Đang tải... (xem toàn văn)
Dựa trên đặc điểm sinh hóa và phân tử của vi khuẩn Vibrio sp., ứng dụng phương pháp PCR với cặp mồi 16S-rRNA và giải trình tự gen rDNA 16S để xác định vi khuẩn Vibrio sp. Kết quả nghiên cứu cho thấy đã xác định được 2 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus và 2 chủng vi khuẩn là Vibrio vulnificus. Kết quả của chúng tôi cho thấy tiềm năng cao của phương pháp PCR để xác định nhanh và cung cấp thông tin về mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi khuẩn Vibrio ở tỉnh Thừa Thiên Huế.
Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Vol 128, No 1E, 39–46, 2019 pISSN 1859–1388 eISSN 2615–9678 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS GÂY BỆNH Ở CÁ Application of PCR-based method for detection of Vibrio parahaemolyticus in fish Huỳnh Văn Chương1, Đặng Thanh Long1, Hoàng Thị Kim Hồng2, Huỳnh Thị Lệ2 Nguyễn Văn Hiệp2, Hồng Thị Hồng Vân3, Phạm Trí Thuận4 Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế, Tỉnh lộ 10, Phú Vang, Thừa Thiên Huế, Việt Nam 2Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế, 77 Nguyễn Huệ, Huế, Việt Nam 3Trường Đại học Nông lâm, Đại học Huế, 102 Phùng Hưng, Huế, Việt Nam 4Trường Trung học sở trung học phổ thông Nguyễn Văn Cừ, Thôn 16, Bờ Ngoong, Chư Se, Gia Lai, Việt Nam * Tác giả liên hệ Huỳnh Văn Chương (Thư điện tử: hvanchuong@hueuni.edu.vn) (Ngày nhận bài: 29–8–2019; Ngày chấp nhận đăng: 23–10–2019) Tóm tắt Dựa đặc điểm sinh hóa phân tử vi khuẩn Vibrio sp., ứng dụng phương pháp PCR với cặp mồi 16S-rRNA giải trình tự gen rDNA 16S để xác định vi khuẩn Vibrio sp Kết nghiên cứu cho thấy xác định chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus chủng vi khuẩn Vibrio vulnificus Kết cho thấy tiềm cao phương pháp PCR để xác định nhanh cung cấp thông tin mối quan hệ di truyền chủng vi khuẩn Vibrio tỉnh Thừa Thiên Huế Từ khóa: Cá, gen rDNA 16S,Vibrio parahaemolyticus Abstract The application of the PCR method with primers 16S-rRNA and sequence analysis of the rDNA 16S gene for the detection of Vibrio sp.in fish is presented in this paper.The results show that two strains areVibrio parahaemolyticus, and two strains areVibrio vulnificus The PCR-based method is suitable for rapid identification and provides information on the genetic relationship of theVibriobacteria strains found inThua Thien Hue province Keywords: fish, rDNA 16S gene, Vibrio parahaemolyticus Đặt vấn đề Xuất huyết lở loét cá bệnh lây lan nhanh xuất nhiều nước giới.Bệnh gây thiệt hại lớn cho ngành nuôi trồng thủy sản Bệnh nhiều tác nhân gây ra, nguyên nhân nấm Aphanomyces invadans, virus, ký sinh trùng vi khuẩn Vi khuẩn gây bệnh lở loét cá xác định thuộc chi Aeromonas, Vibrio, Plesiomonas, Pseudomonas Loài A hydrophila A sobria thuộc chi Aeromonas xuất với tần suất lớn nhất, chi Vibrio Plesiomonas spp DOI: 10.26459/hueuni-jns.v128i1E.5398 39 Huỳnh Văn Chương CS Ở Việt Nam, bệnh vi khuẩn Vibrio sp gây cho cá nuôi kéo dài từ Bắc vào Nam, lây lan nhanh, đặc trưng nhiễm trùng huyết, xuất huyết tổn thương da, có nhiều chủng Vibrio parahaemolyticus mang độc lực cao, gây chết đến 30% đàn cá ni [1, 2] Theo khóa phân loại Bergey, V parahaemolyticus vi khuẩn gram âm, hình dấu phẩy, có tiêm mao đầu, di động, kỵ khí tùy tiện ưa môi trường kiềm mặn Chúng thường sống cửa sông ven biển hầu hết vùng giới Người ta phân lập chúng cát, bùn, nước biển, hải sản [3] V parahaemolyticus gây bệnh người thông qua tiêu thụ hải sản nấu chưa chín Tuy nhiên, khơng phải chủng V parahaemolyticus gây bệnh chúng mang gen độc tố khác Trong số đó, hemolysin độc tố phổ biến loài Vibrio gây bệnh Đây ngoại độc tố làm phân giải tế bào hồng cầu giải phóng hemoglobin Ở lồi V parahaemolyticus, có ba gen độc tố hemolysin bao gồm tdh trh mã hóa hemolysin bền nhiệt tlh mã hóa hemolysin không bền nhiệt.Hai gen tdh trh nằm operon độc tố Vp-toxRS, điều hòa gen toxR có trình tự bảo tồn cao lồi [4] Trong nghiên cứu này, số vi khuẩn Vibrio phân lập từ cá có biểu lở loét định danh phương pháp kỹ thuật phân tử, làm nguyên liệu để xác định số gen độc tố vi khuẩn Vật liệu phương pháp 2.1 Vật liệu Mẫu cá bị bệnh có biểu xuất huyết lở loét thu lồng ao nuôi ven biển Thừa Thiên Huế Hóa chất tách chiết DNA, số mơi trường vật liệu thường dùng phòng thí nghiệm Hóa chất: CTAB (Sigma, Mỹ), Sodium dodecyl sulfate 10% (Merck, Đức), lysozyme, PCI (phenol:chloroform:isoamyl alcohol), ethanol, hóa chất thực phản ứng PCR (DNA khuôn, mồi xuôi, mồi ngược, master mix, nước cất), hóa chất điện di (agarose, ethydium bromide, đệm TAE (1X)) Môi trường ChromoGelTM Vibrio agar, môi trường Alkaline Peptone Water (APW): 1% pepton, 1% NaCl, pH: 8,3–8,5 2.2 Phương pháp Thu xử lý mẫu, phân lập vi khuẩn môi trường ChromoGelTM Vibrio agar Mẫu cá mắc bệnh cho vào túi vô trùng bảo quản đá trước đưa phòng thí nghiệm Các vùng lở loét, nội tạng não cá đồng cối chày sứ pha với nước muối sinh lý thành huyền dịch chứa vi khẩn Sau pha lỗng dịch theo hệ số nhân 10 –1, 10–2, 10–3, 10–7, cấy dàn lên bề mặt môi trường ChromoGel TM Vibrio agar đĩa Petri Nuôi tủ ấm 37 °C 24 Chọn lọc khuẩn lạc có hình thái giống vi khuẩn V parahaemolyticus môi trường ChromoGelTMVibrio agar (khuẩn lạc hình tròn, bóng, có màu xanh) tăng sinh môi trường APW để thực nhuộm Gram với mục đích bước đầu xác định vi khuẩn V parahaemolyticus Các chủng vi khuẩn có hình thái giống với hình thái vi khuẩn V parahaemolyticus như: gram âm, hình que 40 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Vol 128, No 1E, 39–46, 2019 pISSN 1859–1388 eISSN 2615–9678 phẩy khuẩn, bắt màu thuốc nhuộm màu hồng tiến hành tạo dòng nuôi tăng sinh môi trường APW để tách chiết DNA tổng số Tách chiết DNA tổng số chủng vi khuẩn Các chủng vi khuẩn nuôi mơi trường APW, lắc 150 vòng/phút 18 Dịch ni cấy ly tâm 13.000 vòng/phút °C để thu tế bào DNA tổng số tách chiết theo phương pháp CTAB (cetyl trimethylammonium bromide): phá vỡ tế bào cách bổ sung 500µL CTAB, 30µL Sodium dodecyl sulfate 10%, 25µL lysozyme vào ống eppendorf chứa tế bào, votex, ủ nhiệt 70 °C 30 phút.Kết tủa DNA ethanol 100% bảo quản tủ lạnh –20 °C 60 phút Kết tủa DNA cách ly tâm 15.000 vòng/phút 10 phút rửa DNA lại lần ethanol 70% Sau đó, để khơ nhiệt độ phòng tái huyền phù DNA cách cho thêm vào 50 µL Tris- Ethylene diamine tetraacetic acid DNA tổng số điện di kiểm tra agarose gel 1,5% Định danh chủng vi khuẩn phương pháp sinh học phân tử DNA tổng số sử dụng làm khuôn để tiến hành định danh kỹ thuật phân tử dựa tương đồng gen rDNA 16S với cặp mồi 16S-rRNA: F: 5’-CGTGCCAGCAGCCGCGGTAA-3’, R: 5’GCCCGGGAACGTATTCACCG-3’ [5].Thành phần phản ứng gồm 50 ng DNA tổng số, 10 pmol mồi xuôi, 10 pmol mồi ngược, µL đệm PCR (10X), 20 µL Master Mix 2X bổ sung nước cất vô trùng cho đủ thể tích 50 µL Thực chu trình nhiệt: 95 °C/5 phút; tiếp đến 30 chu kỳ: 95 °C/45 giây, 57 °C/30 giây, 72 °C/1 phút; cuối 72 °C/7 phút Sản phẩm PCR điện di kiểm tra agarose gel 1,5% nhuộm ethydiumbromide (EtBr 0,5 µg/L) quan sát hình ảnh điện di ánh sáng tử ngoại hệ thống Gel Documentation (BioRad) Giải phân tích trình tự Sản phẩm PCR sau kiểm tra tinh KIT Isolate II PCR and Gel (BioLine) theo hướng dẫn nhà sản xuất sử dụng làm khuôn trực tiếp cho phản ứng tiền giải trình tự gen theo nguyên tắc dye-labelled dideoxy terminator Các chủng vi khuẩn định danh phương pháp sinh học phân tử với cặp mồi 16S-rRNA Mức độ tương đồng đoạn gen rDNA 16S chủng nghiên cứu so sánh với trình tự Nucleotide đoạn rDNA 16S chủng vi khuẩn khác đăng ký ngân hàng gen cách BLAST (Basic Local Alighment Search Tool) GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) xây dựng phát sinh phần mềm Mega Kết thảo luận 3.1 Phân lập vi khuẩn môi trường ChromoGel TM Vibrio Agar Tiến hành phân lập vi khuẩn Vibrio sp mơi trường ChromoGelTMVibrio agar (Hình 1)đối với mẫu cá có biểu xuất huyết lở loét Kết cho thấy khuẩn lạc mọc lên môi trường DOI: 10.26459/hueuni-jns.v128i1E.5398 41 Huỳnh Văn Chương CS ChromoGelTMVibrio agar có loại màu sắc khác như: khuẩn lạc màu hồng đỏ đại diện cho V cholerae, màu trắng vàng đại diện cho V Alginolyticus màu xanh đậm đại diện cho V parahaemolyticus Dựa sở chúng tơi thu 25 khuẩn lạc có đặc điểm giống với vi khuẩn V parahaemolyticus khuẩn lạc màu xanh đậm, tròn bóng Từ 25 chủng vi khuẩn thu đó, tiến hành nhuộm Gram quan sát kính hiển vi để bước đầu sàng lọc chọn vi khuẩn có khả cao vi khuẩn V parahaemolyticus Hình 1.Hình thái khuẩn lạc phân lập môi trường ChromoGel TMVibrio agar 3.2 Nhuộm Gram vi khuẩn Các khuẩn lạc chọn tiến hành nhuộm Gram để xác định hình thái, kích thước số đặc điểm để xác định vi khuẩn V parahaemolyticus Kết quan sát kính hiển vi (Hình 2) cho thấy hình thái chủng vi khuẩn thu có đặc điểm như: hình que phẩy khuẩn gram (–), đứng riêng lẻ, bắt màu hồng Qua kết nhuộm gram từ 25 chủng vi khuẩn ban đầu xác định chủng vi khuẩn có khả bắt màu đặc trưng vi khuẩn gram (–) nhuộm với đặc điểm hình que, đứng riêng lẻ, bắt màu hồng Tiến hành tạo dòng chủng thu để tiếp tục tách chiết DNA tổng số Hình2.Ảnh nhuộm gram chủng vi khuẩn quan sát kính hiển vi (40×) 42 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Vol 128, No 1E, 39–46, 2019 3.3 pISSN 1859–1388 eISSN 2615–9678 Tạo dòng chủng vi khuẩn môi trường ChromoGelTMVibrio agar Sau ba lần cấy chuyền liên tiếp môi trường ChromoGel TMVibrio agar, chúng tơi thu dòng chủng vi khuẩn dự đoán V parahaemolyticus Các chủng vi khuẩn sau tạo dòng tiến hành tăng sinh ống nghiệm chứa mL dung dịch APW nuôi 37 °C lắc 150 vòng/phút Kết cho thấy chủng vi khuẩn cho sinh khối tốt (Hình 3).Tiến hành thu sinh khối tách chiết DNA tổng số 3.4 Tách DNA tổng số DNA tổng số tách chiết từ chủng vi khuẩn, mẫu hòa tan 50L TE Chất lượng DNA tổng số kiểm tra điện di diagarose gel 1,5% Trong chủng vi khuẩn phân lập (Hình 4) có chủng vi khuẩn (Vp1.1, Vp1.2, Vp1.3, Vp1.4) DNA tổng số sau tách chiết không bị đứt gãy, có nồng độ cao Các chủng lại (Vp1.5, Vp1.6) DNA sau tách chiết thu nồng độ thấp so với chủng Vp1.1,2,3,4 Nguyên nhân q trình tách chiết DNA, sinh khối tế bào thấp dẫn đến nồng độ DNA chưa cao Từ chúng tơi chọn chủng Vp1.1, Vp1.2, Vp1.3, Vp1.4 để thực PCR định danh vi khuẩn Hình Kết phân lập chủng vi khuẩn mơi trường ChromoGel TM Vibrio agar Chú thích: 1, 2, 3, 4, 5, 6: tương ứng với chủng Vp1.1, Vp1.2, Vp1.3, Vp1.4, Vp1.5, Vp1.6 mẫu cá phân lập Hình 4.Kết tách chiết DNA tổng số chủng vi khuẩn sau phân lập Chú thích: 1, 2, 3, 4, 5, 6: tương ứng với chủng Vp1.1, Vp1.2, Vp1.3, Vp1.4, Vp1.5, Vp1.6 mẫu cá phân lập DOI: 10.26459/hueuni-jns.v128i1E.5398 43 Huỳnh Văn Chương CS 3.5 Định danh vi khuẩn kỹ thuật PCR Vi khuẩn có băng DNA khuếch đại với kích thước gen nằm khoảng 800–900 bp Băng DNA rõ chứng tỏ tính đặc hiệu cao (Hình 5).Sau có kết PCR với cặp mồi 16S-rRNA chúng tơi tiến hành tinh sản phẩm kit PCR clean up system (Promega) theo hướng dẫn nhà sản xuất sử dụng làm khuôn trực tiếp cho phản ứng tiền giải trình tự theo nguyên tắc dye-labelled dideoxy terminator định danh với cặp mồi 16S-rRNA 3.6 Giải trình tự gen xây dựng phả hệ Các chủng vi khuẩn phân lập môi trường ChromoGel TMVibrio agar, nhuộm Gram đồng thời định danh kỹ thuật sinh học phân tử dựa việc giải trình tự gen rDNA 16S Sản phẩm PCR với cặp mồi nhận biết đoạn gen có kích thước khoảng 878 bp rDNA 16S (Hình 5) tinh giải trình tự Nucleotide Kết giải trình tự chủng Vp1.1, Vp1.2, Vp1.3, Vp1.4 khơng trình bày 3.7 Định danh lồi xây dựng phả hệ Trình tự nucleotide đoạn gen rDNA 16Scủa chủng Vp1.1, Vp1.2, Vp1.3, Vp1.4 so sánh với liệu ngân hàng GenBank cho kết sau: Trình tự nucleotide chủng Vp1.1 tương đồng cao với trình tự nucleotide chủng Vibrio Vibrio sp (mã số: MH997742.1), Vibrio sp (mã số: LC420075.1), Vibrio parahaemolyticus (mã số: MG 386391.1), Vibrio harveyi (mã số: KF607036.1) (Hình 6) Do đó, chủng Vp1.1 đặt tên Vibrio parahaemolyticus 1.1 Hình 5.Kết chạy PCR chủng vi khuẩn với cặp mồi 16S-Rrna Chú thích: M thang chuẩn khối lượng (100–1000 bp); 1,2,3,4: số thứ tự chủng tương ứng Vp1.1, Vp1.2, Vp1.3, Vp1.4 Hình6.Cây phả hệ di truyền chủng Vp1.1 so với số chủng Vibrio spp.trên ngân hàng GenBank 44 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Vol 128, No 1E, 39–46, 2019 pISSN 1859–1388 eISSN 2615–9678 Tương tự, trình tự nucleotide chủng Vp1.2 tương đồng cao với trình tự nucleotide chủng Vibrio Vibrio sp (mã số: MH997742.1), Vibrio sp (mã số: LC420075.1), Vibrio parahaemolyticus (mã số: MG 386391.1), Vibrio harveyi (mã số: KF607036.1) (Hình 7) Do đó, chủng Vp1.2 đặt tên Vibrio parahaemolyticus 1.2 Tương tự, tiến hành so sánh kết trình tự nucleotide hai chủng lại chủng Vp1.3, Vp1.4 với liệu ngân hàng GenBank Kết cho thấy chủng Vp1.3, Vp1.4 có mức độ tương đồng cao với chủng Vibrio vulnificus (mã số: CP037931.1), V vulnificus (mã số: C(718)(X76334.1)), Vibrio vulnificus (mã số: CP037932.1), Vibrio mediterranei (mã số: HF541930.1), Vibrio aestuarianus (mã số: GQ372983.1) (Hình Hình 9) Do đó, chủng Vp1.3, Vp1.4 đặt tên Vibrio vulnificus 1.3 Vibrio vulnificus 1.4 Hình7.Cây phả hệ di truyền chủng Vp1.2 so với số chủng Vibrio spptrên ngân hàng GenBank Hình 8.Cây phả hệ di truyền chủng Vp1.3 so với số chủng Vibrio spptrên ngân hàng GenBank Hình9.Cây phả hệ di truyền chủng Vp1.4 so với số chủng Vibrio spp ngân hàng GenBank DOI: 10.26459/hueuni-jns.v128i1E.5398 45 Huỳnh Văn Chương CS Kết luận Mẫu cá mắc bệnh có biểu sung huyết, xuất huyết lở loét thu lồng ao nuôi phân lập môi trường chọn lọc ChromoGel TMVibrio agar cho khuẩn lạc màu xanh đậm, tròn bóng Khuếch đại vùng gen rDNA 16S có kích thước khoảng 878 bp.Gen sau giải trình tự so sánh với trình tự gen cơng bố ngân hàng GenBank có mức độ tương đồng 98– 100% Từ xác định chủng vi khuẩn phân lập Vibrio parahaemolyticus 1.1 và1.2 chủng Vibrio vulnificus 1.3 và1.4 Chúng sở khoa học cho nghiên cứu liên quan đến số độc tố vi khuẩn Lời cảm ơn Nghiên cứu thực kinh phí đề tài thuộc chương trình Cấp mã số CT-2018DHH-03 Tài liệu tham khảo Đỗ Thị Hòa, Trần Vỹ Hích, Nguyễn Thị Thùy Giang, Phan Văn Út, Nguyễn Thị Nguyệt Huệ Các loại bệnh thường gặp cá biển nuôi Khánh Hòa Tạp chí Khoa học, Cơng nghệ Thủy sản 2008;20(2): 16–24 Bùi Quang Tề Bệnh cá mú nuôi lồng vịnh Hạ Long Báo cáo hội nghị Ni Trồng Thủy sản tồn quốc Westh T, Wassenaar T M, Hallin PF, Snipen L, Lagesen K, Ussery DW On the origins of a Vibrio species Microb Ecol 2010; 59: 1–13 Nishibuchi M, Kaper JB Thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus: a virulence gene acquired by a marine bacterium.Infect Immun.1995; 63(6): 2093–2099 Đặng Thị Lụa, Nguyễn Viết Khuê, Phan Thị Vân Non – Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) tơm ni Tạp chí Khoa học nơng nghiệp Việt Nam.2016; 14 (5): 690–698 46 ... này, số vi khuẩn Vibrio phân lập từ cá có biểu lở loét định danh phương pháp kỹ thuật phân tử, làm nguyên liệu để xác định số gen độc tố vi khuẩn Vật liệu phương pháp 2.1 Vật liệu Mẫu cá bị bệnh. .. vi khuẩn có khả cao vi khuẩn V parahaemolyticus Hình 1.Hình thái khuẩn lạc phân lập mơi trường ChromoGel TMVibrio agar 3.2 Nhuộm Gram vi khuẩn Các khuẩn lạc chọn tiến hành nhuộm Gram để xác định. .. chủng Vibrio Vibrio sp (mã số: MH997742.1), Vibrio sp (mã số: LC420075.1), Vibrio parahaemolyticus (mã số: MG 386391.1), Vibrio harveyi (mã số: KF607036.1) (Hình 6) Do đó, chủng Vp1.1 đặt tên Vibrio