TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ====== NGUYỄN THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC BERBERIN CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Người hướng dẫn khoa học TS NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC HÀ NỘI, 2017 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn trân thành sâu sắc tới cô: TS Nguyễn Thị Bích Ngọc, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, người hướng dẫn, giúp đỡ tơi tận tình suốt thời gian làm khóa luận vừa qua Tơi xin trân thành cảm ơn tập thể thầy, cô giáo Viện NCKH Ứng dụng Bộ môn Sinh lý người động vật chị học viên cao học cho nhiều lời khuyên tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình làm thực nghiệm môn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tồn thầy, giáo cán nhân viên Trường Đại học Sư phạm Hà Nội - người dạy bảo giúp đỡ suốt năm học Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, người thân, bạn bè, người bên tôi, chia sẻ, động viên, giúp đỡ tơi lúc gặp nhiều khó khăn Do bước đầu làm quen với công việc nghiên cứu khoa học hạn chế kiến thức kinh nghiệm nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót xảy Tơi mong góp ý q thầy để khóa luận hồn chỉnh Tôi xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2017 SINH VIÊN Nguyễn Thị Lan Anh LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan viết luận văn nghiên cứu riêng tơi, số liệu, kết khóa luận thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, khơng trùng lặp với cơng trình nghiên cứu khác Những kết quả, số liệu khóa luận thực Viện NCKH Ứng dụng Trường Đại Học Sư phạm Hà Nội Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2017 SINH VIÊN Nguyễn Thị Lan Anh MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu 3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu 3.2 Phạm vi nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa đề tài 5.1 Ý nghĩa khoa học 5.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu cellulose vi khuẩn (CVK) 1.1.1 Vi khuẩn sản sinh CVK 1.1.2 Nguyên liệu để nuôi A xylinum nhằm thu màng CVK 1.1.3 Môi trường nghiên cứu tạo màng CVK từ nước vo gạo 1.1.4 Đặc điểm ứng dụng CVK 1.1.4.1 Cấu trúc CVK 1.1.4.2 Đặc tính CVK 1.1.4.3 Ứng dụng CVK 1.2 Giới thiệu thuốc berberin 1.2.1 Cấu trúc công thức cấu tạo 1.2.2 Tính chất 10 1.2.3 Tác dụng thuốc 10 1.2.4 Chỉ định chống định berberin 11 1.3 Tình hình nghiên cứu nước 11 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 11 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 12 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .14 2.1 Vật liệu nghiên cứu .14 2.1.1 Giống vi khuẩn 14 2.1.2 Nguyên liệu hóa chất 14 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu .14 2.2.1 Phương pháp lên men thu màng CVK từ môi trường nước vo gạo 14 2.2.2 Phương pháp xử lý màng CVK trước hấp thụ thuốc 15 2.2.3.Phương pháp đánh giá độ tinh khiết màng CVK 17 2.2.4 Phương pháp xác định đường chuẩn .17 2.2.5 Phương pháp xác định lượng thuốc hấp thụ qua màng CVK 19 2.2.6 Phương pháp xử lý thống kê 20 2.3 Địa điểm tiến hành nghiên cứu .20 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .21 3.1 Thu màng CVK .21 3.1.1 Màng CVK thu nuôi cấy môi trường nước vo gạo 21 3.1.2 Thu màng CVK thô sau nuôi cấy .22 3.1.3.Tinh chế màng CVK 23 3.1.4 Kiểm tra độ tinh khiết màng CVK 26 3.2 Màng CVK hấp thụ thuốc berberin .28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt A xylinum Tên đầy đủ Acetobacter xylinum CVK Cellulose vi khuẩn C Nồng độ E coli Escherichia coli h Giờ OD Optical Density PC Plant cellulose DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Ứng dụng CVK Bảng 2.1: Môi trường tạo màng CVK 15 Bảng 2.2: Nồng độ berberin giá trị OD (n = 3) 18 Bảng 3.1: Giá trị trung bình OD dung dịch berberin 10% ngâm màng CVK (n=3) 29 Bảng 3.2: Lượng thuốc hấp thụ berberin qua màng CVK (n=3) 30 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo berberin Hình 2.1: Sơ đồ quy trình ni cấy thu nhận CVK 16 Hình 2.2: Biểu đồ biểu diễn đường chuẩn berberin .18 Hình 3.1: Màng CVK ni cấy tĩnh sau ngày 21 Hình 3.2: Màng CVK độ dày khác 23 Hình 3.3: Màng CVK thơ 24 Hình 3.4: Màng CVK thơ ngâm NaOH 3% .24 Hình 3.5: Màng CVK ngâm HCl 3% 25 Hình 3.6: Màng CVK ngâm nước cất hai lần 48h 25 Hình 3.7: Màng CVK sau tinh chế 26 Hình 3.8: Kết thử diện đường glucose .27 Hình 3.9: Màng CVK hấp thụ dung dịch thuốc berberin 10% 28 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Berberin thường có rễ, thân rễ, thân, vỏ thuộc chi Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis Berberin có nhiều thân rễ vàng đắng với tỉ lệ 1.5 - 3%, berberin chiếm 82% so với alcaloid tồn phần.Tác dụng berberin chống loại vi khuẩn, ký sinh trùng đường ruột gây hại cho thể mà không ảnh hưởng tới hoạt động vi sinh vật có lợi đường tiêu hóa Berberin bào chế thành thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ yếu tố kích ứng từ môi trường đau mắt hột gây nên Berberin có khả ngăn ngừa lây lan nấm, bột nhiễm nấm, chống lại tác hại vi khuẩn tả, E coli Khi dùng kết hợp với kháng sinh berberin có khả hạn chế lại tác dụng không mong muốn loại kháng sinh diệt hệ vi sinh vật có lợi hệ tiêu hóa Tuy nhiên, berberin có sinh khả dụng thấp, q trình sử dụng bị tác nhân khác gây ảnh hưởng làm giảm hiệu hấp thụ khả hòa tan nước berberin nhược điểm hạn chế phát triển ứng dụng berberin Cụ thể làm chậm khả hấp thụ thuốc đưa vào điều trị bệnh Do đó, cần thiết để thiết kế loại màng giúp thuốc hấp thụ cách nhanh chóng tăng khả điều trị bệnh berberin [11] Màng CVK hình thành số vi khuẩn tự nhiên Khi nuôi cấy vi khuẩn môi trường chứa glucose, glycerol số nguồn cacbon hữu khác chúng có khả hình thành bề mặt lớp màng cellulose sinh học khiết gọi màng sinh học CVK [10] Cellulose vi khuẩn (CVK) sản phẩm loài vi khuẩn, tạo thành từ Acetobacter xylinum CVK có cấu trúc hóa học đặc tính giống cellulose thực vật ( gồm phân tử glucose liên kết với liên kết β – 1,4 glucorit), cellulose vi khuẩn có số tính chất hóa lý đặc biệt khác với cellulose thực vật như: độ bền học, khả thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả phục hồi độ ẩm ban đầu, Có tính chất hóa lý đặc biệt cellulose vi khuẩn không chứa hợp chất cao phân tử ligin, hemicellulose, peptin sáp nến.Vì vậy, CVK ứng dụng nhiều lĩnh vực như: công nghiệp giấy, thực phẩm, mỹ phẩm, công nghiệp dệt, y học,… đáng ý kiểm soát hệ thống vận chuyển thuốc như: Almeida, IF., et al [14] sử dụng màng CVK hệ thống phân phối thuốc Hay Amin et al [15] báo cáo việc sử dụng màng CVK làm màng bọc cho paracetamol cách sử dụng kỹ thuật phun phủ Kết cho thấy màng CVK giúp cho thuốc giải phóng cách kéo dài làm tăng hiệu sử dụng thuốc Gần hơn, Huang et al [21] nghiên cứu việc sử dụng màng CVK cho việc kiểm soát in vitro berberine Ngồi ra, màng CVK dùng làm chất màng đặc biệt cho sợi pin tế bào lượng (Brown,1989), làm sợi truyền quang, môi trường chất sinh học sử dụng để cố định protein hay cho sắc kí Trong lĩnh vực mỹ phẩm màng CVK sử dụng làm mặt nạ dưỡng da Ở Việt Nam, việc nghiên cứu ứng dụng màng CVK quan tâm đạt thành tựu định Trường Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh nghiên cứu sử dụng màng CVK làm màng trị bỏng thử nghiệm thỏ Kết cho thấy màng CVK giúp vết thương mau lành ngăn không cho Bước 1: Màng CVK sau tách từ môi trường nuôi cấy rửa với nước, thể hình 3.3 Hình 3.3: Màng CVK thô Bước 2: Ngâm vào dung dịch NaOH 3%, sau 48 dung dịch có màu nâu, thể hình 3.4 Hình 3.4: Màng CVK thơ ngâm NaOH 3% Bước 3: Ngâm HCl 3%, sau 48 thu màng CVK có màu trắng ngà, thể hình 3.5 Hình 3.5: Màng CVK ngâm HCl 3% Bước 4: Ngâm màng CVK vào nước 48h để trung hòa hết acid, thể hình 3.6 Hình 3.6: Màng CVK ngâm nước cất hai lần 48h Thu màng CVK tinh chế có màu trắng sáng, thể hình 3.7 Hình 3.7: Màng CVK sau tinh chế Nhận xét: Từ hình 3.7 ta thấy, màng CVK sau tnh chế có màu trắng trong, khơng tạp chất 3.1.4 Kiểm tra độ tnh khiết màng CVK  Mục đích: kiểm tra diện đường glucose nồng độ cao môi trường nuôi cấy  Nguyên tắc: dùng thuốc thử Fehling pha để phát diện đường D - glucose, có xuất kết tủa màu nâu đỏ  Tiến hành: + Mẫu thử: dịch thử màng CVK loại sau xử lý hoá học + Mẫu đối chứng: H2O dung dịch D - glucose + Cho vào ống nghiệm chứa mẫu thử ống nghiệm 1ml thuốc thử Fehling Đun cách thuỷ 10 phút + Quan sát kết tủa xuất ống nghiệm + Kết quả: không phát glucose diện màng thể hình 3.8 Hình 3.8: Kết thử diện đường glucose Mẫu 1: Màng 0.3cm Mẫu 2: Màng 0.5cm Mẫu 3: Màng 0.7cm 3.2 Màng CVK hấp thụ thuốc berberin Màng CVK sau tinh chế loại bỏ 70% nước tiến hành thí nghiệm hấp thụ thuốc Sau cho vào máy lắc 180 vòng/phút ( thể hình 3.9), sau 0.5h, 1h, 1.5h 2h lấy mẫu đo quang phổ để xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng Sử dụng hệ thống quang phổ tử ngoại khả biến (máy UVVis) để đo lượng thuốc berberin hấp thụ vào màng thời điểm 0.5h, 1h, 1.5h 2h Sau đo ta tính giá trị OD trung bình dung dịch berberin 10% Hình 3.9: Màng CVK hấp thụ dung dịch thuốc berberin 10% Kết thể bảng 3.1 Bảng 3.1: Giá trị trung bình OD dung dịch berberin 10% ngâm màng CVK (n=3) Độ dày màng (cm) Thời gian hấp thụ (h) Giá trị OD345nm 0.3 0.5 0.688 ± 0.003 0.685 ± 0.002 1.5 0.664 ± 0.004 0.664 ± 0.004 0.5 0.686 ± 0.002 0.681 ± 0.003 1.5 0.677 ± 0.004 0.677 ± 0.004 0.5 0.710 ± 0.002 0.702 ± 0.004 1.5 0.697 ± 0.003 0.697 ± 0.003 0.5 0.7 Qua bảng 3.1 ta nhận thấy: Khi màng CVK hấp thụ thuốc, giá trị OD (y) trung bình thuốc berberin màng CVK có độ dày 0.3cm, 0.5cm 0.7cm có giá trị OD giảm dần sau không đổi màng Có thể sau khoảng thời gian 0.5h, 1h, 1.5h, 2h lượng thuốc berberin hấp thụ vào màng CVK tăng dần đạt cực đại 2h Sau xác định giá trị OD345nm lớn 2h, tơi tính lượng thuốc berberin hấp thụ nhờ phương trình đường chuẩn (1) phần trăm tốc độ hấp thụ thuốc berberin qua màng CVK Kết thể bảng 3.2 Bảng 3.2: Lượng thuốc hấp thụ berberin qua màng CVK (n=3) Độ Thời gian Khối lượng Thể tích Cường độ hấp dày hấp thụ thuốc màng thụ màng màng cực đại hấp thụ (mg) (cm3) (mg/ cm3) 0.7 0.605 ± 0.002 8.792 0.069± 0.006 6.049± 0.008 0.5 0.877± 0.004 6.28 0.140± 0.005 8.774± 0.007 0.3 1.054± 0.003 3.768 0.280± 0.003 10.545± 0.003 EE (%) Nhận xét: Từ bảng 3.2, ta thấy cường độ hấp thụ thuốc berberin qua màng CVK có:  Độ dày 0.3cm cao so với cường độ hấp thụ thuốc berberin qua màng CVK có độ dày 0.5cm, 0.7cm  Độ dày 0.5cm cao so với cường độ hấp thụ thuốc berberin qua màng CVK có độ dày 0.7cm Như vậy, màng CVK mỏng cường độ hấp thụ lớn Xử lý thống kê việc kiểm định giả thuyết t - Test: Two Sample Assuming Unequal Variancess, kết khơng có khác biệt khả hấp thụ khoảng thời gian khác (1.5h 2h) với màng 0.3cm, P = 0.000012 (T < = t) one - tail < 0.05 Nên giá trị khối lượng thuốc hấp thụ khoảng thời gian khác có ý nghĩa thống kê Tương tự tiến hành kiểm định với :  Màng 0.5cm P = 0.000026 (T < = t) two - tail < 0.05  Màng 0.7cm P = 0.000051 (T < = t) two - tail < 0.05 Nên giá trị khối lượng thuốc hấp thụ khoảng thời gian khác có ý nghĩa thống kê KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau nghiên cứu đề tài, thu số kết sau:  Tạo màng CVK từ vi khuẩn A xylinum môi trường nước vo gạo  Thu màng CVK có độ dày 0.3cm, 0.5cm 0.7cm để tiến hành hấp thụ Màng CVK thu tinh khiết, độ thoáng cao, phù hợp với nhu cầu làm thí nghiệm  Kiểm tra khả cho thuốc berberin hấp thụ qua màng CVK: Sử dụng màng CVK để hấp thụ thuốc, màng CVK có độ dày 0.3cm hấp thụ thuốc nhanh màng CVK có độ dày 0.5cm 0.7cm khoảng thời gian từ 0.5h – 2h Kiến nghị  Tiếp tục nghiên cứu khả hấp thụ thuốc berberin màng CVK từ chủng A xylinum, thay môi trường nước vo gạo môi trường khác nước dừa già, rỉ đường, dịch hoa quả, …để mở rộng nguồn tài nguyên  Tiếp tục nghiên cứu khả hấp thụ loại thuốc khác màng CVK nhằm tăng tác dụng loại thuốc TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Bộ môn Dược liệu ( 1998), Bài giảng dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội, tập 2, trang 89 - 91 Bộ Y tế ( 1994), Dược điển Việt Nam III, Nhà Xuất Bản Y học Hà Nội, trang 33-35, 178-179, phụ lục 3 Đinh Thị Kim Nhung (1996), Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Acetobacter ứng dụng chúng lên men axetic theo phương pháp chìm, Luận án phó tiến sỹ khoa học sinh học Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh (2012), “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng bacterial cellulose ứng dụng điều trị bỏng” Tạp trí khoa học công nghệ 50 (4), 453 462 Hồ Đắc Trinh, Viện dược liệu, Chiết berberin clorid vàng đắng dung dịch acid sulfuric lỗng, Tạp chí Dược học, 1983 – Bộ Y tế xuất bản, tr 19 Hồ Đắc Trinh, Viện dược liệu, Chiết berberin clorid vàng đắng dung dịch axit sufuric loãng, Tạp chí dược học, 1983 - Bộ Y tế xuất bản, tr.19 Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh, Nghiên cứu đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng Tạp chí Dược học số 361/2006 trang 18 - 20 Nguyễn Liêm – Chiết xuất Berberine áp lực nóng – Tạp chí Dược học, 1980, Bộ Y tế xuất bản, tr.10 Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Phương pháp nghiên cứu sinh lý học Thực vật – Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 10 Nguyễn Văn Thanh, Huỳnh Thị Ngọc Lan Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum, ĐH y dược năm 2006 11 Phạm Thị Hiền (2016), Nghiên cứu vận tải phân phối thuốc berberin màng bacterial cellilose lên men từ nước vo gạo định hướng sử dụng qua đường uống 12 Phan Quốc Kinh - Nghiên cứu Alcaloid chiết xuất từ thuốc Việt Nam – ĐH Dược khoa Hà Nội, 1971, tr 10, tr 42 13.Trần Công Khánh - Cây vàng đắng – Tạp chí Dược học – số – 1983, BYT xuất bản, tr Tài liệu tiếng anh 14 Almeida I.F et al (2014), “Bacterial cellulose membranes as drug delivery systems: An in vivo skin compatibility study”, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 86(3), 332 - 336 15 Amin MCIM, Ahmad N, et al.(2012), “Bacterial cellulose film coating as drug delivery system: physicochemical, thermal and drug release properties”, Sain Malaysiana, 41(5), 561 - 16 Bworm E “Bacterial cellulose Thermoplastic polymer namocomposites”, Master of university, 2007 sciencein chaemical engineering, washington state 17 Dieter klemm, Dieter Schumann, Ulrike Udhardt, Silvia Marsch, Bacterial synthesized cellulose – artficial blood vessels for microsurgery Vol 26, Inssue 9, Progress in polymer science, 2001, p 1561 – 1603 18 Hai - Peng Cheng, Pei - Ming - Wang, Jech - Wei Chen And Wen - Teng Wu (2012), “Cultivation of Acetobacter xylinum for bacterial cellulose production in a modifed airlif reactor”, Biotechnol Appl Biochem, (35), 125 - 132 19 Jun Yin, Huili Xing, and Jianping Ye, Eficacy of Berberine in Patients with Type Diabetes, May 2009 20 Jun Yin, Jianping Ye, Weiping Jia Efects and mechanisms of Berberine in diabetes treatment, August 2012 21 Lin Huang, Xiuli Chen, Thanh Nguyen Xuan, Huiru Tang, Liming Zhang and Guang Yang Nano-cellulose 3D - networks as controlled - release drugcariers năm 2013 22 Martndal 34 ( 2005 ), volum II, p.1659 23 Ryan Bradley, ND, MPH and Bill Walter, ND, Berberine in Diabetes, April 2012 24 Trovatti E et al (2012), “Bacterial cellulose membranes applied in topical and transdermal delivery of lidocaine hydrochloride and ibuprofen: in vitro diffusion studies”, Int J Pharm, 435 (1), 83 – 87 25 White, K K., et al "Changes in equine carpal joint synovial fluid in response to the injection of two local anesthetic agents." The Cornell veterinarian 79.1 (1989): 25 - 38 ... sinh khả dụng, hiệu thuốc Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu Khả hấp thụ thuốc berberin màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo 3.2 Phạm vi nghiên cứu Phạm vi. .. tăng khả hấp thụ thuốc có kiểm sốt, tăng khả dụng sinh học thuốc berberin điều trị bệnh, định chọn đề tài: Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc berberin màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước. .. môi trường nước vo gạo Mục đích nghiên cứu  Tạo màng CVK từ chủng A xylinum  Tạo hệ thống CVK lên men từ nước vo gạo  Tìm hiểu khả hấp thụ thuốc màng để tìm trường hợp hấp thụ thuốc nhiều nhằm