Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết nghiên cứu hệ nấm mốc đến tên loài, nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc của hạt, xác định các loài có độc tố OTA và mức độ nhiễm OTA của hạt.
33(3): 68-73 T¹p chÝ Sinh häc 9-2011 HƯ NÊM MèC Và HàM LƯợNG Ochratoxin A (OTA) TRÊN Cà PHÊ NHÂN (COFFEA ROBUSTA) VIệT NAM Đặng Vũ Hồng Miên, Châu Ngọc Hải Lâm Thanh Hiền, Từ Thị Hờng Phân viện Sau thu hoạch, Hồ Chí Minh Cà phê đặc sản vùng khí hậu nhiệt đới Trên giới có 70 nớc trồng cà phê Việt Nam nớc đứng đầu sản xuất cà phê Cà phê có loại là: cà phê chè (Coffea arabica), cà phê nhân hay gọi cà phê vối (Coffea robusta) cà phê mít (Coffea excelsa) Cà phê chè có giá cao nhất, đợc trồng nhiều Brazil Columbia, cà phê vối trồng Việt Nam nhiều nhất, đến Indonexia số nớc khác Đợc ngời Pháp đa vào trồng ë ViƯt Nam tõ gi÷a thÕ kû XIX, diƯn tÝch trồng sản lợng cà phê ngày tăng Chỉ tính năm 1990 sản lợng 92 000 hạt, sau 17 năm đ tăng gần gấp 14 lần (1 280 000 tấn), đứng thứ nhì sản xuất cà phê giới [5] Riêng cà phê vối chiếm gần nửa (49,1%) tổng lợng giao dịch toàn giới Về kim ngạch xuất khẩu, với sản lợng trên, niên vụ 2006-2007 đạt 1,8 tỉ USD, vợt qua hai mặt hàng nông sản xuất nớc ta lúa gạo 1,46 tỉ USD, cao su 1,3 tỉ USD Số liệu cho thấy, cà phê có tầm quan trọng lớn xuất nông sản nớc ta Tuy nhiên, cà phê Việt Nam xuất có vấn đề chất lợng Theo báo cáo Hiệp hội Quốc tế cà phê (International Coffee Organization, ICO), kỳ tháng 11/2000, cà phê nhân Việt Nam xuất đợc chấp nhận 37%, bị từ chối 63% Trong đó, với 22 nớc xuất cà phê, trung bình đợc chấp nhận 72%, có nớc đợc chấp nhận 100% (Indonexia, Nigeria, Ghinê) Kết phân tích 75 mẫu cà phê nhập từ nớc giới vào Ai Cập cho thấy có tới 60% cà phê hạt nhiễm Ochratoxin A (OTA) [7] Nguyên nhân cà phê chất lợng phần lớn cà phê Việt Nam từ sản xuất cá thể quy mô nhỏ, thu hái lẫn xanh chín, phơi sấy 68 không đảm bảo (phơi sấy sân đất nện, hạt phơi dày, cào đảo không kỹ nên hạt khô không đều) Sau phơi bỏ vào bao tải để góc nhà dân, kho trung chuyển không đủ khô, sạch, thoáng gió Trong khí hậu Việt Nam nóng ẩm, vùng trồng cà phê, nhiệt độ 20oC độ ẩm tơng đối không khí 80%, mùa ma ẩm, nhiều ngày 90% Trong điều kiện nh hạt cà phê dù đ khô dễ ngấm ẩm thêm phát sinh mốc Khi cà phê bị mốc, có tác hại sau: Giảm giá trị cảm quan: hạt đen, vàng, nâu; Giảm giá trị dinh dỡng: nấm hấp thụ chất dinh dỡng phân hủy chất đạm, bột, đờng, dầu hạt; Làm khối hạt bị ẩm nóng hơn: làm khối hạt đóng bánh; Tạo mùi vị lạ pha chế: có vị xanh, vị khét, đắng, chát, mùi lên men, mùi mốc [10] Về tình hình nghiên cứu hệ nấm mốc cà phê nhân Việt Nam, hầu nh cha có nghiên cứu sâu vào vấn đề định tên đến loài, số tác giả nêu hệ nấm mốc cà phê Brazil, cà phê nhập vào Nhật Bản số nớc khác, phần lớn nêu đến giống nhóm loài không nêu tới tên loài Một số tác giả sâu vào nghiên cứu độc tố OTA cà phê [7, 12] Chúng cho cần nghiên cứu hệ nấm mốc đến tên loài, nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc hạt, sau xác định loài có độc tố OTA mức độ nhiễm OTA hạt Xuất phát từ nhận định trên, đặt vấn đề xác định hệ nấm mốc cà phê nhân Việt Nam, mức độ mốc hạt, độ ẩm hạt bị mốc, khả sinh độc tố nấm mốc, hàm lợng độc tố OTA phơng hớng giải để đảm bảo chất lợng cho cà phê nhân (C robusta) xuất Việt Nam I phơng pháp nghiên cứu Lấy mẫu Mẫu cà phê nhân (C robusta) đợc lấy từ nhà nông dân trực tiếp sản xuất từ kho trung chuyển Công ty xuất nhập Vinacafe, Công ty Giám định khử trùng FCC (Đắk Lắk, Gia Lai, Lâm Đồng, Đồng Nai) Công ty xuất nhập Thanh Thảo, Đồng Nai Cà phê thuộc niên vụ 1999-2000 2000-2001 Phơng pháp lấy mẫu Cà phê đ đợc bảo quản kho 6-7 tháng, lấy mẫu ngẫu nhiên từ bao khác đại diện cho lô hàng khoảng kg/mẫu, trộn lấy khoảng kg bỏ túi PE bảo quản tủ lạnh (4oC) cho ®Õn lÊy ph©n tÝch [3] Ph©n lËp phân loại Theo phơng pháp thông dụng, rửa mẫu dới dòng nớc chảy, sau ngâm phút dung dịch Natrihypoclorit 0,5% rửa lại nớc cất, làm khô giấy lọc vô trùng, đặt lên hộp petri cã m«i tr−êng dinh d−ìng, đ ë 28 ± 2oC Khi mốc mọc lên, phân lập chủng vào thạch nghiêng để làm phân loại Định tên theo phơng pháp thông dụng: cấy chấm chấm hộp Petri, làm tiêu giọt ép Để quan sát đợc cấu trúc sinh sản nguyên vẹn, dùng phơng pháp cắt miếng thạch từ khuẩn lạc đ mọc cắt miếng môi trờng ì ì mm đặt lam sạch, cấy nấm vào cạnh, đặt lamen lên, đặt hệ thống vào đĩa Petri sạch, có túm tẩm nớc cất [2, 14] Sau 1-2-3 ngày quan sát dới vật kính hiển vi, vật kính 40x 100x Quan sát đại thể, mô tả màu sắc kích thớc, đo vẽ yếu tố, theo mẫu quy định quốc tế cho giống loài Đo độ ẩm (Moisture) Hạt cà phê đem xay, cân, sấy 105oC đến trọng lợng không đổi suy độ ẩm hạt, tính theo phần trăm trọng lợng hạt Xác định độ nhiễm nấm mốc mẫu Hạt cà phê đ đợc rửa sạch, để ráo, đặt môi tr−êng DG18, nu«i ë 28 ± 2oC Theo dâi 27 ngày, quan sát tính % hạt bị mốc tổng số hạt: lặp lại thí nghiệm lần Xác định độc tố nấm Định tính: Cấy nấm thạch kem dõa (Coconut Cream Agar, CCA) tõ 4-5 ngµy ë 28 ± 2oC, chiÕu UV 254 nm (Dyer 1994) NÕu có độc tố, có vành huỳnh quang quanh khuẩn lạc Định lợng: Mẫu định tính có độc tố dơng làm tiếp định lợng theo phơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) [1] Môi trờng nuôi cấy a Môi trờng phân lập DG18 (Dichloran - Glycerol medium) để phân lập nấm mốc thực phẩm nói chung: Glucoza: 10 g; Pepton: g; KH2PO4: g; MgSO4 7H2O: 0,5 g; Dichloran: 0,002 g; Rose bengal: 0,025 g; Chloramphenicol: 0,1 g; Glycerol 175 ml; Th¹ch: 15 g; Nớc cất: 1000 ml b Môi trờng định tên Đối với chủng thuộc Aspergillus Penicillium: MT Czapek: Saccharoza: 30 g; NaNO3: g; K2HPO4: g; KCl: 0,5 g MgSO4 7H2O: 0,5 g; FeSO4 7H2O: 0,01 g; Th¹ch: 15 g; Nớc cất: 1000 ml Đối với chủng thc Hyphomycetes nãi chung: PDA (MT khoai t©y): N−íc chiÕt khoai tây: 250 g; Glucoza: 20 g; Thạch: 15 g; N−íc cÊt: 1000 ml SMA (Synthetic Mucor Agar): Dextroza: 40 g; Asparagin g; K2HPO4: 0,5 g; MgSO4 7H2O: 0,25 g; Thiamin chlorua: 0,005 g; Th¹ch: 20 g; N−íc cÊt: 1000 ml CCA (Coconut Cream Agar, Dyer 1994): Kem dõa: 50%; Th¹ch: 1,5%; N−íc cÊt: 48,5% Thc nhm nÊm: Xanh Cotton: 0,05 g; Axit phenic: 20 g; Axit lactic: 20 g; Glyxerin: 40 g; N−íc cÊt: 20 ml II KÕt thảo luận Hệ nấm mốc cà phê robusta Việt Nam Qua bảng 1, tổng sè 52 loµi, ta thÊy gièng Apergillus chiÕm 25 loµi (43%), giống Penicillium chiếm 12 loài (23%) giống khác giống từ - loài, cộng 15 loài chiếm 28,8% Về độc tố, 22 loài (42% tổng số loài) có khả sinh độc tố khác nhau, nhng riêng độc tố OTA đặc biệt quan tâm cà phê có loài nhãm A niger lµ A niger vµ A carbonarius nh−ng gặp từ lần Còn nhóm A ochraceus loài có loài sinh độc tố 69 Bảng Danh mục nấm mốc cà phê nhân (C robusta) Việt Nam STT Tên loài nấm Nhóm loài Aspergillus niger Aspergillus awamori Nakazawa A carbonarius (Bainier) Thom A ficuum (Reich) Hennings A foetidus Nakazawa A japonicus Saito A niger Van Tieghem A tubingensis (Schober) Mosseray Nhãm loµi Aspergillus ochraceus A alliaceus Thom & Church A elegans Gasperini 10 A melleus Yukawa 11 A ochraceus Wilhelm 12 A ostianus Wehmer 13 A petrakii Voros Nhãm loµi Aspergillus flavus 14 A flavus Link A flavus var columnaris K B Raper 15 et D Fennell 16 A oryzae (Ahlburg) Cohn A oryzae (Ahlb.) Cohn var effusus 17 (Tiraboschi) Ohara 18 A parasiticus Speare 19 A tamarii Kita C¸c nhãm kh¸c cđa chi Aspergillus 20 A asperescens Stolk 21 A conjunctus Kwon Fennell 22 A fumigatus Fresenius A terricola Marshal A unguis (Emile-Well Gaudin) Thom 24 et Raper 25 A versicolor Wuill Tiraboschi Chi Penicillium 26 Penicillium canescens Sopp 27 P camemberti Thom 28 P citrinum Thom 29 P crustosum Thom 30 P echinosporum Nehira et Ramirex 31 P lanoso-coruleum Thom 32 P nigricans (Bainier) Thom 33 P notatum Westling 34 P purpurogenum Stoll 23 70 N 87 32 22 §éc tè cã thĨ s¶n sinh (*) Aflatoxin (AF), OTA AxÝt oxalic, axÝt penixilic, malformin, OTA 62 C¸c ochratoxin 33 C¸c ochratoxin C¸c ochratoxin, axÝt penixilic, AF, C¸c ochratoxin C¸c ochratoxin 36 AF, aflatrem, axÝt xiclopiazonic axÝt kojic, oryzaxidin 32 AF axÝt kojic 1 18 Fumagilin, gliotoxin, axÝt helvolic, fumitramorgin axÝt kojic 1 1 10 2 11 Sterigmatoxistin, aversin axÝt cyclopiazonic AF, xitrinin Notatin, xanthoxilin axÝt glaucanic 35 P rubrum Stoll Rubratoxin, axÝt glauconic phenixin Xitrinin 36 P steckii Zaleski 37 P waksmani Zaleski Các loài kh¸c Cylindrocarpon lichenicola, 38 Marshal, D Hawksw 39 C didynum Harling Wollenw 40 C tonkinense Bugn 41 Eurotium amstelodami Mangin C 42 E chevalieri Thom & Church 28 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 Fusarium lateritium Nees F solani (Mart.) Sacc Haplariopsis fagicola Oudem Mucor hiemalis Wehmer M microsporus Namyslowski M racemosus f sphaerosporus M subtilissimus Oudem Rhizopus nodosus Namysl R oryzae Went & Princen Geerlings Thamnidium elegans Link 1 10 1 15 Antraquinon, physion Antraquinon, gliotoxin, Xanthoxilin Ghi chó: (*) Theo Moreau C 1978 [6] Renata Clark, 2000 [10]; N Số lần gặp/tổng số chủng phân lập Độ ẩm hạt tình trạng mốc cà phê nhân (C robusta) Việt Nam Bảng Độ ẩm hạt tỷ lệ hạt bị mốc STT Độ ẩm hạt (%) Tỷ lệ h¹t mèc (%) NhËn xÐt 9,85 - 10,3 10,3 Mèc nhĐ 11,0 - 11,5 83/85/90/100 Mèc nỈng 11,6 - 12,3 12,3 - 14,0 100 100 Mèc nặng Mốc nặng Qua bảng 2, độ ẩm lớn 11% đ mốc nặng Xét mức độ mốc, mốc 10 - 20% số hạt Ghi Cá biệt có mÉu cã ®é Èm 9,91% ® mèc 100% Cã mÉu mốc 83, 85, 90, đa số mốc 100% Tất mốc 100% Tất mốc 100% coi mốc nhẹ, 50 - 60% mốc vừa, 60% mốc nặng (bảng 3) Bảng Tỷ lệ mẫu mốc xếp từ nhẹ đến nặng Mốc nhẹ 10 - 20% sè h¹t Sè mÉu Tû lƯ nhiƠm 1/56 1,8% Mèc võa 50 - 60% sè h¹t Sè mÉu Tû lƯ nhiễm 1/56 1,8% Mốc nặng 60 - 100% số hạt Số mẫu Tỷ lệ nhiễm 54/56 96,4% Hàm lợng OTA cà phê nhân (C robusta) Việt Nam Kết phân tích hàm lợng OTA cà phê đợc trình bày bảng 71 Bảng Hàm lợng OTA cà phê nhân (C robusta) Việt Nam Sè mÉu Sè mÉu nhiÔm OTA 52 50 Tû lệ (%) mẫu nhiễm OTA 96,15 Hàm lợng OTA (ppb/kg) < ppb 1-5 ppb > ppb Sè Tû lÖ Sè Tû lÖ Sè Tû lÖ mÉu mÉu mÉu 46 88,5 % 5,77 % 1,92 % So sánh với kết nớc: Theo Nehad 2007 [7], 45/75 mẫu cà phê nhập vào Ai CËp nhiƠm OTA: 5,6- 6,1 ppb/kg; Tsubouchi 1992 [12]: cµ phê nhập vào Nhật Bản: 4/23 mẫu có OTA: 9,9-46 ppb/kg; Theo Tiêu chuẩn Pháp: ppb/kg; Tiêu chuẩn ý: ppb/kg; EMC (European Common Market): ppb/kg; EU: cà phê nhân: ppb/kg, cà phê hòa tan: 10 ppb/kg số nớc khác: - 20 ppb/kg ë ViƯt Nam, Bé Y tÕ cho phÐp c¸c độc tố nấm (trừ aflatoxin): 35 ppb/kg (Q867/1998/QĐBYT) Tuy nhiên, điều kiện tự nhiên việc sản sinh OTA phụ thuộc nhiều yếu tố: độ ẩm, chất, chủng loại nấm, nhiệt độ môi trờng thời gian tồn kho Thùc tÕ, thÝ nghiƯm cđa chóng t«i, cã mẫu độ ẩm tới 25,63% hàm lợng OTA lên tíi 7,47 ppb/kg Trong c¸c mÉu kh¸c chØ tõ 0,16-0,67 ppb/kg Vì vậy, kết thí nghiệm nên đánh giá điều kiện thực tế đ thí nghiƯm Dï kÕt qu¶ còng cho thÊy OTA ë cà phê nhân (C robusta) Việt Nam thấp dới mức cho phép chung Đ có nghiên cứu chống nấm mốc cho nhiều nông sản nh: lạc, ngô, thức ăn chăn nuôi Đ dùng màng polyethylen (PE) dày 0,08 mm lµm bao víi bao ngoµi lµ bao đay, đạt kết bảo quản từ 5-7 tháng ®iỊu kiƯn nhiƯt ®íi nãng Èm ë ViƯt Nam, h¹t ngấm ẩm thêm không đáng kể không bị mốc [13, 14] Màng PE thị trờng có sẵn, giá rẻ, có độ thông khí tốt, không ảnh hởng đến hô hấp tối thiểu hạt, nhng không cho phân tử nớc qua nên hạt không ngấm ẩm thêm Về vấn đề hạ độ ẩm xuống từ 1-2% so với tiêu chuẩn cũ vấn đề dùng bao hai lớp để hạt không bị mốc không bị khách hàng loại bỏ cần đợc tính toán cụ thể theo chiều hớng có lợi 72 Trung bình (ppb/kg) 0,38 III Kết luận đề nghị Qua nghiên cứu tình hình nấm mốc cà phê nhân (C robusta) tỉnh Trung Việt Nam, đ phát hiƯn 52 loµi nÊm mèc, sè nµy cã 22 loài (43%) có khả sinh độc tố khác Riêng với độc tố OTA đợc chù ý nhiều gây bệnh gan, thận, ung th cho ngời có loài có khả sinh OTA diện Về tình trạng nhiễm mốc cà phê nhân (C robusta) tuỳ độ ẩm hạt mốc nhiều hay ít, nhng tuyệt đại đa số độ Èm tõ 11 12,5% mèc rÊt trÇm träng, tõ 80 đến 100% số hạt Số liệu cho thấy, quy định Hiệp hội Cà phê - Ca cao Việt Nam cho độ ẩm đợc phép xuất 12 - 12,5% cao, thu hái, phơi sấy, lu kho điều kiện tốt nên mốc không tránh khỏi Để tránh tình trạng cà phê xuất ta bị loại nhiều, đề nghị vấn đề: Cần giảm độ ẩm cà phê xuất xuống đến 10,5-11%: Về hàm lợng OTA cà phê ta thấp nhiều so với nghiên cứu số nớc khác, nhng hạt ngấm ẩm kéo dài, đạt độ ẩm cao OTA cao nhiều Hơn nữa, OTA không cao, việc cà phê bị mốc nhiều tạo mùi khó chịu cho ngời tiêu dùng Để đề phòng không cho mốc mọc: Cần phải cải tiến trình thu hái bảo quản để sau hạt đ khô không ngấm ẩm trở lại Cách đơn giản mà tốt bao gói hai lớp: lớp màng chất dẻo không chống ẩm, sau bao bao đay (chống đứt rách) Tài liƯu tham kh¶o AOAC, 1995: Official Methods of Analysis High pressure liquid chromatography (HPLC) 2 Dyers S K & Mc Cammon S C., 1994: Detection of toxigenic isolate of Aspergillus flavus and related species on coconut cream agar J Appl Bact., 76: 75-78 FAO, 2001: Manual on the Application of HACCP system in Mycotoxin Prevention and Control FAO Food and Nutrition, p 73 Gams W., H A Vandex Aa, A J van der Plaats, Niterink A., Samson, J A Stalpers, 1987: CBS course of mycology Centraalbureau voor Schimmelcultures Baarn Netherlands Leong S L., Hien L T., An T V., Hocking A D., Scott E S., 2007: Ochratoxin A producing Aspergilli in Vietnamese green coffee beans Letter Applied Microbiology, 45(3): 301-306 Moreau C (Đặng Vũ Hồng Miên dịch, 1980), 1978 : Moisissures Toxiques dans LAlimentation Masson et Cie Paris Nxb Khoa häc vµ Kü thuËt, Hµ Néi Nehad E A., Farag M M., Kawther M S., Khayria N., 2007: An exposure and Intake Assesment of Ochratoxin A from Imported Coffee Beans in Egypt Word J of Agricultural Science, 3(3): 285-294 Raper K B., Fennell D I., 1965: The genus Aspergillus the Williams and Wilkins Company Raper K B., Thom C., Fennell D I, 1968: A manual of the Penicillia Hafner Publishing Company INC 10 Renata Clarke, Mary Friel, 2000: Standard Service, Nutrition and Consumer, Protection Division FAO, 43p 11 Pitt J I., Hocking A D., 1997: Fungi and Food Spoilage 2nd ed Univ Pr., Cambridge Great Britain 12 Tsubouchi H., Nakajima M., Yamamoto K., Miyabe M., 1992: Elimination Mycotoxin in Green Coffee Beans by Handpicking Proceedings of Japanese Association of Mycotoxicology: 45-48 13 Đặng Vũ Hồng Miên, 1975: Chống mốc cho hạt lạc T¹p chÝ Khoa häc Kü thuËt, 103(1): 31-32; 104(2): 25-28 14 Đặng Vũ Hồng Miên, 1980: Nấm mốc số sản phẩm công nông nghiệp Phơng pháp thử-biện pháp phòng chống Luận văn Tiến sĩ Sinh học Viện Khoa häc ViÖt Nam 15 Pidoplichko N M., Milko A A., 1971: Atlas Mykoralnyk Gribov Nayka u Dumka Kiev (tiÕng Nga) Study on the mycoflora and the production of Ochratoxin A (OTA) by mould on Coffea robusta in Vietnam DAng VU HOng MiEn, ChAu NgOc Hai, LAm Thanh Hien, TU ThI HUOng Summary 103 samples of Coffea robusta were investigated, 507 fungi trains were isolated on Czapek or PDA media for identification 52 species from genera were listed The genus Aspergillus with 25 species and Penicilium with 13 species represented respectively 43% and 23% of the total number of species The Ochraceus group, well-known as OTA potential producers with species represented 9% of the total number of isolates By direct plating, the beans with the moisture of 11-14%, were heavily contained by moulds (80 to 100% of the beans plated) and those with the moisture of 9-10,5 % were lightly infected (10.3%) 22 species (40%) were known as producers of different mycotoxins OTA were present on 50 of the 52 samples examined (96.4%), but the level was not high: 88.5% with less than ppb/kg The authors proposed that Vietnamese C robusta green beans for exportation would have less than 11% moisture to prevent mould growth and in a humid tropical climate of Vietnam, to prevent dehumidification, the beans would be packed in two-coated bag, the inside coat in polyethylene sheet of 0.08 mm thick and the external one in jute as ordinary The beans thus would be prevented from dehumidification and mould formation for at least to months Ngµy nhËn bµi: 14-10-2009 73 ... phê nhân (C robusta) Việt Nam STT Tên loài nấm Nhóm loài Aspergillus niger Aspergillus awamori Nakazawa A carbonarius (Bainier) Thom A ficuum (Reich) Hennings A foetidus Nakazawa A japonicus Saito... penixilic, malformin, OTA 62 C¸c ochratoxin 33 C¸c ochratoxin C¸c ochratoxin, axÝt penixilic, AF, C¸c ochratoxin C¸c ochratoxin 36 AF, aflatrem, axÝt xiclopiazonic axÝt kojic, oryzaxidin 32 AF axÝt... 96,4% Hàm lợng OTA cà phê nhân (C robusta) Việt Nam Kết phân tích hàm lợng OTA cà phê đợc trình bày bảng 71 Bảng Hàm lợng OTA cà phê nhân (C robusta) ë ViƯt Nam Sè mÉu Sè mÉu nhiƠm OTA 52 50 Tỷ lệ