với nitơ phân tử làm nguồn N dinh dỡng Hoạt tính bị giảm môi trờng nuôi chứa NH4+ biến động tỷ lệ nghịch với nồng độ NH4+ ban đầu Còn xác định đợc hoạt tính cố định nitơ hầu hết chủng nghiên cứu nồng độ amôn ban đầu mM Tất chủng không biểu hoạt tính nitrogenaza môi tr−êng chøa 10 mM NH4+ ë chđng T17, víi nồng độ amôn ban đầu mM, đ phát đợc hoạt tính nitrogenaza NH4+ môi trờng giảm đến khoảng 2,3 mM tăng mạnh amôn nhỏ 0,3 mM Các chủng VKQH nghiên cứu biểu khác hoạt tính hệ thống vận chuyển NH4+ đặc hiệu Đ xác định đợc hoạt tính enzym đồng hóa NH4+: GS, GluDH GOGAT hầu hết chủng Tài liệu tham khảo Bergey’s Mannual Systematic Bacteriology, 1989: Vol 3: 1635-1709 Imhoff J F., 1982: Response of phototrophic bacteria to mineral nutrient In the “ CRR handbook of biosolar resources, Vol Basic pricinples part A Mitsui and C.C Black Eds CRC Press Rehab M Shahawy and Diethelm Kleiner, 2001: Nitrogen limitation In the: Algal adaptation to environmental stress Eds L C Raind J P Graur Springer Đỗ Thị Tố Uyên, Trần Văn Nhị, 1999: Nghiên cứu vi khuẩn quang hợp để sử dụng xử lý nớc thải giàu hữu II Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc: 290-298, Hà Nội Đỗ Thị Tố Uyên, Trần Văn Nhị, 2000: Tạp chí Sinh học, 22(3): 36-40 Trần Văn Nhị cs., 2000: Vi khn quang hỵp ë ViƯt Nam - nguồn tài nguyên phong phú có triển vong ứng dụng Báo cáo khoa học Hội nghị Sinh học quốc gia "Những vấn đề nghiên cứu sinh học: 564-567, NXB Đại học quốc gia Hµ Néi 103 Imhoff J F., 1988: Anoxygenic phototrophic bacteria In the: Methods in aquatic bacteriology B Austin Ed Willy and Sons Chichester United Kingdom Kassem Alef and Diethelm Kleiner, 1982: Arch Microbiol., 132: 79-81 Cosiak A.V., Gogotov I N., 1978: Microbiologia, 47(4): 605-610 10 Methods in Enzymology, 1972: 24:415431 11 Shapiro B and Stadtman R., 1970: Methods in Enzymology, Vol 17A, Eds H Tabor Academic press NewYork-London 12 Lowry O H et al., 1951: J Biol Chem., 193: 256-275 13 Michael J Madigan, 1995: Microbiology of nitrogen fixation by anoxygenic phototrophicbacteria Robert E Blankenship Eds Kluwer Academic publishers 14 Dunstan R H., Kelley B C., and Nicholas D J D., 1982: J Bacteriol., 150: 100-104 15 Monique sabaty, Pierre Gans Andre Vermeligo, 1993: Arch Micobiol., 159: 53159 16 Sweet W J., Burris R H., 1981: J Bacteriol., 145(2): 824-831 17 Anatoly Tsygankov et al., 1996: J Mar Biotechnol., 4: 43-46 18 Pierard J P., Ludden P W., and Robert G P., 1993: J Bacteriol., 175: 1358-1366 19 Yakunin A F and Hallenbeck., 1998: J Bacteriol., 180: 6392-6395 20 Diethelm Kleiner, 2000: Recent Res Devel Microbiology, 2000 (4): 467-479 21 Nagatami H., Shimizu M and Valentine R C., 1977: Arch Microbiol., 79: 164-175 22 Brown C M and Herbert R A., 1977: FEBS Letters, 1: 43-46 23 Weare N M and Shanmugam K T., 1976: Arch Microbiol., 110: 207-213 24 Cardenas J et al., 1987: In inorganic nitrogen metabolism Ulrich W et al Eds Springer Verlag, Berlin and Heidelberg, 148-153 25 Francisco Romeo, Antonio Quintero and Rose Manuel Roldan, 1989: FEMS Microbiology Letters, 58: 111-114 Utilization of several nitrogen sources by photosynthetic bacteria isolated in Vietnam Do Thi To Uyen, Tran Van Nhi, Nguyen Ngoc Dung, Diethelm Kleiner Summary Twelve strains of photosynthetic bacteria were cultivated on solid agar medium in absence or presence of NH4+ or NO3- under nitrogen air condition Their nitrogenase activity after 24h of cultivation in liquid medium containing these components was determinated The activity of the GOGAT, GS and GluDH enzymes and the NH4+-transport system in cell-free extracts of all strains were found The nitrogenase activity, biomass accumulation and NH4+ concentration were followed during the growth of the strain T17 The obtained experimental results showed that all studied photosynthetic bacteria strains were capable to fix N2 Ammonium and nitrate could be used for the bacterial growth and inhibited nitrogenase at certain concentration Ngµy nhËn bµi: 6-6-2002 104 ... thí nghiệm có khả sử dụng nitơ phân tử cho sinh trởng khả đồng hóa amôn khác Sự có mặt nguồn nitơ liên kết ảnh hởng mạnh tới khả cố định nitơ Khả cố định nitơ phân tử môi trờng chứa nguồn N vô khác... nhiỊu vi khuẩn khác, amôn nguồn N a thích VKQH ảnh hởng mạnh tới khả cố định nitơ phân tử chủng VKQH phân lập đợc Vi t Nam Mức độ ảnh hởng tùy thuộc vào chủng, loài Để tiếp tục tìm hiểu khả sử dụng. .. sinh trởng đợc môi trờng chứa nitơ phân tử nguồn N Điều nói lên khí nitơ đóng vai trò làm nguồn nitơ dinh dỡng cho vi khuẩn sinh trởng nhờ trình cố định nitơ phân tử Khả nhiều loài vi khuẩn tía