Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết công bố kết quả đánh giá khả năng chịu hạn, phân lập gien mã hóa Cystatin của 2 giống cây đậu xanh nhằm đánh giá sự đa dạng của gien mã hóa Cystatin của các giống đậu xanh phục vụ cho việc nghiên cứu chọn các giống cây đậu xanh có khả năng chịu hạn.
30(3): 121-128 9-2008 Tạp chí Sinh học SO SáNH TRìNH Tự GIEN CYSTATIN CÂY ĐậU XANH (Vigna radiata (L.) Wilczek) CHU HOàNG MậU, NGUYễN Vũ THANH THANH Đại học Thái Nguyên NGUYễN THị THU TRANG Sở Giáo dục Đào tạo Thái Nguyên Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) trồng ăn hạt đợc trồng nhiều nớc giới Đậu xanh chịu hạn [6] Stress môi trờng nh nóng, lạnh, hạn, sâu bệnh ảnh hởng trực tiếp đến suất đậu xanh Cystatin lµ protein øc chÕ cystein proteaza thuéc hä papain Cystatin thực vật (phytocystatins) có nhiều loài mầm hai mầm có hoạt tính gièng nh− chÊt øc chÕ cystein proteaza ë ®éng vËt Các chất ức chế cystein proteaza thực vật thờng đợc m· ho¸ bëi nhiỊu gien, nh−ng sù hiĨu biÕt vỊ gien Sự biểu gien cystatin thờng điều kiện hạn, lạnh, mặn pha riêng rẽ trình sinh trởng, phát triĨn cđa thùc vËt [4, 8, 13] Pernas M vµ cs (2000) cho rễ dẻ (Castanea sativa) gặp lạnh, sốc muối, stress nóng mức độ phiên mã tăng mạnh tế bào rễ tế bào cystatin dẻ không liên quan đến phản ứng tự vệ với mầm bệnh sâu hại mà liên quan đến khả chống lại tác động bất lợi nhân tố vô sinh [10] Nghiên cứu phân lập gien cystatin đợc thực trồng khác nh: đậu đũa (Vigna unguiculata L.), đậu tơng (Glycine max L.), cà rốt (Daucus carota L.), táo (Malus domestica) [3, 7, 9], [11] nhng đậu xanh việc nghiên cứu cystatin gien mã hoá protein vấn đề mẻ Trong báo này, công bố kết đánh giá khả chịu hạn, phân lập gien mã hoá cystatin giống đậu xanh (trong đó, giống chịu hạn tốt - DX208 giống chịu hạn - PaEC3) nhằm đánh giá đa dạng gien mã hoá cystatin giống đậu xanh phục vụ cho việc nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh có khả chịu hạn I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Vật liệu giống đậu xanh Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lơng thực Cây thực phẩm - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp Bảng Một số đặc điểm hình thái giống đậu xanh nghiên cứu STT Tªn gièng DX208 Đỗ Quế DX14 DX04 V123 T135 PAEC3 Màu thân mầm Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Tím Màu vỏ h¹t Xanh bãng Xanh mèc Xanh mèc Xanh bãng Xanh bóng Xanh mốc Vàng bóng Khối lợng 1000 hạt 75,30 … 0,015 44,20 … 0,025 65,86 … 0,040 66,31 … 0,015 63,95 … 0,020 50,54 … 0,032 60,75 … 0,010 121 Cặp mồi cystatin đợc thiết kế dựa phân tích trình tự gien cystatin giống đậu xanh đợc công bố Ngân hàng gien quốc tế với mã số AF454396 đặt hãng Fermentas: Bảng Trình từ cặp mồi nhân gien cystatin Mồi Trình tự mồi (5-3) Cys1 Gtcgcaggaactagaaagcgttg Cys2 Ctatgcaggtgcctctccaac gien đợc xử lý phần mềm DNAstar BioEdit Địa điểm thí nghiệm Thí nghiệm đợc tiến hành Phòng thí nghiệm Di truyền học - Đại học S phạm ĐHTN Phòng Công nghệ tế bào thực vật Viện Công nghệ sinh học Xác định trình tự gien Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam II KếT QUả Và THảO LUậN Các loại hóa chất, dụng cụ thiết bị phục vụ cho thí nghiệm sinh học phân tử Khả chịu hạn giống đậu xanh nghiên cứu Phơng pháp Để đánh giá khả chịu hạn giống đậu xanh khác góp phần định hớng cho việc chọn giống đậu xanh chịu hạn có hiệu quả, tiến hành nghiên cứu, đánh giá nhanh khả chịu hạn giống đậu xanh giai đoạn non (xuất thật) theo tiêu: tỉ lệ không héo, tØ lƯ c©y phơc håi sau 3, 5, 7, 9, 11 ngày thí nghiệm, từ xác định số chịu hạn tơng đối giống đậu xanh, kết nhận đợc bảng Chỉ số chịu hạn tơng đối đợc tính theo công thức: Đánh giá nhanh khả chịu hạn theo phơng pháp Lê Trần Bình cs (1998) [2] ADN tổng số đợc tách chiết theo phơng pháp Gawel Jarnet (1991) có cải tiÕn [5] Nh©n gien cystatin b»ng kü thuËt PCR PCR đợc tiến hành với tổng thể tích phản ứng 50 µl gåm: ADN mÉu (50 ng/µl) µl, måi (10 pM) µl, dNTP (2,5 mM) µl, MgCl2 (25 mM) µl, Taq polymerase (5 unit/µl) 0,8 µl, buffer PCR (10X) µl, H2O khư ion 27,2 µl Chu trình nhiệt bao gồm bớc sau: 94oC-3 phút; 94oC-50 giây, 56oC-1 phút, 72oC-1 phút 30 giây lặp lại 30 chu kì; 72oC - 10 phút lu giữ 4oC Sản phẩm PCR nhân gien cystatin đợc kiểm tra điện di gel agaroza 1% Gien đợc làm (thôi gel) theo Kit QIAquick Gel Extraction gắn vào véctơ pTZ57R/T, sau đợc biến nạp vào tế bào khả biến E coli chủng DH5 Trình tự nucleotit gien cystatin đợc xác định máy đọc trình tự nucleotit tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer hãng Ampplied Biosystem Kết xác định trình tù Sn = 1/2 sinα (an bn + bn cn + cn dn + dn en + en gn + gn hn + hn in + in kn+kn ln+ln mn) Trong đó: Sn: số chịu hạn tơng đối; n: ký hiệu giống nghiên cứu Các tiêu theo dõi gồm: a % không héo sau ngày hạn; b % phục hồi sau ngày hạn; c % không héo sau ngày hạn; d % phục hồi sau ngày hạn; g % không héo sau ngày hạn; h % phục hồi sau ngày hạn; i % không héo sau ngày hạn; k % phục hồi sau ngày hạn; l % không héo sau 11 ngày hạn; m % phục hồi sau 11 ngày hạn Bảng Đánh giá khả chịu hạn giống đậu xanh nghiên cứu Giống DX208 Đỗ Quế DX14 DX04 V123 T135 Chỉ số chịu hạn tơng ®èi 11640 4740 5750 11220 6340 8810 B¶ng cho thấy, giống DX208 giống chịu hạn tốt có số chịu hạn 11640, giống PaEC3 chịu hạn với số chịu hạn 4610 Chỉ số chịu hạn giảm dần 122 PaEC3 4610 gièng nh− sau: DX208 > DX04 > T135 > V123 > DX14 > Đỗ Quế > PaEC3 Từ kết đánh giá khả chịu hạn trên, lựa chọn giống DX208 (có số chịu hạn lớn nhất) PaEC3 (có số chịu hạn nhỏ nhất) để tiếp tục nghiên cứu phân lập gien cystatin Kết nhân gien cystatin hai giống đậu xanh DX208 PaEC3 kỹ thuật PCR véctơ tạo dòng nên kiểm tra sản phẩm PCR vừa dòng hoá kích thớc đoạn gien vừa nhân lên cao khoảng 200 nucleotit so với nhân cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm colony PCR đợc điện di kiểm tra gel agaroza 1% (hình 3) Đoạn gien cystatin giống đậu xanh (DX208 PaEC3) đợc nhân lên phơng pháp PCR, kết nhân gien đợc kiểm tra phơng pháp điện di gel agaroza 1% đợc thể hình Hình cho thấy, mẫu nhận đợc đoạn ADN đặc hiệu có kích thớc khoảng 1100 bp M 1500 bp → 1000 bp → H×nh Hình ảnh khuẩn lạc 1100 bp Hình Kết PCR nhân gien cystatin giống đậu xanh Ghi chú: M Chỉ thị phân tử 1kb; DX208; PaEC3 Kết tách dòng gien cystatin Để xác định đợc trình tự gien cystatin, tiến hành tách dòng gien cystatin Quá trình tách dòng đợc thực cách gắn sản phẩm PCR tinh vào véctơ tách dòng pTZ57R/T, biến nạp vào tế bào khả biến chủng E coli DH5 cấy trải đĩa Petri có môi trờng LB đặc bổ sung ampicillin 100 mg/ml, X-gal 40 mg/ml vµ IPTG 100 µM ủ đĩa petri cấy trải 37oC 16 giờ, kết thu đợc khuẩn lạc xanh trắng (hình 2) Chọn khuẩn lạc trắng nuôi m«i tr−êng LB láng cã bỉ sung ampicillin 100 mg/ml qua đêm Lấy khuẩn mẫu chạy phản ứng clony PCR với cặp mồi pUC18 để xác định khuẩn lạc có plasmit mang gien mong muốn Vì cặp mồi pUC18 cặp mồi đợc thiết kế chung cho M 1 2 1500 bp→ 1000 bp→ H×nh Kết điện di sản phẩm colony-PCR gel agaroza Ghi chú: M Chỉ thị phân tử 1kb; DX208; PaEC3 Từ kết điện di hình cho thấy, sản phẩm colony PCR từ khuẩn lạc trắng cho kết dơng tính Tất mẫu cho băng kích thớc, chứng tỏ kết biến nạp chọn dòng thực tốt, phản ứng PCR đạt mức tối u Tiến hành chọn khuẩn lạc trắng tơng ứng với mẫu nghiên cứu có sản phẩm colony PCR tách 123 plasmit theo kit QIAprep Spin Miniprep Sản phẩm ADN plasmit đợc điện di gel agaroza 1%, kết đợc thể hình Kết điện di hình cho thấy, sản phẩm tách plasmit sạch, đảm bảo chất lợng số lợng để tiến hành xác trình tự nucleotit gien cystatin Kết xác định trình tự nucleotit Hình Kết điện di tách plasmit Ghi chú: Plasmit mang gien cystatin cña gièng DX208; Plasmit mang gien cystatin cña gièng PaEC3 PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 124 Để xác định trình tự nucleotit gien cystatin tách dòng, tiến hành xác định trình tự nucleotit gien cystatin máy đọc tự động ABI PRISM@ 3100 Avant Genetic Analyzer Kết đọc trình tự đợc đem phân tích, xử lý phần mềm BioEdit Kết thu đợc thể hình | | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 ATGTCGCAGG AACTAGAAAG CGTTGAGATC GATAGTTTAG CTCGATTTGC ATGTCGCAGG AACTAGAAAG CGTTGAGATC GATAGTTTAG CTCGATTTGC | | | | | | | | | | 60 70 80 90 100 TGTTGAAGAA CACAACAAAA AACAGGTTTT TCTTTTTCCT TTCACACACC TGTTGAAGAA CACAACAAAA AACAGGTTTT TCTTTTTCCT TTCACACACC | | | | | | | | | | 110 120 130 140 150 CTTTATTTTT TTTTCCCTTC AAAAAGATTA AAGAAATTTG TACCACTCAT CTTTATTTTT TTTTCCCTTC AAAAAGATTA AAGAAATTTG TACCACTCAT | | | | | | | | | | 160 170 180 190 200 TATGTTTTGC TCTGTATCTT ATGCTTCTCG AGAAATTCCC AAGCTTTCTG TATGTTTTGC TCTGTATCTT ATGCTTCTCG AGAAATTCCC AAGCTTTCTG | | | | | | | | | | 210 220 230 240 250 TTGGTTTCCT ATTGGGTCTG ATCGTTGATC GGTTTCGGCC ACGCCAAGAT TTGGTTTCCT ATTGGGTCTG ATCGTTGATC GGTTTCGGCC ACGCCAAGAT | | | | | | | | | | 260 270 280 290 300 TTCTTCAGAG ATTCACATGT TTGATTATAT TATCTCCTTT GTTTGATTAA TTCTTCAGAG ATTCACATGT TTGATTATAT TATCTCTTTT GTTTGATTAA | | | | | | | | | | 310 320 330 340 350 CAATAATTGT TAACTTTTAG ATTTTTCTTC TGGGGATAAT GGGGTTCTTC CAATAATTGT TAACTTTTAG ATTTTTCTTC TGGGGATAAT GGGGTTCTTC | | | | | | | | | | 360 370 380 390 400 TGTTGTTGGA TTGATTTTGT TCTGAGGTAG AGTTTTCTAA GAAGAGAATG TGTTGTTGGA TTGATTTTGT TCTGAGGTAG AGTTTTCTAA GAAGAGAATG | | | | | | | | | | 410 420 430 440 450 TTAAAGATAA TTTTGTGAAT ATACTGTGTT ATTAGCTTAA ATTTATTGTA TTAAAGATAA TTTTGTGAAT ATACTGTGTT ATTAGCTTAA ATTTATTGTA | | | | | | | | | | 460 470 480 490 500 AATTGCTAAA TTTTCTAAGT TTTGTTTCTT ATATATAGTA TCAGACATGA AATTGCTAAA TTTTCTAAGT TTTGTTTCTT ATATATAGTA TCAGACATGA | | | | | | | | | | 510 520 530 540 550 TTTTAATAAC TTCCAAAATA GTTCAATCAT TAATGGAGAG TAACTTAGAA TTTTAATAAC TTCCAAAATA GTTCAATCAT TAATGGAGAG TAACTTAGAA | | | | | | | | | | 560 570 580 590 600 GGAAAATATT TCAGAGTGTG TAGGCAGATC TATTTGGAAA AATAAGCCAA GGAAAATATT CCAGAGTGTG TAGGCAGATC TATTTGGAAA AATAAGCCAA PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 PaEC3 DX208 | | | | | | | | | | 610 620 630 640 650 TATTTGCCTA ACAAAGTATC TTCTACCGAA CATGCACTTT GCCTCAGTGT TATTTGCCTA ACAAAGTATC TTCTACCGAA CATGCACTTT GCCTCAGTGT | | | | | | | | | | 660 670 680 690 700 GGTATGGTGC AAAGCGGGTG AGAGAGAGCA AAAAGTTATG ATGCAAATAT GGTATGGTGC AAAGCGGGTG AGAGAGAGCA AAAAGTTATG ATGCAAATAT | | | | | | | | | | 710 720 730 740 750 TTGTCGTTTG AAGCTTGTGG AAGCCCATAA TCCATTATCA GAAGCCAGAA TTGTCATTTG AAGCTTGTGG AAGCCCATAA TCCATTATCA GAAGCCAGAA | | | | | | | | | | 760 770 780 790 800 TTGATTATTG ATTGTTAGGA TAAATTCTGC ATTTATCGTA TGTCAATGAA TTGATTATTG ATTGTTAGGA TAAATTCTGC ATTTATCGTA TGTCAATGAA | | | | | | | | | | 810 820 830 840 850 TAAATGGTTT TGTGGCGTGA ATTTTAACAA CAAAGTTTGT CGTTTTTTTC TAAATGGTTT TGTGGCGTGA ATTTTAACAA CAAAGTTTGT CGTTTTTTTC | | | | | | | | | | 860 870 880 890 900 TTTGTAGTAA TAGAAATGCA AACTGGTGTC TATTTTTATT TTGTTTTTAT TTTGTAGTAA TAGAAATGCA AACTGGTGTC TATTTTTATT TTGTTTTTAT | | | | | | | | | | 910 920 930 940 950 TGATTGGTGA TGGCTATATA CAGAACGCCC TTCTGGAGTT TGGAAGGGTG TGATTGGTGA TGGCTATATA CAGAACGCCC TTCTGGAGTT TGGAAGGGTG | | | | | | | | | | 960 970 980 990 1000 GTAAGTGCAC AACAGCAAGT GGTTTCTGGT ACCTTGTACA CCATCACTTT GTAAGTGCAC AACAGCAAGT GGTTTCTGGT ACCTTGTACA CCATCACTTT | | | | | | | | | | 1010 1020 1030 1040 1050 GGAGGCAAAA GATGGTGGGC AAAAGAAGGT TTATGAAGCC AAAGTCTGGG GGAGGCAAAA GATGGTGGGC AAAAGAAGGT TTATGAAGCC AAAGTCTGGG | | | | | | | | | | 1060 1070 1080 1090 1100 AGAAGCCATG GTTGAACTTC AAGGAGCTGC AAGAGTTCAA ACTTGTTGGA AGAAGCCATG GTTGAACTTC AAGGAGCTGC AAGAGTTCAA ACTTGTTGGA | | | 1110 GAGGCACCTG CATAG GAGGCACCTG CATAG H×nh Tr×nh tù nucleotit cđa gien cystatin ë giống đậu xanh nghiên cứu Kết cho thấy, chiều dài gien cystatin mẫu nghiên cứu có kích thớc 1115 nucleotit Khi so sánh trình tự BLAST NCBI, kết cho biết trình tự gien mã hoá cystatin đậu xanh Chúng kết luận nhân, tách dòng đọc trình tự thành công đoạn gien mã hoá cystatin giống đậu xanh nghiên cứu Hai giống nghiên cứu khác trình tự nucleotit vị trí là: 287; 561; 706 Do vậy, trình tự gien cystatin giống đậu xanh nghiên cứu có độ tơng đồng cao (99,7%) Dựa số liệu vỊ tr×nh tù nucleotit cđa gien cystatin ë gièng đậu xanh nghiên cứu, Hình Biểu đồ hình so sánh mức tơng đồng gien cystatin giống đậu xanh tiến hành so sánh trình tự nucleotit giống đậu xanh với giống ®Ëu xanh 125 KP11, KPS1, 263, MN93 [12] Sau ®ã, lập biểu đồ hình để tìm hiểu mối quan hệ gien cystatin giống đậu xanh nghiên cứu với giống đậu xanh phân lập trớc Kết hình cho thấy, sáu giống đậu xanh đợc chia thành nhóm: nhóm gồm gièng DX08, KP11, KPS1 vµ 263; nhãm gåm hai gièng MN93 vµ PaEC3 Gièng DX208 ë nhãm chịu hạn tốt, giống PaEC3 nhóm chịu hạn So sánh trình tự nucleotit giống đậu xanh cho thấy, tỷ lệ % tơng đồng trình tù nucleotit rÊt cao (dao ®éng tõ 99,6% ®Õn 100%), có hai giống DX208 KP11 tơng đồng 100%, giống PaEC3 tơng đồng 100% với MN93 (bảng 4) Bảng So sánh trình tự nucleotit gien cystatin giống đậu xanh Hệ số khác 1 0,3 0,3 0,3 0,4 0,0 99,7 0,2 0,2 0,3 0,3 HÖ sè gièng 99,7 99,7 99,6 99,8 99,8 99,7 100,0 99,7 0,0 99,7 0,3 0,3 0,3 0,3 0,4 5 So sánh trình tự nucleotit đoạn mã hoá Đoạn mã hóa gien cystatin giống đậu xanh nghiên cứu gồm exon: exon từ vị trí số đến vị trí 74 gien, exon từ vị trí 923 đến 1115 Phân tích trình tự nucleotit đoạn mã hoá axit amin cđa mÉu nghiªn cøu DX208 PaEC3 AF454396 KP11 MN93 263 KPS1 DX208 PaEC3 AF454396 KP11 MN93 263 KPS1 DX208 PaEC3 AF454396 KP11 MN93 263 KPS1 126 100,0 99,7 99,7 99,7 99,6 PaEC3.seq 263.seq DX208.seq KP11.seq KPS1.seq MN93.seq víi mÉu Ngân hàng gien có mã số AF454396 mẫu đậu xanh KP11, KPS1, 263, MN93 cho thấy đoạn mã hoá dài 267 nucleotit Trình tự nucleotit đoạn mã hoá axit amin gien cystatin mẫu có độ tơng đồng cao (100%) | | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 ATGTCGCAGG AACTAGAAAG CGTTGAGATC GATAGTTTAG CTCGATTTGC ATGTCGCAGG AACTAGAAAG CGTTGAGATC GATAGTTTAG CTCGATTTGC ATGTCGCAGG AACTAGAAAG CGTTGAGATC GATAGTTTAG CTCGATTTGC ATGTCGCAGG AACTAGAAAG CGTTGAGATC GATAGTTTAG CTCGATTTGC ATGTCGCAGG AACTAGAAAG CGTTGAGATC GATAGTTTAG CTCGATTTGC ATGTCGCAGG AACTAGAAAG CGTTGAGATC GATAGTTTAG CTCGATTTGC ATGTCGCAGG AACTAGAAAG CGTTGAGATC GATAGTTTAG CTCGATTTGC | | | | | | | | | | 60 70 80 90 100 TGTTGAAGAA CACAACAAAA AACAGAACGC CCTTCTGGAG TTTGGAAGGG TGTTGAAGAA CACAACAAAA AACAGAACGC CCTTCTGGAG TTTGGAAGGG TGTTGAAGAA CACAACAAAA AACAGAACGC CCTTCTGGAG TTTGGAAGGG TGTTGAAGAA CACAACAAAA AACAGAACGC CCTTCTGGAG TTTGGAAGGG TGTTGAAGAA CACAACAAAA AACAGAACGC CCTTCTGGAG TTTGGAAGGG TGTTGAAGAA CACAACAAAA AACAGAACGC CCTTCTGGAG TTTGGAAGGG TGTTGAAGAA CACAACAAAA AACAGAACGC CCTTCTGGAG TTTGGAAGGG | | | | | | | | | | 110 120 130 140 150 TGGTAAGTGC ACAACAGCAA GTGGTTTCTG GTACCTTGTA CACCATCACT TGGTAAGTGC ACAACAGCAA GTGGTTTCTG GTACCTTGTA CACCATCACT TGGTAAGTGC ACAACAGCAA GTGGTTTCTG GTACCTTGTA CACCATCACT TGGTAAGTGC ACAACAGCAA GTGGTTTCTG GTACCTTGTA CACCATCACT TGGTAAGTGC ACAACAGCAA GTGGTTTCTG GTACCTTGTA CACCATCACT TGGTAAGTGC ACAACAGCAA GTGGTTTCTG GTACCTTGTA CACCATCACT TGGTAAGTGC ACAACAGCAA GTGGTTTCTG GTACCTTGTA CACCATCACT DX208 PaEC3 AF454396 KP11 MN93 263 KPS1 DX208 PaEC3 AF454396 KP11 MN93 263 KPS1 DX208 PaEC3 AF454396 KP11 MN93 263 KPS1 | | | | | | | | | | 160 170 180 190 200 TTGGAGGCAA AAGATGGTGG GCAAAAGAAG GTTTATGAAG CCAAAGTCTG TTGGAGGCAA AAGATGGTGG GCAAAAGAAG GTTTATGAAG CCAAAGTCTG TTGGAGGCAA AAGATGGTGG GCAAAAGAAG GTTTATGAAG CCAAAGTCTG TTGGAGGCAA AAGATGGTGG GCAAAAGAAG GTTTATGAAG CCAAAGTCTG TTGGAGGCAA AAGATGGTGG GCAAAAGAAG GTTTATGAAG CCAAAGTCTG TTGGAGGCAA AAGATGGTGG GCAAAAGAAG GTTTATGAAG CCAAAGTCTG TTGGAGGCAA AAGATGGTGG GCAAAAGAAG GTTTATGAAG CCAAAGTCTG | | | | | | | | | | 210 220 230 240 250 GGAGAAGCCA TGGTTGAACT TCAAGGAGCT GCAAGAGTTC AAACTTGTTG GGAGAAGCCA TGGTTGAACT TCAAGGAGCT GCAAGAGTTC AAACTTGTTG GGAGAAGCCA TGGTTGAACT TCAAGGAGCT GCAAGAGTTC AAACTTGTTG GGAGAAGCCA TGGTTGAACT TCAAGGAGCT GCAAGAGTTC AAACTTGTTG GGAGAAGCCA TGGTTGAACT TCAAGGAGCT GCAAGAGTTC AAACTTGTTG GGAGAAGCCA TGGTTGAACT TCAAGGAGCT GCAAGAGTTC AAACTTGTTG GGAGAAGCCA TGGTTGAACT TCAAGGAGCT GCAAGAGTTC AAACTTGTTG | | | 260 GAGAGGCACC TGCATAG GAGAGGCACC TGCATAG GAGAGGCACC TGCATAG GAGAGGCACC TGCATAG GAGAGGCACC TGCATAG GAGAGGCACC TGCATAG GAGAGGCACC TGCATAG Hình So sánh trình tự vùng mã hóa gien cystatin giống đậu xanh Do trình tự nucleotit vùng mã hóa giống 100% nên trình tự axit amin giống đậu xanh so sánh giống 100% Chiều dài protein cystatin giống đậu xanh so sánh 88 axit amin Vì vậy, cha tìm thấy có khác biệt trình tự axit amin hai giống DX208 (chịu hạn tốt) PaEC3 (chịu hạn kÐm) DX208 | | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 MSQELESVEI DSLARFAVEE HNKKQNALLE FGRVVSAQQQ VVSGTLYTIT DX208 | | | | | | | 60 70 80 LEAKDGGQKK VYEAKVWEKP WLNFKELQEF KLVGEAPA H×nh Trình tự axit amin giống đậu xanh DX208 Các kết thu đợc cho thấy, cha thấy có mối liên quan tính trạng chịu hạn với trình tự nucleotit gien cystatin Tuy nhiên, cần mở rộng nghiên cứu nhiều giống đậu xanh khác để khẳng định kết Vì vậy, cần nghiên cứu promotor trình tự nucleotit gien điều kiện hạn để xác định đợc thị phân tử liên quan đến tính chịu hạn đậu xanh III KếT LUậN Chúng nhân đợc gien cystatin phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu đợc thiết kế dựa sở liệu khai thác Ngân hàng gien quốc tế Sản phẩm PCR đợc dòng hoá nhờ véctơ pTZ57R/T Kết gien cystatin giống đậu xanh nghiên cứu dài 1115 nucleotit, gồm exon intron Đoạn mã hóa dài 267 nucleotit mã hóa sản phẩm protein dài 88 axit amin So sánh trình tự đoạn mã hoá axit amin giống đậu xanh nghiên cứu với giống đậu xanh có mã số AF454396 Ngân hàng gien quốc tế giống đậu xanh KP11, KPS1, 263, MN93, kết cho thấy trình tự gien cystatin thu đợc có độ tơng đồng cao (giống 100%) TàI LIệU THAM KHảO AF454396: Http: //www.ncbi.nlm.nih.gov Lê Trần Bình, Lê Thị Muội, 1998: Phân 127 lËp gen vµ chän dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, Nxb Đại học quốc Gia Hà Nội Diop N N et al., 2004: FEBS Lett., 577(3): 545-50 Filho J X., 1992: R Bras Fisiol Veg., 4(1): 1-6 Gawel N J., Jarret R L., 1991: Genomic DNA isolation Http: //www.igd.cornell.edu/ pretoria lab manual.doc Trần Đình Long, Lê Khả Tờng, 1998: Cây đậu xanh, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội Misaka T et al., 1996: European Journal of Biochemistry, 240(3): 609 Oliveira A S et al., 2003: Brazilian Archives of Biology and Technology, 46(1): 91-104 Ojima A et al., 1997: Plant Molecular Biology, 34(1): 99-109 10 Pernas M et al., 2000: FEBS Lett., 467(2-3): 206-210 11 Ryan S N et al., 2003: Biochem., 134(1): 31-42 12 Ngun Vò Thanh Thanh, 2008: Nghiªn cứu tính đa dạng di truyền phân lập số gen liên quan đến tính chịu hạn ®Ëu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek), LuËn ¸n tiÕn sÜ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội 13 Turk V., Bode W., 1991: FEBS Lett., 285(2): 213-219 COMPARISION OF GENE ENCODING CYSTATIN OF MUNGBEAN CULTIVARS (Vigna radiata (L.) Wilczek) Chu Hoang Mau, Nguyen Vu Thanh Thanh, Nguyen Thi Thu Trang SUMMARY Mungbean Vigna radiata (L) Wilczek is a grain legume widely grown in the world Stresses such as hot, cold, drought and disease limit the mungbean yield In addition, mungbean is low drought tolerance Cystatins are protein inhibitors of cystein proteases belonging to papain family In plants, cystatins are found to be involved in drought stress These were isolated from Vigna unguiculata L., Glycine max L., Daucus carota L., Malus domestica This paper reports our finding about the genes encoding cystatins isolated and assessment of drought tolerant ability from mungbean cultivars (Vigna radiata L Wilczek) with different level of drought tolerance Genomic DNA from two mungbean cultivars, including one with high drought tolerance (Dx208) and one with drought senstitiveness (PaEC3) are subjected for gene cloning using cystatin specific primers Sequencing data of the two cloned cystatin gene fragments proved to be that of cystatin gene with a length of 1115 nucleotides, deviding into exons and intron The PRF of coding regions of cystatin gene comprises of 267 nucleotides with encoding a polypeptide of 88 amino acids The nucleotide sequences of the two cultivars show variations in different sites although the amino acid sequences not differ each to other and even to that announced under the code AF454396 Keywords: cystatin gene, drought stress, mungbean, Vigna radiata Ngày nhËn bµi: 2-7-2008 128 ... TGCATAG H×nh So sánh trình tự vùng mã hóa gien cystatin giống đậu xanh Do trình tự nucleotit vùng mã hóa giống 100% nên trình tự axit amin giống đậu xanh so sánh giống 100% Chiều dài protein cystatin. .. vậy, trình tự gien cystatin giống đậu xanh nghiên cứu có độ tơng đồng cao (99,7%) Dựa số liệu trình tự nucleotit gien cystatin giống đậu xanh nghiên cứu, Hình Biểu đồ hình so sánh mức tơng đồng gien. .. So sánh trình tự đoạn mã hoá axit amin giống đậu xanh nghiên cứu với giống đậu xanh có mã số AF454396 Ngân hàng gien quốc tế giống đậu xanh KP11, KPS1, 263, MN93, kết cho thấy trình tự gien cystatin