Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết khảo sát khả năng chịu hạn và nghiên cứu sự đa dạng trong cấu trúc gien liên quan đến đặc tính này của một số giống đậu tương ở địa phương, làm cơ sở cho chương trình chọn giống đậu tương chịu hạn, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gien cây đậu tương địa phương miền núi.
29(4): 31-41 12-2007 Tạp chí Sinh học ĐáNH GIá KHả NĂNG CHịU HạN Và TáCH DòNG GIEN Mà HOá PROTEIN DEHYDRIN (LEA-D11) CủA MộT Số GIốNG ĐậU TƯƠNG [GLYCINE MAX (L.) MERRILL] ĐịA PHƯƠNG MIềN NúI CHU HOàNG MậU, NGUYễN THU HIềN Đại học Thái Nguyên Đậu tơng [Glycine max (L.) Merrill] loại trồng chiến lợc nhiều quốc gia giới Hạt đậu tơng có 32 - 40% protein, 12 25% lipit, chứa đầy đủ loại axit amin không thay nhiều loại vitamin (B1, B2, C, D, E, K ) [7] Cây đậu tơng có thời gian sinh trởng ngắn, hệ rễ có nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm, đậu tơng thờng đợc trồng luân canh với lúa ngô để tăng vụ cải tạo đất bạc màu Việt Nam, đậu tơng đợc gieo trồng vùng nông nghiệp nớc Nguồn giống đậu tơng nớc ta phong phú, bao gồm giống nhập nội, giống lai tạo, giống đột biến tập đoàn giống địa phơng Các giống đậu tơng địa phơng phổ biến có suất thấp, nhng lại có chất lợng hạt tốt khả chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi Đậu tơng tơng đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh thuộc vào nhóm chịu hạn Do vậy, mục đích chọn giống có suất cao việc tuyển chọn giống đậu tơng có kiểu gien chịu hạn ngày đợc quan tâm nghiên cứu [9, 10, 12, 14] Cho đến đà có số công trình tập trung tìm hiểu sở hoá sinh sinh học phân tử đặc tính chống chịu đậu tơng, nghiên cứu thay đổi hàm lợng protein axit amin prolin thời điểm trớc sau bị hạn [5, 15, 17], nghiên cứu nhóm protein, enzim hạt số giống đậu tơng chịu nóng, chịu hạn khác nh protein dự trữ, proteaza, amylaza [12] đặc biệt nhóm protein chịu hạn LEA (Late embryogieneis abundant) [4] LEA loại protein đợc tổng hợp với số lợng lớn giai đoạn cuối trình hình thành phôi, nhóm protein quan trọng liên quan đến ®iỊu kiƯn mÊt n−íc cđa tÕ bµo Protein LEA giµu axit amin a nớc, không chứa cystein trytophan, có vùng xoắn có khả chịu nhiệt [4, 13], chúng thay vị trí nớc tế bào thực chức khác nhau, nh cô lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, phân huỷ protein biến tính điều chỉnh áp suất thẩm thấu Ngoài LEA điều chỉnh trình nớc sinh lí hạt chín, mà hạn chế nớc bắt buộc điều kiện ngoại cảnh bất lợi gây [4, 16] Nhóm gien mà hoá loại protein LEA đóng vai trò quan trọng chịu khô hạn hạt liên quan đến khả chống hạn Khi tợng nớc xảy ra, gien LEA phiên mà tổng hợp số lợng lớn mARN hạt chín bị phân giải hết trình nảy mầm Mức độ phiên mà gien LEA đợc điều khiển axit abcisic (ABA) độ nớc tế bào, áp st thÈm thÊu tÕ bµo [4, 11] Theo h−íng nghiên cứu này, tiếp tục khảo sát khả chịu hạn nghiên cứu đa dạng cấu trúc gien liên quan đến đặc tính số giống đậu tơng địa phơng, làm sở cho chơng trình chọn giống đậu tơng chịu hạn, góp phần bảo tồn phát triển nguồn gien đậu tơng địa phơng miền núi I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Sử dụng hạt giống đậu tơng địa phơng có chất lợng tốt Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm đậu đỗ thuộc Viện Cây lơng thực thùc phÈm - ViƯn Khoa häc N«ng nghiƯp ViƯt Nam cung cấp làm nguyên liệu nghiên cứu, là: Vàng Mờng Khơng (VMK), Quảng Hoà (QH), Cúc Hữu Lũng (HL), Lơng Sơn (LS), Thanh Oai hạt đen (TOĐ), Vàng Cao Bằng (VCB), Cao Bằng (CB4), Vàng Bắc Kạn (VBK), đối chứng giống đậu tơng DT93 31 Đánh giá nhanh khả chịu hạn giống đậu tơng giai đoạn non chét phơng pháp gây hạn nhân tạo theo Lê Trần Bình cs (1998) [2] Chỉ số chịu hạn tơng đối đợc xác định dựa tỷ lệ không héo (CKH), tỷ lệ hồi phục (HP) tỷ lệ chất khô rễ (CK) sau thời điểm 5, ngày bị hạn Xác định hàm lợng protein theo phơng pháp Lowry đợc mô tả tài liệu Phạm Thị Trân Châu cs (1997) [6]; hàm lợng prolin đợc xác định theo Bates cs (1973) [1] Phơng pháp tách chiết ADN tổng số từ mầm đậu tơng đợc tiến hành theo quy trình Foolad cs (1995) [8] Gien mà hoá protein dehydrin (LEA-D11) đợc nhân kỹ thuật PCR với cặp mồi MD1, MD2 đợc thiết kế theo công bố Cao Xuân Hiếu cs [11] Cặp mồi MD1, MD2 đợc tổng hợp h·ng Invitrogien cã tr×nh tù nh− sau: MD1: 5’-TCAAAACCAACAACAACTATGGC-3’ MD2: 5-GCATCTACTTGTCACTGTGTCC-3 PCR đợc tiến hành với 25 àl, có 2,5 àl đệm, àl dNTP 10 mM, àl mồi xuôi mồi ngợc 10 pmol/àl, àl ADN khuôn 100 ng/àl, 0,4 àl Taq polymerase U/àl, 17,1 àl H2O Chu trình nhiệt PCR là: 94oC phót; 30 chu kú víi nhiƯt ®é: 94oC phót, 55oC 50 gi©y, 72oC phút 30 giây; 72oC phút; lu giữ 4oC Tách dòng gien dehydrin đợc tiến hành cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCR2.1 với việc sử dụng sinh phẩm tách dòng hÃng Invitrogien Phản ứng gắn có thành phần gồm 3,5 àl H2O, àl dung dịch đệm, àl sản phẩm PCR, 1,5 àl vectơ pCR2.1, àl T4 ligaza, sản phẩm gắn đợc biến nạp vào E coli chủng DH5 Các khuẩn lạc E coli chứa vectơ tái tổ hợp mang sản phẩm PCR đợc chọn lọc môi trờng LB chứa amplixilin, IPTG Xgal Sử dụng enzim EcoRI để cắt kiểm tra vectơ tái tổ hợp, mẫu VMK lựa chọn plasmit dòng 1-4, mẫu CB4 chọn plasmit dòng 7, 8, Thành phần phản ứng cắt gồm 5,3 àl H20, àl buffer cho EcoRI, µl ADN plasmit, 0,3 µl EcoRI MÉu cắt đợc ủ nhiệt độ 37oC thời gian Sau sản phẩm cắt đợc kiểm tra điện di gel agaroza 1% (hình 3) Xác định trình tự nucleotit thiết bị tự động ABI 3100 dựa nguyên tắc phơng pháp Sanger có sử dụng dideoxyribonucleotit Phân tích trình tự gien phần mềm DNAstar BioEdit II KếT Quả Và THảO LUậN Khả chịu hạn giống đậu tơng địa phơng giai đoạn non Kết qủa phân tích tiêu liên quan đến khả chịu hạn số giống đậu tơng giai đoạn non chét đợc trình bày bảng Bảng cho thấy, số chịu hạn tơng đối giống đậu tơng địa phơng miền núi cao giống ĐT93 xếp thứ tù tõ cao ®Õn thÊp nh− sau: VMK > CB4 > HL > VBK > QH > LS > TO§ > VCB > ĐT93 Bảng Tỷ lệ không hÐo (CKH), håi phơc (HP), chÊt kh« (CK) cđa rƠ số chịu hạn tơng đối giống đậu tơng địa phơng (n = 30) Giống đậu tơng QH HL LS VMK TO§ VCB VBK CB4 §T93 32 % CKH sau ngày hạn % CKH sau ngày hạn % HP sau hạn ngày % HP sau hạn ngày % CK rễ sau hạn ngày % CK rễ sau hạn ngày Chỉ số chịu hạn tơng đối 63,33 56,67 50,00 76,67 46,67 36,67 60,00 40,00 36,67 33,33 43,33 36,67 63,33 33,33 23,33 46,67 40,00 23,33 45,45 38,46 46,67 57,14 28,57 36,84 33,33 55,56 16,67 17,65 29,41 31,58 54,55 35,00 30,43 31,25 40,91 12,50 64,13 56,23 34,45 75,89 49,65 55,67 54,56 65,67 53,56 45,67 62,34 51,34 57,86 44,65 43,67 51,34 74,22 34,56 4928,27 6038,47 4521,38 10633,87 4133,64 3707,95 5622,12 7198,52 2269,21 % C KH sau n gà y h ạn 80 60 % C K cđ a rƠ sa u h ¹ n n g µ y % C KH sa u n gà y h ạn 40 20 % C K cđ a rƠ sa u h ¹ n n g µ y % H P sa u hạ n ng ày % H P sa u hạ n n gày QH HL LS VMK VCB VBK CB4 Đ T93 TOĐ Hình Đồ thị biểu diễn khả chịu hạn giống đậu tơng nghiên cứu Chúng tiến hành phân tích hàm lợng protein hàm lợng prolin đậu tơng non thời điểm trớc bị hạn sau ngày hạn (bảng 2) Bảng Hàm lợng protein prolin đậu tơng non thời điểm trớc sau gây hạn Giống QH HL LS VMK TOĐ VCB VBK CB4 DT93 Hàm lợng protein Trớc hạn Sau hạn (% khối lợng (% khối tơi) lợng tơi) 6,78 0,63 5,23 0,34 6,34 0,17 5,28 … 0.45 7,34 … 0,45 6,98 … 0,06 9,87 … 0,21 8,34 … 0,07 9,26 … 0,23 7,67 … 0,33 9,12 … 0,07 6,89 … 0,05 8,94 … 0,67 7,34 … 0,05 7,95 … 0,02 7,34 … 0,09 7,94 … 0,34 6,81 … 0,37 Tû lƯ gi¶m (%) 22,86 16,72 4,90 15,50 17,17 24,45 17,90 7,67 14,23 Trong ®iỊu kiện thiếu nớc, enzim proteaza hoạt động cách tích cực phân giải protein đả bị biến tính số protein phức tạp để tạo polypeptit ngắn, tan môi trờng nội bào tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào Kết bảng cho thấy, sau bị hạn, hàm lợng protein giống đậu tơng giảm rõ rệt (giảm từ 4,90% đến 24,45%) giống VCB có hàm lợng protein giảm mạnh (24,45%) Hàm lợng prolin đợc tích luỹ tế bào đà có tăng Hàm lợng prolin Trớc hạn Sau hạn (% khối (% khối lợng lợng tơi) tơi) 1,45 0,04 5,03 … 0,34 1,03 … 0,05 4,02 … 0,42 2,56 … 0,05 3,46 … 0,03 2,56 … 0,13 7,78 … 0,45 2,04 … 0,32 3,14 … 0,31 1,89 … 0,41 2,87 … 0,09 2,80 … 0,29 4,98 … 0,05 1,45 … 0,31 4,47 … 0,34 1,34 … 0,32 2,67 … 0,09 Tỷ lệ tăng (%) 246,90 290,29 35,16 203,91 53,92 51,85 77,86 208,28 99,25 lên sau bị hạn ngày Tuỳ giống mà hàm lợng prolin thời điểm hạn ngày đà tăng so với thời điểm trớc bị hạn từ 35,16% đến 290,29% Các giống CB4, VMK, QH, HL có hàm lợng prolin tăng cao tăng 200% Prolin lµ mét axit amin tham gia tÝch cùc viƯc điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào Prolin axit amin a nớc có khả giữ lấy nớc cho tế bào, ngăn chặn xâm nhập Na+, tơng tác với protein màng 33 lipit màng, ngăn chặn phá huỷ màng phức protein khác Hiện tợng tăng hàm lợng prolin khác giống gặp hạn sở giải thích mức độ chịu hạn khác giống đậu tơng Sự tăng nhanh hàm lợng prolin giảm hàm lợng protein giống đậu tơng bị hạn đà chứng tỏ đậu tơng có phản ứng cách tích cực trớc thay đổi điều kiện ngoại cảnh Nh vậy, xét phơng diện hoá sinh giống đậu tơng HL, QH, VMK, CB4 giống có khả chống hạn tốt nhất, giống QH có khả chịu hạn đứng thứ hai sau giống HL, nhng vào số chịu hạn tơng đối giống QH lại vị trí thứ năm Vấn đề xác định số chịu hạn tơng đối, nghiên cứu theo dõi tỷ lệ không héo, hồi phục sau ngày hạn, nhiều tiêu khác cha có điều kiện phân tích Mặt khác tính chịu hạn thực vật nói chung đậu tơng nói riêng tính trạng đa gien, để đánh giá cách xác khả chịu hạn giống đậu tơng cần phải tiến hành phân tích thêm tiêu sinh lý, hóa sinh liên quan đến tính chịu hạn giai đoạn đậu tơng non Kết nhân gien dehydrin từ giống đậu tơng Mầm ngày tuổi giống đậu tơng đợc nghiền mịn điều kiện nhiệt độ thấp, ADN hệ gien đợc chiết rút khỏi tế bào nhờ dung dịch đệm có chứa Tris HCl 10 mM pH 8,0; EDTA 10 mM; NaCl 100 mM, CTAB 4% proteaza K với nồng độ 10 àl/ml Từ 0,5 g mẫu loại thu đợc 200 àl dung dịch chiết ADN Các mẫu ADN có độ tinh đợc kiểm tra máy quang phỉ ë b−íc sãng λ = 260/280 nm vµ cã ®Ønh cùc ®¹i ë b−íc sãng 260 nm Sau ®ã dung dịch ADN lại kiểm tra phơng pháp điện di gel agaroza 0,8%, kết cho thấy ADN đợc tách chiết từ giống đậu tơng tơng đối sạch, sử dụng để nhân đoạn gien b»ng kü tht PCR Sư dơng ADN hƯ gien làm khuôn để nhân gien mà hoá protein dehydrin (LEA - D11) b»ng kü tht PCR víi cỈp måi MD1, MD2, kết nhân gien dehydrin PCR đợc ë h×nh 34 M 0,7kb Hình Điện di đoạn gien dehydrin đợc nhân kỹ thuật PCR M thang ADN chuẩn (ADN cắt HindIII EcoRI); VMK; CB4; VCB; QH; HL; LS2; DT93 Hình ảnh điện di hình cho thấy, giống đậu tơng nhận đợc sản phẩm PCR đặc hiệu Kích thớc phân tử vào khoảng 0,7 kb, tơng ứng với vùng mang mà gien dehydrin Kích thớc phân tử sản phẩm PCR nhận đợc tơng đơng với kích thớc phân tử đoạn mang mà cDNA gien dehydrin nh giống đậu tơng nghiên cứu có gien dehydrin gien không chứa itron Để khẳng định điều này, đà tiến hành tách dòng xác định trình tự gien dehydrin hai giống đậu tơng địa phơng Vàng Mờng Khơng (VMK) Cao Bằng (CB4) Tách dòng sản phẩm PCR hai giống đậu tơng VMK CB4 Sau nhân gien dehydrin có đậu tơng kiểm tra sản phẩm PCR điện di gel agaroza 1%, đà chọn sản phẩm PCR hai giống đậu tơng VMK CB4 (hai giống có khả chịu hạn tốt nhất) để tiến hành tách dòng gien Tách dòng đợc thực cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR mẫu VMK mẫu CB4 vào vectơ tách dòng pCR2.1 hÃng Invitrogien, sau biến nạp vào trực khuẩn E coli tách chiết lại plasmit để chọn loại tái tổ hợp mang đoạn ADN thuộc gien dehydrin Để chọn lọc dòng tế bào chủ mang plasmit tái tổ hợp chứa đoạn gien dehydrin cần tách dòng, chọn 13 khuẩn lạc (trong có khuẩn lạc trắng mẫu VMK, khuẩn lạc trắng mẫu CB4 khuẩn lạc xanh), cấy khuẩn lạc ml m«i tr−êng LB láng cã bỉ sung amplixilin để tiến hành tách chiết ADN plasmit Các plasmit đà tách chiết đợc kiểm tra điện di gel agaroza 1% Nh đà trình bày, để khẳng định cách chắn việc gắn đoạn gien dehydrin vào vectơ tách dòng pCR2.1, đà sử dụng enzim giới hạn EcoRI để cắt kiểm tra vectơ tái tổ hợp mang đoạn gien dehydrin, vectơ tách dòng pCR2.1 có hai vị trí cắt E coRI hai đầu vùng cắt gắn đa vị Nếu vectơ tái tổ hợp gắn đợc đoạn gien mong muốn sau cắt enzim giới hạn EcoRI, plasmit tái tổ hợp văng đoạn ADN dài khoảng 750 bp (hình 3) M 750 bp ~ ~750 bp H×nh Kết cắt kiểm tra plasmit tái tổ hợp enzim EcoRI Đờng chạy sản phẩm PCR mẫu VMK; đờng chạy 2-5 dòng plasmit 1-4 mẫu VMK; đờng chạy M ADN chuẩn cắt HindIII EcoRI; đờng chạy 6-8 dòng plasmit 7, 8, mẫu CB4; đờng chạy 10 sản phẩm PCR mẫu CB4 Kết điện di cho thấy đoạn ADN đợc cắt văng khỏi vectơ tái tổ hợp có kÝch th−íc kho¶ng 750 bp xÊp xØ víi kÝch th−íc đoạn gien dehydrin cần tách dòng Vì vậy, khẳng định đà chọn đợc dòng plasmit tái tổ hợp (1-4 ) mẫu VMK dòng plasmit tái tổ hợp (7, 8, 9) mẫu CB4 có khả chứa đoạn gien dehydrin có kích thớc khoảng 750 bp Để khẳng định cách chắn plasmit tái tổ hợp tách dòng mang đoạn gien dehydrin cần giải trình tự gien plasmit Chúng lựa chọn plasmit dòng số mẫu VMK plasmit dòng số mẫu CB4 để tinh phục vụ cho mục đích xác định trình tự gien Plasmit tái tổ hợp đợc tinh sinh phẩm Miniprep Kit hÃng QIAGIEN Sau tinh plasmit đợc kiểm tra điện di gel agaroza 1% Kết phân tích trình tự gien dehydrin hai giống đậu tơng VMK CB4 Plasmit tái tổ hợp sau đợc tinh đà đợc sử dụng phản ứng xác định trình tự Sau xác định trình tự thiết bị tự động ABI 3100, sử dụng phần mềm DNAstar BioEdit để phân tích trình tự gien Kết phân tích cho thấy trình tự gien mà hoá dehydrin mẫu VMK mẫu CB4 mà đà xác định đợc dài 751 bp, gien dehydrin giống đậu tơng VMK có 226 A, 156 C, 214 G, 155 T; cßn gien dehydrin giống đậu tơng CB4 có 227A, 155C, 214 G, 155 T Chúng đà phân tích so sánh ngân hàng liệu gien quốc tế thấy đoạn gien mà đà giải mà đợc gien mà hoá cho dehydrin đậu tơng Khi so sánh với 34 trình tự gien tác giả khác công bố ngân hàng liệu gien quốc tế cho kết trình tự gien bắt với gien dehydrin giống đậu tơng VMK CB4 mà phân lập đợc [18] Kết so sánh cho thấy, trình tự gien dehydrin hai giống đậu tơng VMK CB4 mà phân lập đựợc gần với trình tự gien dehydrin phân lập từ bốn giống đậu tơng M103, Cúc vàng, MV1C V74 (hình 4) [18] 35 VMK CB4 CucVang M103 MV1C V74 VMK CB4 CucVang M103 MV1C V74 VMK CB4 CucVang M103 MV1C V74 VMK CB4 CucVang M103 MV1C V74 VMK CB4 CucVang M103 MV1C V74 VMK CB4 CucVang M103 MV1C V74 VMK CB4 CucVang M103 MV1C V74 VMK CB4 CucVang M103 MV1C V74 36 | | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 TCAAAACCAA CAACAACTAT GGCAAGTTAT CAGAAGCACT ACGATGATCA TCAAAACCAA CAACAACTAT GGCAAGTTAT CAGAAGCACT ACGATGATCA AT GGCAAGTTAT CAAAAGCACT ACGATGATCA AT GGCAAGTTAT CAGAAGCACT ACGATGATCA AT GGCAAGTTAT CAAAAGCACT ACGATGATCA AT GGCAAGTTAT CAGAAGCACT ACGATGATCA | | | | | | | | | | 60 70 80 90 100 GGGTCGCAAG GTCGACGAGT ATGGCAATGT TGAGAGGCAA ACTGACGAAT GGGTCGCAAG GTCGACGAGT ATGGCAATGT TGAGAGGCAA ACTGACGAAT GGGTCGCAAG GTTGACGAGT ATGGCAACGT TGAGAAGCAA ACCGACGAAT GGGTCGCAAG GTCGACGAGT ATGGCAATGT TGAGAGGCAA ACTGACGAAT GGGTCGCAAG GTTGACGAGT ATGGCAACGT TGAGAAGCAA ACCGACGAAT GGGTCGCAAG GTCGACGAGT ATGGCAATGT TGAGAGGCAA ACTGACGAAT | | | | | | | | | | 110 120 130 140 150 ATGGCAACCC GGTTCATGCC ACTAGTGTCA CTTATGTAGC CACCAAAAGT ATGGCAACCC GGTTCATGCC ACTAGTGTCA CTTATGTAGC CACCAAAAGT ACGGCAACCC TGTTCATGCT GCTAGTGTCA CCTATGTAGC CACCAGAACT ATGGCAACCC GGTTCATGCC ACTAGTGTCA CTTATGTAGC CACCAAAAGT ACGGCAACCC TGTTCATGCT GCTAGTGTCA CCTATGTAGC CACCAGAACT ATGGCAACCC GGTTCATGCC ACTAGTGTCA CTTATGTAGC CACCAAAAGT | | | | | | | | | | 160 170 180 190 200 GTTG -GTG GCTACAATGA TGACGCTAAT AAGCAACATG ATATTACTGG GTTG -GTG GCTACAATGA TGACGCTAAT AAGCAACATG ATATTACTGG GCTGCTGGTG GTTACAGTGA TGACATTAAT AAGCAACATG ATACCACCAA GTTG -GTG GCTACAATGA TGACGCTAAT AAGCAACATG ATATTACTGG GCTGCTGGTG GTTACAGTGA TGACATTAAT AAGCAACATG ATACCACCAA GTTG -GTG GCTACAATGA TGACGCTAAT AAGCAACATG ATATTACTCG | | | | | | | | | | 210 220 230 240 250 TGTCTATCCC GAAAAAGACA CCGGTAGACA TCATTTTGGT CGTGGTTACG TGTCTATCCC GAAAAAGACA CCGGTAGACA TCATTTTGGT CGTGGTTACG TGCCTA -C GGCGTAGACA CTGGTAGACA GCATTCTAGT GGTGGCTACG TGTCTATCCC GAAAAAGACA CCGGTAGACA TCATTTTGGT CGTGGTTACG TGCCTA -C GGCGTAGACA CTGGTAGACA GCATTCTAGT GGTGGCTACG TGTCTATCCC GAAAAAGACA CCGGTAGACA TCATTTTGGT CGTGGTTACG | | | | | | | | | | 260 270 280 290 300 ACGGTGACAC TAACAAGCAA CATGATGCTA CTGGTGTTTA TCCCGGAATA ACGGTGACAC TAACAAGCAA CATGATGCTA CTGGTGTTTA TCCCGGAATA ATGGTGACAC TAATAAGCA- -ACGGTGACAC TAACAAGCAA CATGATGCTA CTGGTGTTTA TCCCGGAATA ATGGTGACAC TAATAAACA- -ACGGTGACAC TAACAAGCAA CATGATGCTA CTGGTGTTTA TCCCGGAATA | | | | | | | | | | 310 320 330 340 350 GACATTGGTA GAGATCATGG GACTACCGGT GTTTATGGCC TAAACACCGA GACATTGGTA GAGATCATGG GACTACCGGT GTTTATGGCC TAAACACCGA TCATGG AATTACTGGT GGCTATAATG ATGACACCAA GACATTGGTA GAGATCATGG GACTACCGGT GTTTATGGCC TAAACACCGA TCATGG AACTACTGGT GGCTATAATG ATGACACCAA GACATTGGTA GAGATCATGG GACTACCGGT GTTTATGGCC TAAACACCGA | | | | | | | | | | 360 370 380 390 400 CAGACATCAT GGAAGTACTG GTGTCAATCC CGGGATAGAC ACCCATAACC CAGACATCAT GGAAGTACTG GTGTCAATCC CGGGATAGAC ACCCATAACC TAGACATCAT GGAACTACCG GTGTCTAT -GATATAGAC ACCGATAGGC CAGACATCAT GGGAGTACTG GTGTCAATCC CGGGATAGAC ACCCATAACC TAGACATCAT GGAACTACCG GTGTCTAT -GGTATAGAC ACCGATAGGC CAGACATCAT GGAAGTACTG GTGTCAATCC CGGGATAGAC ACCCATAACC | | | | | | | | | | VMK CB4 CucVang M103 MV1C V74 VMK CB4 CucVang M103 MV1C V74 VMK CB4 M103 CucVang MV1C V74 VMK CB4 CucVang M103 MV1C V74 VMK CB4 CucVang M103 MV1C V74 VMK CB4 CucVang M103 MV1C V74 VMK CB4 CucVang M103 MV1C V74 VMK CB4 CucVang M103 MV1C V74 410 420 430 440 450 AACAACATGG GACTACCGGT GGTTATGCTG GTGACACTGG AAGGCAGCAT AACAACATGG GACTACCGGT GGTTATGCTG GTGACACTGG AAGGCAGCAT AACAACATGG GACTACTGGT GGCTATGCCG GTGACACTGG TAGGCAACAT AACAACATGG GACTACCGGT GGTTATGCTG GTGACACTGG AAGGCAGCAT AACAACATGG GACTACTGGT GGCTATGCCG GTGACACTGG TAGGCAACAT AACAACATGG GACTACCGGT GGTTATGCTG GTGACACTGG AAGGCAGCAT | | | | | | | | | | 460 470 480 490 500 GGGAATACAG GTGGCCTTTA CTATGGAACC GACACCGCGG ACACAGGAGC GGGAATACCG GTGGCCTTTA CTATGGAACC GACACCGCGG ACACAGGAGC GGGAACATCG GTGGCCCTTA CTATGGAACC AACACCGCAG ACACCGGTAC GGGAATACAG GTGGCCTTTA CTATGGAACC GACACCGCGG ACACAGGAGC GGGAACATCG GTGGCCCTTA CTATGGAACC AACACCGCAG ACACCGGTAC GGGAATACAG GTGGCCTTTA CTATGGAACC GACACCGCGG ACACAGGACG | | | | | | | | | | 510 520 530 540 550 CGGTCCTAGA AGTGGAAACA CCGGTGGCAC CGGTTATGGA GGCACTGGTG CGGTCCTAGA AGTGGAAACA CCGGTGGCAC CGGTTATGGA GGCACTGGTG TGGTCCCAGA AGTGGAACCA CGGGCGGCAC CGGTTATGGA GGCACTGGTG CGGTTCTGGA AGTGGAAACA CCGGTGGCAC CGGTTATGGA GGCACTGGTG TGGTCCCAGA AGTGGAACCA CGGGCGGCAC CGGTTATGGA GGCACTGGTG GGGTGCTAGA AGTGGAAACA CCGGTGGCAC CGGTTATGGA GCCACTGGTG | | | | | | | | | | 560 570 580 590 600 GTACTGATTA TGGAACAGCT GGTGGCACTG GTTATGGAAG TGGAACTGGC GTACTGATTA TGGAACAGCT GGTGGCACTG GTTATGGAAG TGGAACTGGC GCACTGATTA TGGAACAACT GGTGGCACTG GTTATGGAAG TGGAACTGGG GTACTGATTA TGGAACAGCT GGTGGCACTG GTTATGGAAG TGGAACTGGC GCACTGATTA TGGAACAACT GGTGGCACTG GTTATGGAAG TGGAACTGGG GTACTGATTA TGGAACAGCT GGTGGCACTG GTTATGGAAG TGGAACTGGC | | | | | | | | | | 610 620 630 640 650 TATGGAATCA ACACTGGGGG TGCGCACACT GAAGCAGGGT ATGGGAAGGA TATGGAATCA ACACTGGGGG TGCGCACACT GAAGCAGGGT ATGGGAAGGA TATGGAGTCA ACACTGGGGG TGCGCACACT GAAGCAGGAT ATAGGAAGGA TATGGAATCA ACACTGGGGG TGCGCACACT GAAGCAGGGT ATGGGAAGGA TATGGAGTCA ACACTGGGGG TGCGCACACT GAAGCAGGAT ATAGGAAGGA TATGGAATCA ATACTGGGGG TGCGCACACT GAAGCAGGGT ATGGGAAGGA | | | | | | | | | | 660 670 680 690 700 GCATCGTCAG CATGAGCAAT CTCATGGTGG TCAGCACGAG AAGAAAGGGA GCATCGTCAG CATGAGCAAT CTCATGGTGG TCAGCACGAG AAGAAAGGGA ACATCGTCAG CATGACCAAT CTCATGGTGA TCAGAACGAG AAGAAAGGGA GCATCGTCAG CATGAGCAAT CTCATGGTGG TCAGCACGAG AAGAAAGGGA ACATCGTCAG CATGACCAAT CTCATGGTGA TCAAGACGAG GAGAAAGGGA GCATCGTCAG TATGAGCCAT CTCATGGTGG TCAGCACGAG AAGAAAGGGA | | | | | | | | | | 710 720 730 740 750 TACTAGACAA GATTAAGGAG AAGCTTCCTG GAGGACACAG TGACAAGTAG TACTAGACAA GATTAAGGAG AAGCTTCCTG GAGGACACAG TGACAAGTAG TTATGGACAA GATTAAGGAG AAACTTCCTG GAGGACACAG TGACAAGTAG TACTGGACAA GATTAAGGAG AAGCTTCCTG GAGGACACAG TGACAAGTAG TTATGGACAC GATTAAGGAG AAGCTTCCTG GAGGACACAG TCGGAAGTAG TACTGGACAA GATTAAGGAG AAGCTTCCTG GAGGACACAG TGACAAGTAG ATGC ATGC - Hình So sánh trình tự gien dehydrin giống đậu tơng VMK, CB4, M103, Cúc vàng, MV1C, V74 37 Đặc biệt, gien dehydrin giống đậu tơng VMK có 718 vị trí nucleotit giống với vị trí nucleotit giống đậu tơng V74 có 724 vị trí nucleotit giống với vị trí nucleotit giống đậu tơng M103 Giống đậu tơng CB4 cã 725 vÞ trÝ nucleotit gièng víi vÞ trÝ nucleotit giống đậu tơng M103 có 719 vị trí nucleotit giống với vị trí nucleotit giống đậu tơng V74 Kết xác định hệ số tơng đồng khoảng cách di truyền gien dehydrin giống đậu tơng VMK, CB4, M103, Cúc vàng, MV1C, V74 đợc thể bảng Khoảng cách di truyền Bảng Hệ số tơng đồng (ma trận tam giác trên) khoảng cách di truyền (ma trận tam giác dới) gien dehydrin giống đậu tơng Hệ số tơng đồng VMK CB4 CV M103 MV1C V74 VMK VMK 99,9 86,8 99,5 86,2 98,6 CB4 CB4 86,9 99,3 86,3 98,5 0,1 CV CV 14,9 14,7 86,0 98,4 85,6 M103 M103 0,6 0,7 15,3 85,9 98,5 MV1C MV1C 85,0 15,6 15,4 1,6 16,0 V74 V74 1,4 1,5 15,7 1,5 16,5 VMK CB4 CV M103 MV1C V74 B¶ng cho thÊy gien dehydrin cđa hai gièng VMK vµ CB4 cã độ tơng đồng 99,9% đạt mức độ tơng ®ång so víi gien dehydrin cđa hai gièng M103, V74 tõ 98,5 - 99,5%, cđa hai gièng Cóc Vµng, MV1C từ 86,2 - 86,8% Khoảng cách di truyền hai giống VMK CB4 0,1%, hai giống VMK vµ CB4 víi M103 vµ V74 tõ 0,6 - 1,5%, víi Cóc Vµng vµ MV1C tõ 14,7 -15,6% Mèi quan hệ di truyền giống đậu tơng sở phân tích gien dehydrin đợc thể sơ đồ hình hình VMK CB4 M103 V74 CucVang MV1C 7,9 Nucleotide substitutions (ì 100) Hình Sơ đồ hình mối quan hệ di truyền giống đậu tơng VMK, CB4, M103, Cúc Vàng, MV1C V74 So sánh tr×nh tù axit amin protein gien dehydrin m· hóa hai giống đậu tơng VMK CB4 với bốn giống đậu tơng M103, Cúc Vàng, MV1C V74 38 Kết so sánh trình tự axit amin protein gien dehydrin m· hãa cđa hai gièng ®Ëu tơng VMK CB4 với bốn giống đậu tơng M103, Cúc Vàng, MV1C V74 đợc thể hình VMK CB4 CucVang M103 MV1C V74 | | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 MASYQKHYDD QGRKVDEYGN VERQTDEYGN PVHATSVTYV ATKS-VGGYN MASYQKHYDD QGRKVDEYGN VERQTDEYGN PVHATSVTYV ATKS-VGGYN MASYQKHYDD QGRKVDEYGN VEKQTDEYGN PVHAASVTYV ATRTAAGGYS MASYQKHYDD QGRKVDEYGN VERQTDEYGN PVHATSVTYV ATKS-VGGYN MASYQKHYDD QGRKVDEYGN VEKQTDEYGN PVHAASVTYV ATRTAAGGYS MASYQKHYDD QGRKVDEYGN VERQTDEYGN PVHATSVTYV ATKS-VGGYN VMK CB4 CucVang M103 MV1C V74 | | | | | | | | | | 60 70 80 90 100 DDANKQHDIT GVYPEKDTGR HHFGRGYDGD TNKQHDBTGV YPGIDIGRDH DDANKQHDIT GVYPEKDTGR HHFGRGYDGD TNKQHDATGV YPGIDIGRDH DDINKQHDTT NAYG-VDTGR QHSSGGYDGD TNKHHGITGG YN-DDTNRHH DDANKQHDIT GVYPEKDTGR HHFGRGYDGD TNKQHDATGV YPGIDIGRDH DDINKQHDTT NAYG-VDTGR QHSSGGYDGD TNKHHGTTGG YN-DDTNRHH DDANKQHDIT RVYPEKDTGR HHFGRGYDGD TNKQHDATGB YPGIDIGRDH VMK CB4 CucVang M103 MV1C V74 | | | | | | | | | | 110 120 130 140 150 GTTGVYGLNT DRHHGSTGVN PGIDTHNQQH GTTGGYAGDT GRQHGNTGGL GTTGVYGLNT DRHHGSTGVN PGIDTHNQQH GTTGGYAGDT GRQHGNTGGL GTTGVYDIDT DR -QQH GTTGGYAGDT GRQHGNIGGP GTTGVYGLNT DRHHGSTGVN PGIDTHNQQH GTTGGYAGDT GRQHGNTGGL GTTGVYGIDT DR -QQH GTTGGYAGDT GRQHGNIGGP GTTGVYGLNT DRHHGSTGVN PGIDTHNQQH GTTGGYAGDT GRQHGNTGGL VMK CB4 CucVang M103 MV1C V74 | | | | | | | | | | 160 170 180 190 200 YYGTDTADTG AGPRSGNTGG TGYGGTGGTD YGTAGGTGYG SGTGYGINTG YYGTDTADTG AGPRSGNTGG TGYGGTGGTD YGTAGGTGYG SGTGYGINTG YYGTNTADTG TGPRSGTTGG TGYGGTGGTD YGTTGGTGYG SGTGYGVNTG YYGTDTADTG AGSGSGNTGG TGYGGTGGTD YGTAGGTGYG SGTGYGINTG YYGTNTADTG TGPRSGTTGG TGYGGTGGTD YGTTGGTGYG SGTGYGVNTG YYGTDTADTG RGARSGNTGG TGYGATGGTD YGTAGGTGYG SGTGYGINTG VMK CB4 CucVang M103 MV1C V74 | | | | | | | | 210 220 230 240 GAHTEAGYGK EHRQHEQSHG GQHEKKGILD KIKEKLPGGH SDK GAHTEAGYGK EHRQHEQSHG GQHEKKGILD KIKEKLPGGH SDK GAHTEAGYRK EHRQHDQSHG DQNEKKGIMD KIKEKLPGGH SDK GAHTEAGYGK EHRQHEQSHG GQHEKKGILD KIKEKLPGGH SDK GAHTEAGYRK EHRQHDQSHG DQDEEKGIMD TIKEKLPGGH SRK GAHTEAGYGK EHRQYEPSHG GQHEKKGILD KIKEKLPGGH SDK H×nh So sánh trình tự axit amin protein gien dehydrin hai giống đậu tơng VMK CB4 mà hóa với bốn giống đậu tơng M103, Cúc Vàng, MV1C, V74 Kết so sánh hình cho thấy, trình tự axit amin protein hai giống đậu tơng VMK CB4 khác vị trÝ axit amin cã thø tù 87 Protein cña hai giống VMK CB4 khác với Cúc Vàng MV1C ë 35 vÝ trÝ axit amin; gièng VMK kh¸c víi M103 vị trí axit amin, khác với V74 vị trí axit amin; CB4 khác với M103 vị trí axit amin, khác với V74 axit amin Hai giống đậu tơng VMK CB4 có độ tơng đồng cao so với M103 V74 (97,5 - 99,2%), tiếp đến với Cúc vàng MV1C (81,4 - 81,9%) VỊ hƯ sè kh¸c nhau, hai giống VMK CB4 có hệ số sai khác với M103 vµ V74 lµ 0,8 - 2,5% vµ víi Cóc Vàng MV1C 20,3 - 21,5% (bảng 4) 39 Bảng Hệ số khác Hệ số tơng đồng (ma trận tam giác trên) hệ số khác (ma trận tam giác dới) trình tự axit amin protein dehydrin giống đậu tơng VMK CB4 CV M103 MV1C V74 Hệ số tơng đồng trình tù axit amin VMK CB4 CV M103 MV1C 100,0 81,9 99,2 81,4 0,0 81,9 99,2 81,4 80,1 97,3 20,3 20,3 0,8 0,8 21,5 80,5 21,5 21,5 2,7 22,7 2,5 2,5 22,7 3,0 23,9 VMK CB4 CV M103 MV1C III KÕT LUậN Đánh giá khả chịu hạn giống đậu tơng địa phơng hai phơng diện sinh lý hoá sinh đà xác định đợc ba giống đậu tơng CB4, VMK, HL có khả chịu hạn tốt Các giống VMK, CB4, HL có số chịu hạn cao (10633,87; 7198,52; 6038,47), có hàm lợng prolin tăng mạnh tăng 200% (203,91; 208,28; 290,29) Đà khuếch đại đoạn gien m· ho¸ protein dehydrin (LEA D-11) víi kÝch th−íc 751 bp tõ ADN hƯ gien cđa gièng ®Ëu tơng địa phơng thực thành công tách dòng, xác định trình tự gien mà hoá dehydrin từ hai giống đậu tơng VMK CB4 có khả chịu hạn tốt Đà so sánh trình tự gien dehydrin giống đậu tơng VMK CB4 với 34 trình tự gien ngân hàng liệu gien quốc tế, đặc biệt so sánh với bốn giống đậu tơng M103, Cúc Vàng, MV1C, V74 đà cho thấy trình tự gien dehydrin trình tự axit amin protein giống đậu tơng có độ tơng đồng cao Trình tự gien dehydrin hai giống đậu tơng VMK CB4 có độ tơng đồng 99,9%, trình tù axit amin protein cđa hai gièng VMK vµ CB4 có độ tơng đồng gần 100% TàI LIệU THAM KH¶O Bates L S., 1973: Plant Soil, 39: 205-207 Lê Trần Bình, Lê Thị Muội, 1998: Phân lập gien chọn dòng chống chịu ngoại 40 V74 97,5 97,5 79,2 97,1 78,8 VMK CB4 CV M103 MV1C V74 V74 cảnh bất lợi lúa Nxb Đại học quốc gia, Hµ Néi Bray E A., 1997: Trendplant Sci, 2: 47-54 Close T J., 1996: Physiol Plant, 97: 795803 Curtis J., Shearer G., Kohl D H., 2004: Plant Physiol., 136(2): 3313-3318 Phạm Thị Trân Châu cs., 1999: Thực hành Hóa sinh học Nxb Giáo dục, Hà Nội Ngô Thế Dân cs., 1999: Cây đậu tơng Nxb Nông nghiệp Foolad M R et al., 1995: Tissue ADN organ culture: 281-298 Fundamental methods Springer verlag, Berlin, Heidelerg Nguyễn Huy Hoàng, 1992: Nghiên cứu khả chịu hạn giống đậu tơng nhập nội miền Bắc Việt Nam, Luận án phó tiến sü Sinh häc, Hµ Néi 10 Ngun Thu HiỊn vµ cs., 2005: Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc - Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống: 1224-1227 Đại học Y Hà Nội Nxb Khoa häc vµ Kü thuËt, Hµ Néi 11 Cao Xuân Hiếu cs., 2003: Tạp chí Công nghệ Sinh học, 1(2): 237-244 12 Trần Thị Phơng Liên, 1999: Nghiên cứu đặc tính hoá sinh sinh học phân tử số giống đậu tơng có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam Luận án tiến sỹ Sinh học,Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội 13 Maitra N and Cushman J C., 1994: Plant Physiol., 106: 805-806 14 Chu Hoàng Mậu cs., 2000: Tạp chí Khoa học Công nghệ, 1(13): 16-21 Đại học Thái Nguyên 15 Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thuý Hờng, 2006: Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, 94(2): 22-26 16 Porcel R., Azcon R., Ruiz-Lozano J M., 2005: J Exp Bot., 56(417): 1933-1942 17 Soulages J L et al., 2003: Plant Physiol., 131(3): 963-975 18 Http: //www.ncbi.nlm.nih.gov ASSESSMENT OF DROUGHT TOLERANT ABILITY AND CLONING OF THE ENCODING DEHYDRIN PROTEIN (LEA-D11) GIENE OF SOME MOUNTAIN LOCAL SOYBEAN CULTIVARS [GLYCINE MAX (L.) MERRILL] Chu Hoang Mau, Nguyen Thu Hien SUMMARY Soybean [Glycine max (L.) Merrill] is a cultivar which has not only highly economic and nutritious value but also degraded earth- improved ability The mountain local cultivars in the North of Vietnam are precious gene source because of preeminent quality and ability against the harm of environment In our work, the artificial method of making drought is used to estimate the drought tolerant ability of nine mountain local soybean cultivars by physiological and biochemical aspects Its result shows that there are four most drought tolerant soybean cultivars, which are CB4, VMK, QH and HL The CB4, VMK and HL have the highest drought tolerant index (corresponding to 10633.87, 7198.52 and 6038.47) and the strongest increase of 200% of proline content (corresponding to 203.91, 208.28, 246,90% and 290.29%) A 751 bp dehydrin gene fragment from DNA of genome of seven local soybean cultivars was amplified by PCR with primers MD1, MD2 and carried out successfully the cloning of giene and determine the giene arrangement encoding dehydrin protein of VMK and CB4 which have the most drought tolerant ability The nucleotide sequence of dehydrin gene of VMK and CB4 was compared with that of other 34 gene in GenBank, especially compared with that of four soybean cultivars (M103, CucVang, MV1C and V74) This shows that the dehydrin gene sequence and the amino acid sequence of these soybean cultivars have quite high homology The dehydrin gene sequence of the VMK and CB4 has the homology of 99.9%, the amino acid sequence of the VMK and CB4 has the homology of 100% Ngµy nhËn bµi: 18-6-2007 41 ... LUậN Đánh giá khả chịu hạn giống đậu tơng địa phơng hai phơng diện sinh lý hoá sinh đà xác định đợc ba giống đậu tơng CB4, VMK, HL có khả chịu hạn tốt Các giống VMK, CB4, HL có số chịu hạn cao... đa gien, để đánh giá cách xác khả chịu hạn giống đậu tơng cần phải tiến hành phân tích thêm tiêu sinh lý, hóa sinh liên quan đến tính chịu hạn giai đoạn đậu tơng non Kết nhân gien dehydrin từ giống. .. mang mà cDNA gien dehydrin nh giống đậu tơng nghiên cứu có gien dehydrin gien không chứa itron Để khẳng định điều này, đà tiến hành tách dòng xác định trình tự gien dehydrin hai giống đậu tơng địa