Đang tải... (xem toàn văn)
Mục đích của luận án nhằm phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật multiplex PCR trên các bộ mẫu chuẩn và các chủng phân lập
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết đề tài Bacillus anthracis Yersinia pestis hai loài vi khuẩn gây bệnh tối nguy hiểm tương ứng là bệnh than và dịch hạch, từng gây nên nỗi kinh hồng trong lịch sử lồi người, có thể bị lợi dụng làm vũ khí sinh học. Ở Việt Nam, B. anthracis còn xuất hiện rải rác ở các tỉnh miền núi phía Bắc, trong khi Y. pestis vẫn tồn tại trên một số lồi gặm nhấm khu vực Tây Ngun và có thể bùng phát thành dịch bất kỳ lúc nào. Mặt khác, chúng ta cần có phương án ứng phó nhanh, kịp thời trong phòng chống khủng bố sinh học. Trong một vụ tấn cơng nghi ngờ có khủng bố sinh học hay mẫu mơi trường nghi nhiễm các mầm bệnh này, việc phát hiện nhanh, chính xác tác nhân sinh học là một trong những yếu tố quyết định đến sức khỏe cộng đồng và an ninh quốc gia. Việc sàng lọc nhanh những mẫu nghi ngờ giúp kiểm sốt sự lây lan và đảm bảo điều trị chính xác. Phương pháp ni cấy truyền thống được xem là “tiêu chẩn vàng” trong xác định B. anthracis và Y. pestis. Tuy nhiên, mặc dù có độ nhạy cao, phương pháp này đòi hỏi thời gian 2 3 ngày, một số trường hợp độ đặc hiệu khơng cao, cần tiến hành các thử nghiệm bổ sung. Ngồi ra, phương pháp này cần tiến hành ở điều kiện phòng an tồn sinh học cấp 3 (BSL3) với nhân viên được đào tạo và có kinh nghiệm. Các phương pháp miễn dịch được nghiên cứu dưới dạng các que thử nhanh rất thuận tiện nhưng độ nhạy, độ đặc hiệu thấp. Do đó, các phương pháp này khó ứng dụng trong chẩn đốn trên thực địa và phòng chống khủng bố sinh học. Hiện nay, đã có một số kỹ thuật dựa trên PCR dùng để xác định nhanh và chính xác B. anthracis cũng như Y. pestis được phát triển với những ưu điểm nổi bật như độ nhạy, độ đặc hiệu cao và có thể thực hiện với các mẫu đã bất hoạt (nên chỉ cần thực hiện ở điều kiện phòng an tồn sinh học cấp 2). Tuy nhiên, hầu hết các kỹ thuật này chỉ phát hiện một loại plasmid độc lực với từng tác nhân nên khơng phát hiện được các trường hợp chủng thiếu một trong các plasmid trên. Đối với B. anthracis trong tự nhiên, để chẩn đốn chính xác những chủng gây bệnh, ngồi gen đặc trưng trên nhiễm sắc thể, cần chỉ ra được sự có mặt đầy đủ của hai plasmid độc lực pXO1 pXO2 Trong thực tế có những chủng B anthracis thiếu một trong hai plasmid trên nên khả năng gây bệnh thay đổi Tương tự, Y pestis chứa hai plasmid liên quan đến tính độc là pPCP1 và pMT1 với các gen đặc trưng tương ứng. Do đó, các kỹ thuật này có thể khơng đánh giá được đầy đủ tình trạng độc lực B. anthracis, Y. pestis và phải phụ thuộc vào thiết bị chun dụng đắt tiền nhưng vẫn có thể bỏ sót chẩn đốn, chưa đề cập đến là chúng có thể khơng phù hợp với một số chủng trong nước. Ở Việt Nam, việc sử dụng các kỹ thuật dựa trên PCR để chẩn đốn B. anthracis và Y. pestis đã được một số tác giả cơng bố, tuy nhiên những nghiên cứu này chỉ mới dừng ở việc thiết kế kỹ thuật PCR để chẩn đốn từng loại vi khuẩn trên. Điều này có nghĩa là trong thực tế khi bệnh dịch xảy ra mà chưa biết tác nhân nào được sử dụng, nếu dùng PCR với tác nhân thứ nhất cho kết quả âm tính thì phải dùng PCR lần thứ hai với tác nhân khác, như vậy đòi hỏi thời gian và kinh phí. Do đó, kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR mPCR) có thể xác định chính xác đồng thời hai loại tác nhân B anthracis và Y. pestis là một lựa chọn khả thi. Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis” 2. Mục tiêu nghiên cứu Phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật multiplex PCR trên các bộ mẫu chuẩn và các chủng phân lập 3. Nội dung nghiên cứu của đề tài Thiết kế các cặp mồi cho kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng thời B. anthracis và Y. pestis Thiết kế, tối ưu kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng thời B anthracis và Y. pestis Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR chẩn đốn đồng thời B. anthracis và Y. pestis trong phòng thí nghiệm và các chủng phân lập Phân tích trình tự các gen đích đặc trưng và gen độc lực của các chủng B. anthracis và Y. pestis 4. Đóng góp mới của luận án Luận án là cơng trình đầu tiên Việt Nam đã thành cơng trong nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời B. anthracis và Y. pestis. Kỹ thuật multiplex PCR với 6 cặp mồi được thiết kế, tối ưu cho phép khuếch đại đồng thời 7 sản phẩm bao gồm: 3 gen đích là vrrA (thuộc nhiễm sắc thể), pagA (thuộc plasmid pXO1), capA (thuộc plasmid pXO2) B anthracis; 3 gen đích ypo2088 (thuộc nhiễm sắc thể), pla (thuộc plasmid pPCP1), caf1 (thuộc plasmid pMT1) của Y. pestis, cùng 1 gen chứng nội tại là plasmid tái tổ hợp để xác minh kết quả chẩn đốn. Do đó, khắc phục được hiện tượng dương tính giả đối với trường hợp các chủng vi khuẩn B. anthracis và Y. pestis khơng đầy đủ độc lực, phân biệt với chủng gây bệnh, giúp giảm giá thành chẩn đoán so với việc phải thực hiện các lần PCR riêng rẽ, rút ngắn thời gian chẩn đoán 5. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 139 trang, được chia thành các phần: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (30 trang); Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (14 trang); Chương 3: Kết quả nghiên cứu (47 trang); Chương 4: Bàn luận kết quả (21 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Các cơng trình đã cơng bố của tác giả (1 trang). Tóm tắt nội dung luận án bằng tiếng Anh (6 trang), Tài liệu tham khảo (15 trang). Luận án có 16 bảng biểu, 44 hình và 151 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt và tiếng Anh Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án đã tham khảo các tài liệu trong và ngồi nước về 3 vấn đề chính: (1) Tổng quan về vi khuẩn B. anthracis và Y. pestis: đặc điểm sinh học, hệ gen cũng như sự liên quan giữa B. anthracis, Y pestis và vũ khí sinh học; (2) Các phương pháp xác định B anthracis và Y. pestis: các phương pháp vi sinh truyền thống, xác định sinh hóa, dựa trên ái lực và các phương pháp dựa trên axit nucleic; (3) Kiểm định kit mPCR chẩn đốn B anthracis là trực khuẩn thuộc chi Bacillus, họ Bacillaceae. Chi Bacillus gồm các vi khuẩn Gram dương sinh bào tử, đa số không gây bệnh, số gây nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn (Bacillus cereus), một số có lợi cho con người ( Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides). Đặc điểm hình thái, tính chất sinh lý, sinh hố, tính chất ni cấy của các lồi thuộc chi Bacillus rất giống nhau. Tuy nhiên, B. anthracis có đặc điểm khác biệt với các lồi trực khuẩn hiếu khí sinh bào tử khác, đo la co ́ ̀ ́ plasmid pXO1 ma hoa khang nguyên b ̃ ́ ́ ảo vệ va pXO2 mã hoá vo ̀ ̉ Y. pestis thuộc chi Yersinia, họ Enterobacteriaceae. Chi Yersinia có 11 lồi, là các vi khuẩn Gram âm, khơng sinh bào tử. Trong chi Yersinia, có ba lồi gây bệnh người Y pestis, Yersinia pseudotuberculosis Yersinia enterocolitica (Radnedge, 2001). Lồi nguy hiểm nhất, Y. pestis gây bệnh dịch hạch và viêm phổi cấp tính. Vũ khí sinh học hiện nay đã trở thành mối quan tâm hàng đầu của an ninh quốc gia bởi có thể bị các tổ chức khủng bố lợi dụng trong chiến tranh sinh học Trong các tác nhân đã được WHO và CDC nêu ra, B. anthracis, Y. pestis được đánh giá là tác nhân có nguy cơ cao nhất trong khủng bố vì gây bệnh nguy hiểm, dễ ni cấy, tăng sinh khối với số lượng lớn, khơng cần trang bị hiện đại lại dễ sử dụng, vận chuyển và gây nhiễm. Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về phòng chống chiến tranh sinh học đề phòng các tình huống địch tấn cơng bằng vũ khí sinh học. Sự quan tâm được đặt mức đặc biệt với hai loại vi khuẩn là B. anthracis Y. pestis. Xác định tầm quan trọng của việc xác định nhanh và chính xác hai loại vi khuẩn này, đề tài KCB 0109 và một số đề tài đã thiết kế các phản ứng PCR chẩn đốn cho từng loại tác nhân. Năm 2005, Lê Thanh Hòa và cs. đã nghiên cứu xây dựng phương pháp chẩn đốn nhanh Y. pestis trên các loại mơi trường giả định. Tuy nhiên, cơng trình chỉ dừng lại việc khẳng định Y. pestis thơng qua một đoạn gen duy nhất trên plasmid gây độc là pPCP1 (Lê Thanh Hòa, 2005). Trên thực tế, một số chủng Y. pestis plasmid pPCP1 có thể bị mất đi thì sản phẩm của nghiên cứu không áp dụng (Marston, 2005) Hay nghiên cứu tách dòng đọc trình tự gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ từ chủng B anthracis VCM1167 (Phạm Thúy Kiều, 2006) Như vậy, có thể nói các đề tài về B. anthracis Y. pestis ở Việt Nam hiện nay còn ít và riêng lẻ cho từng loại tác nhân. Do đó, việc nghiên cứu phát triển kỹ thuật mPCR xác định nhanh và chính xác đồng thời hai tác nhân nguy hiểm này là cấp thiết, đáp ứng yêu cầu an ninh quốc phòng phòng chống dịch bệnh Kỹ thuật mPCR được phát triển nhằm xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis một cách chính xác hơn bằng việc sử dụng cặp mồi thiết kế trên nhiễm sắc thể, đồng thời cũng sử dụng các cặp mồi để phát hiện các gen độc lực trên plasmid. Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ Các chủng vi khuẩn, plasmid Chủng chuẩn B anthracis 17JB (ký hiệu: Ba) Y pestis SVCM7 (ký hiệu: Yp) đầy đủ độc lực. Chủng chuẩn đối chứng âm: Bacillus cereus ATCC 6464, E coli ATCC 25922, Y. enterocolitica ATCC 27729. Các chủng vi khuẩn phân lập nghi ngờ B anthracis: gồm 23 chủng B anthracis Ba1Ba23; 2 chủng Y. pestis Yp1, Yp2. Plasmid pJET1.2capA chứa tồn bộ trình tự gen capA (thuộc plasmid pXO1) của B. anthracis Sinh phẩm, hố chất, thiết bị: Sinh phẩm, hóa chất sử dụng trong các thí nghiệm được đặt mua từ các hãng: Thermo Scientific, Integrated DNA Technologies IDT, Qiagen, Norgen, bioMérieux, Biolabs, Gibco, Invitrogen. Các trang thiết bị Bộ mơn Vi sinh y học, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Qn sự, Học viện Qn y và Phòng Cơng nghệ sinh học mơi trường, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp thực nghiệm mơ tả, phân tích trong phòng thí nghiệm và trên thực địa với các kỹ thuật vi sinh kinh điển và sinh học phân tử. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu gồm: 2.2.1. Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 2.2.2. Tách chiết DNA tổng số 2.2.3. Khuếch đại gen bằng PCR 2.2.4. Điện di DNA trên gel agarose 2.2.5. Tinh sạch DNA 2.2.6. Thiết kế kỹ thuật mPCR xác định đồng thời gen đặc trưng và gen độc lực của B. anthracis và Y. pestis 2.2.7. Tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis 2.2.8. Thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp của kỹ thuật mPCR 2.2.9. Tối ưu kỹ thuật mPCR chứa chứng nội tại 2.2.10. Thiết lập và đánh giá bộ mẫu chuẩn đánh giá độ nhạy, đặc hiệu và ổn định của kit mPCR 2.2.11. Xác định các chủng phân lập bằng ni cấy, định danh 2.2.12. Thử nghiệm kỹ thuật mPCR trên các chủng phân lập 2.2.13. Kiểm tra các chủng vi khuẩn bằng giải trình tự Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI B. anthracis VÀ Y. pestis 3.1.1. Nghiên cứu thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho mPCR Kỹ thuật mPCR ly t ́ ưởng đê ̉ xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis phải được thiêt kê phat hiên đông th ́ ́ ́ ̣ ̀ ơì B. anthracis, Y. pestis và đánh giá đầy đủ các mức độ độc lực khác nhau của chúng tự nhiên Trong đó, với B anthracis cần cặp mồi trên nhiễm sắc thể (lựa chọn gen vrrA) 2 cặp mồi trên plasmid pXO1 và pXO2 tương ứng là gen pagA và capA. Tương tự, với Y pestis, gen ypo2088 (trên nhiễm sắc thể), pla (pPCP1) và caf1 (pMT1) được lựa chọn. Như vậy, 6 cặp mồi đặc hiệu cho mPCR được thiết kế đảm bảo khuếch đại 6 gen đích kích thước khác nhau. Với gen vrrA, dựa vào trình tự tham chiếu trên NCBI, đã thiết kế được 5 cặp mồi cho khuếch đại một phần trình tự gen đích (Hình 3.2). Cặp mồi gen vrrA chưa được lựa chọn ngay bởi còn phụ thuộc vào kết quả thiết kế các cặp mồi cho 5 gen đích còn lại. Tương tự cho thiết kế các cặp mồi gen pagA, capA (B. anthracis) và ypo2088, pla, caf1 (Y. pestis) Sau khi kiểm tra về khả năng hình thành cấu trúc bậc 2 hay bắt cặp chéo giữa các mồi cũng như sự phù hợp về kích thước sản phẩm, 6 cặp mồi đã được lựa chọn vrrA Hình 3. 2. Thơng tin các cặp mồi khuếch đại gen vrrA Bảng 3. 1. Thơng tin 6 cặp mồi của mPCR xác định B. anthracis và Y. pestis Tên mồi Trình tự (5’-3’) Tổng số base Tm* Kích thước (bp) vrrAF1/R1 CTGTAAGCCCTGTCGTCGAA-F CCTCGCGCACTTCTTTTTCT-R 20 59.76 59.13 222 pagAF1/R1 AAATGGAGCACGGCTTCTGA-F AGCCTGTATCCACCCTCACT-R 20 59.96 59.96 751 capAF1/R1 TGACGATGACGATGGTTGGT-F GCTTCCTGTCTAGGACTCGG-R 20 59.39 59.26 610 ypoF1/R1 GGATGAGATAACGCGGGTGT-F AGAGAATCGTGATGCCGTCC-R 20 59.90 59.90 103 plaF1/R1 CGGGATGCTGAGTGGAAAGT-F ATTACCCGCACTCCTTTCGG-R 20 60.04 60.11 438 cafF1/R1 CGCTTACTCTTGGCGGCTAT-F GCTGCAAGTTTACCGCCTTT-R 20 60.25 59.69 271 *Tm. Nhiệt độ nóng chảy 3.1.2. Nghiên cứu thiết kế kỹ thuật mPCR Kỹ thuật mPCR được thiết kế và đánh giá trên 2 chủng chuẩn có đầy đủ độc lực là B anthracis Ba và Y pestis Yp cùng đối chứng âm là B. cereus và E. coli, Y. enterocolitica. 3.1.2.1 PCR đơn mồi phát gen vrrA, pagA, capA B anthracis Để có cơ sở cho thiết kế kỹ thuật mPCR phát hiện đồng thời 3 gen đích B. anthracis, PCR đơn mồi được thực hiện ban đầu giúp kiểm tra sự có mặt của gen quan tâm và độ đặc hiệu từng cặp mồi. Hình 3. 8. Sản phẩm khuếch đại 3 gen đích pagA, vrrA, capA của B. anthracis Ba bằng PCR đơn mồi ĐC(). Đối chứng âm là nước khử ion; M. Marker 100 bp (Thermo Scientific) Các gen pagA (751 bp), vrrA (222 bp) và capA (610 bp) đều xuất hiện băng đặc hiệu và khơng có băng phụ (Hình 3.8). Như vậy, nồng độ các thành phần, chu trình nhiệt trong PCR đơn mồi này sẽ được sử dụng cho mPCR tiếp theo 3.1.2.2 Kỹ thuật mPCR phát hiện đồng thời 3 gen vrrA, pagA, capA của B. anthracis Kỹ thuật mPCR đã khuếch đại đồng thời 3 gen đích của B. anthracis. 3.1.2.3 PCR đơn mồi phát gen ypo2088, pla, caf1 Y pestis PCR đơn mồi cho Y. pestis được thực hiện tương tự, sản phẩm là pla (438 bp), caf1 (271 bp), ypo2088 (103 bp) (Hình 3.10) Hình 3. 10. Sản phẩm khuếch đại 3 gen đích pla, caf1, ypo của Y. pestis Yp bằng PCR đơn mồi ĐC(). Đối chứng âm là nước khử ion; M. Marker 100 bp (Thermo Scientific) 3.1.2.4. Kỹ thuật mPCR phát hiện đồng thời 3 gen ypo2088, pla, caf1 của Y. pestis Kỹ thuật mPCR đã khuếch đại đồng thời 3 gen đích của Y pestis. 3.1.2.5. Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và từng tác nhân Để kiểm tra các cặp mồi của tác nhân này có bắt cặp chéo với DNA tác nhân còn lại, kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và 1 khn DNA B anthracis Y pestis được thực Đường chạy Yp với khn là DNA Y. pestis chỉ xuất hiện 3 băng đích của Y. pestis. Tương tự, đường chạy Ba chỉ xuất hiện 3 băng đích của B. anthracis (Hình 3.12). Như vậy, các cặp mồi đã được thiết kế đặc hiệu cho B. anthracis, Y. pestis và khơng có hiện tượng bắt cặp chéo. bp ĐC(-) Yp Ba M bp Hình 3. 12. Sản phẩm PCR với 6 cặp mồi, từng loại DNA khn ĐC(). Đối chứng âm là nước khử ion; Yp. Sản phẩm mPCR với khn DNA Y. pestis; Ba. Sản phẩm mPCR với khn DNA B. anthracis; M Marker 100 bp (Thermo Scientific) 3.1.2.6. Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và 2 tác nhân Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và 2 loại khn chỉ thu được 3 băng đích của Y. pestis. 3.1.3. Nghiên cứu tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B anthracis và Y. pestis Cần tối ưu các thông số của mPCR để đảm bảo xác định đồng thời B anthracis Y pestis như: nồng độ mồi, đệm, MgCl2, dNTPs cũng như các điều kiện về chu trình nhiệt để thu được đồng thời 6 băng sản phẩm đích đặc hiệu Nồng độ các mồi Y. pestis 0,1 μM và B. anthracis 0,6 μM là tối ưu trong mPCR (Hình 3.14). 3.2.1. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu chuẩn Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn xác định độ nhạy kit mPCR Ngưỡng nồng độ DNA tối thiểu có thể phát hiện được bằng PCR là thơng số cần khảo sát trước khi xây dựng bộ mẫu chuẩn độ nhạy. Mẫu gốc DNA được tách chiết, tinh sạch đạt nồng độ 120 ng/µl, từ mẫu này pha lỗng trong nước khử ion B50 B51 B52 B53 B54 B55 B56 B57 B58 B59 M ĐC(-) Hình 3. 23. Xác định ngưỡng phát hiện B. anthracis M. Marker 50 bp; B50B59. các mức nồng độ DNA; ĐC(). Đối chứng âm Mẫu có nồng độ DNA thấp nhất còn cho khả năng phát hiện được là B55 (mã số gốc PBA19) (Hình 3.23), nồng độ 0,000092 ng/µl tương đương 81,5 copy/ phản ứng mPCR sử dụng 5 µl DNA. Với kết quả xác định ngưỡng của mPCR phát hiện B. anthracis trên, tiến hành thiết lập bộ mẫu chuẩn độ nhạy 100 ống (50 µl/ống), bao gồm: 10 hàng (ký hiệu EB1 đến EB10) x 10 cột. Sử dụng 10 mức nồng độ bộ mẫu chuẩn xác định ngưỡng mPCR phát B anthracis từ PBA10 (0,046875 ng/µl) PBA19 (0,000092 ng/µl) tương ứng ký hiệu EB1 EB10. Tương tự, ngưỡng phát hiện của bộ mẫu chuẩn Y. pestis là 130,5 copy/ phản ứng. Bộ mẫu chuẩn độ nhạy mPCR xác định Y pestis cũng được thiết lập gồm 100 ống (50 µl/ống), bao gồm: 10 hàng (ký hiệu EY1 đến EY10) x 10 cột. Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu chẩn đoán của kit mPCR Các bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu mPCR đối với B. anthracis được thiết lập tương tự với các bộ mẫu chuẩn độ nhạy, sử dụng chủng B cereus Tương tự, sử dụng chủng E coli Y. enterocolitica cho Y. pestis Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của kit mPCR chẩn đốn B. anthracis và Y. pestis Để thuận tiện cho việc đánh giá nội bộ, sau khi thiết lập bộ mẫu chuẩn độ nhạy và đặc hiệu xác định từng tác nhân, chúng tơi tiến hành phối trộn các bộ mẫu chuẩn riêng rẽ tương ứng để tạo các bộ mẫu chuẩn hỗn hợp đồng thời B. anthracis và Y. pestis. Đánh giá kit mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis trên bộ mẫu chuẩn Khả năng phát hiện B. anthracis của bộ kit mPCR được kiểm tra trên 100 mẫu (từ mẫu EB1 đến EB10, mỗi mẫu lặp lại 10 lần) của bộ mẫu chuẩn độ nhạy với B. anthracis cho kết quả là 100% các mẫu đều phát hiện đầy đủ các gen đặc trưng của B. anthracis. Tương tự cho đánh giá độ nhạy của bộ kit mPCR đối với Y. pestis, đồng thời B. anthracis và Y. pestis đều cho kết quả 100% Chúng tôi tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu của kit BaYp mPCR trên 100 mẫu (từ C1 đến C10 mỗi mẫu lặp lại 10 lần) của bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu đã thiết lập từ B. cereus. Kết quả 100% các mẫu khơng xuất hiện gen đặc trưng capA, pagA của B. anthracis nhưng 100% các mẫu dương tính với gen vrrA. Với Y. pestis, độ đặc hiệu của bộ kit mPCR là 100%. Cac thanh phân cua kit BaYpmPCR co s ́ ̀ ̀ ̉ ́ ự ôn đinh trên 12 thang ̉ ̣ ́ bao quan ̉ ̉ ở điều kiện 20oC (Hình 3.32). Hình 32 Kiểm tra độ ổn định mPCR sau thời gian 12 tháng M Marker 100 bp; 110 Các mẫu DNA EBY2 3.2.2. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các chủng phân lập Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi xác định đồng thời gen đặc trưng, gen độc lực của B. anthracis và Y. pestis đã được thiết kế và tối ưu thành công trên chủng chuẩn. Việc đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu chuẩn là trong điều kiện lý tưởng điều kiện tiên quyết cho bất kỳ bộ kit nào trước khi đưa ra thử nghiệm lâm sàng. Với các chủng lâm sàng B. anthracis cũng Y. pestis, đặc biệt là các mẫu phân lập ngồi mơi trường hay lưu trữ thời gian dài trong phòng thí nghiệm, một số tính chất về kiểu hình, kiểu gen có thể bị biến đổi. Do đó, để khẳng định việc thiết kế thành công kỹ thuật mPCR, chủng phân lập B anthracis và Y. pestis sau khi được kiểm tra, xác định bằng nuôi cấy, được xác định bằng kỹ thuật mPCR. Kết quả xác định của mPCR được khẳng định bằng phân tích trình tự tồn bộ chiều dài một số gen tiêu biểu trên nhiễm sắc thể, các plasmid độc lực Xác định chủng phân lập bằng ni cấy, định danh Các chủng nghi ngờ B. anthracis và chủng chuẩn B. anthracis Ba (đối chứng dương) được ni cấy trên mơi trường thạch máu cừu ở 37oC/CO2 5%/ 24 giờ. Kết quả, tất cả các chủng cho khuẩn lạc dạng R, màu xám, trực khuẩn Gram dương, hình vng hai đầu, xếp đơi, chuỗi, bào tử giữa và khơng làm biến đổi hình dạng vi khuẩn, trong đó 11 chủng khơng tan máu β trên mơi trường thạch máu cừu có 4 chủng hình thành vỏ ( B. anthracis Ba, Ba1, Ba3, Ba4). 13 chủng còn lại tan máu β. Định danh cho 11 chủng là B. anthracis, còn lại là B. cereus (ID > 90%). Chủng Y. pestis Yp1, Yp2 cho kết quả mọc các khuẩn lạc kích thước 1 2 mm dạng S, màu xám đục, bờ đều, bề mặt nhẵn, trung tâm lồi giống hình trứng oplet và khơng tan máu, là trực khuẩn Gram âm nhỏ, oxydase () Định danh là Y. pestis với ID Yp1, Yp2 lần lượt là 98,6 và 96,4% Thử nghiệm kỹ thuật mPCR Kỹ thuật mPCR được thử nghiệm trên các mẫu nghiên cứu B anthracis, Y. pestis và các mẫu đối chứng âm là B. cereus, E. coli. Mẫu hỗn hợp được tạo ra bằng cách trộn lẫn chủng B. anthracis và Y. pestis sau đó tiến hành tách DNA tổng số. Ở tất cả các mẫu đối chứng và mẫu thử nghiệm đều xuất hiện băng chứng nội tại IC, điều này chứng tỏ q trình tách chiết DNA và mPCR đảm bảo, theo đó các kết quả xác định là đáng tin cậy (minh họa ở Hình 3.36). Mẫu đối chứng âm chỉ xuất hiện băng có kích thước khoảng 220 bp tương ứng với gen vrrA, ngồi ra khơng xuất hiện thêm băng nào khác. Điều này là phù hợp, vì đối chứng âm sử dụng chủng B. cereus, gen vrrA có mặt trong các lồi nhóm “B. cereus”. Còn mẫu đối chứng dương xuất hiện cả 6 gen đích đối với cả 2 tác nhân (Hình 3.36a), hoặc xuất hiện 3 gen đích đối với từng tác nhân (Hình 3.36b). (+) (-) M BY2 Yp1 Yp2 Ba4 M Ba5 Ba6 (+) (-) M Ba3 Ec Hình 3. 36. Xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis bằng kỹ thuật mPCR tối ưu chứa chứng nội tại IC M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); a) (+). Đối chứng dương là hỗn hợp B anthracis và Y. pestis; (). Đối chứng âm là hỗn hợp B. cereus và E. coli; BY2 Mẫu thử nghiệm hỗn hợp B. anthracis Ba4 và Y. pestis Yp2; Yp1. Y. pestis Yp1; Yp2 Y pestis Yp2; Ba4 B anthracis Ba4; Ba5 B anthracis Ba5; Ba6 B anthracis Ba6; b) (+). Đối chứng dương là mẫu B. anthracis Ba; (). Đối chứng âm B. cereus; Ba3. B. anthracis Ba3; Ec. E. coli Kết quả thử nghiệm kỹ thuật mPCR cho thấy, khi chỉ xuất hiện 1 băng có kích thước tương ứng với gen đích vrrA (mẫu Ba5 Hình 3.36a) hay không xuất băng đích (mẫu Ec Hình 3.36b), được xác định là mẫu âm tính với B. anthracis và Y. pestis gây bệnh (tương ứng là mẫu B. anthracis Ba5 và E. coli). Cụ thể, kết quả Hình 3.36a, đường chạy ký hiệu BY2 xuất hiện đầy đủ 6 băng đích có kích thước đúng với mẫu đối chứng dương, được xác định là mẫu dương tính đồng thời với B. anthracis và Y. pestis có đầy đủ độc lực. Mẫu ký hiệu Yp1, Yp2, Ba4 (Hình 3.36a) và mẫu Ba3 (Hình 3.36b) xuất hiện đầy đủ 3 băng của các gen đích cho từng đối tượng, được xác định lần lượt là chủng Y. pestis B anthracis gây bệnh. Trong khi đó, đáng chú ý trên Hình 3.36a, mẫu Ba6 chỉ xuất hiện 2 băng có kích thước tương ứng với 2 gen đích pagA vrrA, khơng xuất hiện băng chỉ thị gen capA. Đây là mẫu B. anthracis bị thiếu plasmid pXO2, không đầy đủ độc lực (chủng B. anthracis Ba6). Như vậy, trong 10 chủng phân lập B. anthracis, kỹ thuật mPCR xác định chủng B anthracis đầy đủ độc lực (Ba1, Ba3 và Ba4), 1 chủng giảm độc do thiếu gen capA thuộc plasmid pXO2 (chủng B. anthracis Ba6), 6 chủng còn lại là B. anthracis khơng độc. Đồng thời với Y. pestis, kỹ thuật mPCR đã xác định được 2/2 chủng Y. pestis có đầy đủ gen độc lực Để khẳng định kết quả, băng điện di đặc hiệu cho các gen đích chẩn đốn được tinh sạch gel và giải trình tự. Kết quả, tất cả các trình tự đều thuộc các gen đích tương ứng của B. anthracis và Y. pestis. Như vậy, kỹ thuật mPCR đã được thử nghiệm thành cơng trên chủng chuẩn và chủng phân lập Phân tích trình tự gen đặc trưng và gen độc lực của B. anthracis và Y. pestis Kỹ thuật mPCR được phát triển ở trên chứa 6 cặp mồi xác định các đoạn ngắn trình tự bảo thủ của gen đích tương ứng. Tuy nhiên, mỗi gen đích có chiều dài khác nhau và phân bố các vị trí khác nhau. Cụ thể, với B. anthracis, gen đặc trưng vrrA thuộc nhiễm sắc thể, gen độc lực pagA, capA thuộc plasmid pXO1, pXO2. Với Y. pestis, gen đặc trưng ypo2088 thuộc nhiễm sắc thể, gen độc lực pla, caf1 thuộc plasmid pPCP1, pMT1. Để đánh giá kỹ thuật mPCR được phát triển, đồng thời nghiên cứu trình tự các gen đặc trưng và gen độc các chủng phân lập được Việt Nam có sự giống và khác nhau như thế nào với các chủng quốc tế, chúng tơi tiến hành phân tích trình tự tồn bộ chiều dài gen độc lực và gen đặc trưng của B. anthracis và Y. pestis Phân lập tồn bộ chiều dài gen đặc trưng và gen độc lực Đối với B. anthracis, 7 gen vrrA, pagA, cya, lef, capA, capB, capC đã được nhân dòng cho xác định tồn bộ trình tự. Các gen này đã khuếch đại thành cơng, sản phẩm PCR có kích thước lần lượt là 551, 2323, 2544, 2580, 1325, 1439 và 561 bp đúng với lý thuyết Đối với Y. pestis, gen đặc trưng trên nhiễm sắc thể là ypo2088 và 2 gen trên plasmid pPCP1 và pMT1 tương ứng là pla và caf1 cho sản phẩm kích thước là 645, 1019 và 654 bp. Nghiên cứu tạo dòng tồn bộ chiều dài gen đặc trưng và gen độc lực Sản phẩm khuếch đại các gen đích được tinh sạch và tạo dòng trong vector pJET1.2/blunt. Chúng tơi lựa chọn một số enzyme giới hạn để cắt kiểm tra các dòng plasmid tái tổ hợp, BglII được sử dụng trong tất cả các trường hợp bởi nằm trên vùng đa điểm cắt. Ngồi ra, trong một số trường hợp, chúng tơi sử dụng thêm một số enzyme khác có trình tự nhận biết trên vector và trong trình tự gen đích. Q trình cắt kiểm tra bằng các enzyme giới hạn được minh họa với vector tái tổ hợp pJET1.2pagA (Hình 3.39). a) b) Hình 3. 39. Tạo dòng gen pagA trong vector pJET1.2/blunt a) Sơ đồ biểu hiện q trình cắt kiểm tra vector pJET1.2pagA bằng BglII; b) Cắt kiểm tra vector pJET1.2pagA trên gel agarose 1,2% Sử dụng enzyme giới hạn BglII, cặp enzyme XbaI và EcoRI, chúng tơi đã chọn được các dòng tế bào mang plasmid chứa gen pagA cho sản phẩm kích thước khoảng 4,0 và 1,2 kb (cắt bằng XbaI và EcoRI) và khoảng 2,8; 2,4 kb đối với BglII. Như vậy, các gen đích đã được tách dòng thành cơng Phân tích trình tự các gen đích đặc trưng và gen độc lực Phân tích trình tự gen vrrA trên 10 chủng B. anthracis phân lập cho thấy, gen vrrA giống nhau hồn tồn, độ tương đồng từ 99 100% so với chủng tham chiếu. Phân tích trình tự gen pagA của 3 chủng B. anthracis độc lực (Ba1, Ba3 và Ba4) xác định được 3 đột biến điểm (T C), trong đó 1 đột biến đồng nghĩa (T C)195, 2 đột biến sai nghĩa là (T C)1693 và (T C)1799 khi so sánh với chủng B. anthracis VollumUSA. Nghiên cứu trình tự gen cya và lef (pXO1), xác định được 1 đột biến đồng nghĩa (T C)600 trên gen cya chủng B. anthracis Ba3 và Ba4, còn gen lef có mức độ tương đồng 100% so với chủng tham chiếu. Một đột biến sai nghĩa hồn tồn mới (A G)1048 ở gen capA chủng B. anthracis Ba1 làm thay đổi axit amin lysine thành glutamic (Hình 3.43) Hai gen còn lại là capB, capC có tính bảo tồn cao, khơng xảy ra đột biến bất cứ điểm Các gen đăng ký Genbank với mã số: KP2131027; KP75988593 Hình 3. 43. So sánh trình tự axit amin của protein được mã hóa bởi gen capA 3 chủng B. anthracis Ba1, Ba3 và Ba4 với 12 chủng tham chiếu Với Y. pestis, gen ypo2088 caf1 của 2 chủng Y. pestis Yp1, Yp2 có mức độ tương đồng 100% so với chủng tham chiếu. Chỉ có 1 đột biến điểm được xác định ở gen pla (T C)836 khi so sánh với chủng Y. pestis Angola. Trình tự phân tích các gen được đăng ký trên Genbank với mã số KM8800257 Như vậy, kỹ thuật mPCR được thiết kế xác định đồng thời B. anthracis, Y. pestis và thử nghiệm dựa trên các chủng phân lập trong nước hồn tồn có thể chẩn đốn cho các chủng từ các khu vực khác trên thế giới 3.2.3. Kiểm định bộ kit BaYpmPCR chẩn đốn B. anthracis và Y. pestis Kỹ thuật mPCR xác định nhanh, đồng thời B. anthracis Y. pestis được phát triển thành kit BaYpmPCR, kiểm định tại Viện kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm, Bộ Y tế cho kết quả đạt tiêu chuẩn cơ sở, độ nhạy, độ đặc hiệu 100% trên panel mẫu chuẩn Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ 4.1 THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI B. anthracis VÀ Y. pestis Kỹ thuật mPCR cho phép tiết kiệm thời gian, kinh phí và đóng vai trò quan trọng trong chẩn đốn phân tử. Thực tế, việc nghiên cứu thiết kế mPCR tối ưu đòi hỏi nhiều cơng đoạn hơn so với PCR thơng thường. Các thành phần tham gia trong phản ứng cũng chu trình nhiệt cần được đánh giá, tối ưu. Đồng thời, việc nghiên cứu, thiết kế mồi trong mPCR có vai trò rất quan trọng. Đối với 2 tác nhân B. anthracis và Y. pestis, cần chỉ ra được chủng gây bệnh (có đầy đủ độc lực) hay khơng. Với B. anthracis, gen pagA (pXO1) được WHO khuyến cáo sử dụng bởi khi chủng B anthracis thiếu gen này sẽ khơng thể gây độc. Ngồi ra, gen capA (pXO2) được lựa chọn nhiều trong chẩn đốn (Skottman, 2007; Kurosaki, 2009). Một gen đích nữa được sử dụng để phát hiện tất các chủng vi khuẩn than là vrrA nằm trên nhiễm sắc thể có tính ổn định cao và bền vững. Trong xác định Y. pestis, pla, caf1, ypo2088 là các gen đích thường được sử dụng, cho phép chẩn đốn chính xác Y. pestis. Như vậy, cần thiết kế 6 cặp mồi trong mPCR cho xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis Khi thực hiện mPCR với nhiều cặp mồi, xác suất tạo sản phẩm khơng đặc hiệu, bắt cặp chéo giữa các mồi tăng lên. Do đó, sau khi nghiên cứu thiết kế mồi, tối ưu mPCR là điều kiện tiên quyết để hạn chế tối đa những tương tác lẫn nhau giữa các cặp mồi cũng như việc tạo thành các sản phẩm phụ Cho đến trước nghiên cứu này, có rất ít cơng trình phát triển kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis cũng như các tác nhân truyền nhiễm khác có kết hợp các cặp mồi chẩn đốn xác định cả gen đặc trưng trên nhiễm sắc thể và gen độc lực trên plasmid cùng chứng nội tại để xác minh kết quả. Hầu hết các cơng trình lựa chọn trong các gen đích độc lực trên plasmid (Batra, 2013; Safari Foroshani, 2013; WhiteduckLeveillee, 2016), vậy sẽ khơng đánh giá được đầy đủ tình trạng độc lực của các chủng vi khuẩn gây bệnh và có thể bỏ sót chẩn đốn. Để khắc phục hạn chế này, số nghiên cứu kết hợp gen trên nhiễm sắc thể và gen độc lực, tuy nhiên lại trên từng tác nhân riêng rẽ (Chen, 2012; Ogawa, 2015; Riojas, 2015; Lindsey, 2017). Mặt khác, nhiều cơng trình lại khơng thiết kế chứng nội tại để kiểm sốt kết quả chẩn đốn lâm sàng. Kỹ thuật mPCR được phát triển trong luận án sử dụng 6 cặp mồi trong đó có cả chứng nội tại để phát hiện nhanh, đồng thời và chính xác B. anthracis và Y. pestis gây bệnh bằng cách kết hợp 1 gen đích trên nhiễm sắc thể và 2 gen đích độc lực trên plasmid cho mỗi loại tác nhân. Đặc biệt, chúng tơi đã thiết kế IC cạnh tranh (Abdulmawjood, 2002; Hoorfar, 2004), sử dụng chung cặp mồi chẩn đốn là capAF1/R1. Như vậy, sẽ khơng phải thiết kế thêm cặp mồi cho IC và cơng đoạn tối ưu được rút ngắn. Như vậy, kỹ thuật mPCR có chứa 6 cặp mồi cho phép khuếch đại đồng thời 7 sản phẩm gồm 3 gen đích của B. anthracis, 3 gen đích của Y. pestis và 1 gen IC Kỹ thuật này đã cung cấp một cơng cụ hữu ích góp phần xác định nhanh, đồng thời 2 tác nhân vi khuẩn có nguy cơ cao sử dụng làm vũ khí sinh học này chỉ trong một ống phản ứng, giúp giảm giá thành, cơng sức và thời gian chẩn đốn 4.2. KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ THUẬT mPCR TRÊN CÁC BỘ MẪU CHUẨN VÀ CÁC CHỦNG PHÂN LẬP Kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis sau khi thiết kế, tối ưu thành cơng đã được chế tạo thử nghiệm thành kit (kit BaYpmPCR). Để đảm bảo chất lượng, kit mới chế tạo phải được đánh giá với các tiêu chí quan trọng là: độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định trên các bộ mẫu chuẩn điều kiện tiên quyết cho bất kỳ bộ kit chẩn đoán nào trước khi đưa vào thử nghiệm thực địa (WHO, 2004; Bunk, 2007; Madej, 2010; NIBSC, 2014) Các loại mẫu chuẩn dùng trong kiểm định có thể tìm trong danh mục của WHO hoặc NIBSC là lý tưởng nhất. Tuy nhiên, khi khơng có các loại trên thì thiết lập các bộ mẫu chuẩn nội bộ là cần thiết (Belak, 2001), đặc bệt với B anthracis Y. pestis là 2 loài vi khuẩn tối nguy hiểm, khơng có sẵn mẫu chuẩn. Các chủng chuẩn sử dụng trong tách chiết DNA cho thiết lập mẫu chuẩn nội bộ đều được kiểm tra, đánh giá tính chất sinh vật, hóa học điển hình. Các mẫu DNA có độ tinh sạch và nồng độ cao được sử dụng làm mẫu chuẩn Theo cách này, bộ mẫu chuẩn có độ đồng nhất cao và có thể pha lỗng thành các nồng độ chính xác, cũng là hướng thiết lập được WHO khuyến cáo. Giá trị ngưỡng phát hiện cho B. anthracis và Y pestis tương ứng 81,5 130,5 copy/phản ứng, tương đương với kết quả của các cơng trình đã cơng bố (Heinz Ellerbrok, 2002; Batra, 2013; Nghiem, 2015), độ nhạy 100% thử nghiệm trên số mẫu đủ lớn là 100, đạt tiêu chuẩn cơ sở Kết quả đánh giá độ đặc hiệu cho thấy, nếu chỉ sử dụng 1 gen nhiễm sắc thể (vrrA) có thể chẩn đốn nhầm giữa B. anthracis và B. cereus (Bode, 2004; Rasko, 2004). Mặt khác, nếu dựa vào 1 gen trên plasmid thì nguy cơ âm tính giả với chủng mất một trong các plasmid độc lực. Với B. anthracis, để khẳng định là vi khuẩn than gây bệnh cần có mặt đồng thời 3 gen là vrrA, pagA, capA. Kết quả này cũng minh chứng cho yêu cầu phải kiểm định trên panel mẫu với tất cả các kit thương mại trước khi đưa ra thị trường. Như vậy, các bộ panel độ nhạy và độ đặc hiệu được thiết lập là đảm bảo và có ý nghĩa đánh giá giá trị khoa học của bộ kit, có khả năng kiểm định các tiêu chuẩn của một bộ kit PCR chẩn đoán B. anthracis Y. pestis với nhiều cách thiết kế mồi khác nhau. Đánh giá kit PCR chẩn đoán trên các bộ mẫu chuẩn là kiểm định trong điều kiện lý tưởng. Trên thực tế, B. anthracis và Y. pestis có thể tồn tại tự nhiên hay bị gây nhiễm ngồi mơi trường, là những mẫu phức tạp, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật PCR, đòi hỏi cần xác định nhanh, xác những trường hợp nghi ngờ. Kỹ thuật mPCR này đã được thử nghiệm trên chủng chuẩn và chủng phân lập (sau khi đã được kiểm tra tính chất sinh vật, hóa học, định danh). Đồng thời, để có cơ sở đánh giá kỹ thuật mPCR được phát triển cho ứng dụng xác định chủng địa phương và chủng quốc tế, chúng tơi tiến hành phân tích trình tự tồn bộ chiều dài các gen đặc trưng và gen độc lực tiêu biểu của B. anthracis (thuộc plasmid pXO1, pXO2), Y. pestis (thuộc pPCP1, pMT1) Kết quả này đã cung cấp dữ liệu nucleotide tương đối hoàn chỉnh về một số gen tiêu biểu của các chủng B. anthracis, Y pestis phân lập Việt Nam Kỹ thuật mPCR chứa chứng nội tại tối ưu đã xác định chính xác chủng B. anthracis, Y. pestis riêng lẻ hay đồng thời B anthracis và Y pestis có đầy đủ độc lực (B anthracis Ba1, Ba3, Ba4, Y. pestis Yp1, Yp2) cũng như phân biệt với chủng giảm độc (B anthracis Ba6) hay không độc (B anthracis Ba2, Ba5, Ba7Ba9, Ba11) (minh họa ở Hình 3.36). Với trường hợp chủng B. anthracis khơng độc (thiếu 2 plasmid pXO1 và pXO2), kỹ thuật mPCR này khơng phân biệt được với chủng B. cereus bởi gen vrrA cũng có mặt trong các lồi thuộc nhóm “B. cereus”. Như vậy, nếu chỉ sử dụng gen vrrA rất khó phân biệt các lồi thuộc nhóm này. Điều này đã khẳng định, cần kết hợp với 2 gen đặc trưng tương ứng trên plasmid pXO1 và pXO2 để xác định xác B anthracis gây bệnh (Radnedge, 2003; Kim, 2015). Đồng thời, mặc dù pXO1 và pXO2 được coi là đặc trưng cho B. anthracis, có một số báo cáo chỉ ra rằng, một số chủng thuộc nhóm “B cereus” gặp chứa plasmid có sự tương đồng với plasmid (Rasko, 2007; Koehler, 2009). Trường hợp ngoại lệ này bao gồm một thể lâm sàng nhiễm B cereus với triệu chứng bệnh than, mang một plasmid pXO1 gi ống đến 99,6% với pXO1 B anthracis (Hoffmaster, 2004) Và một trường hợp mẫu lâm sàng từ khỉ hoang dã cỡ lớn mà chết vì bệnh giống than, khơng có kiểu hình B anthracis, chứa plasmid giống pXO1 và pXO2, có khả năng tạo kháng ngun bảo vệ và tạo vỏ. Xác định trình tự đa locus những chủng này cho thấy chúng có quan hệ rất gần với B. anthracis và là chủng B. cereus và B thuringiensis độc hiếm gặp (Koehler, 2009). Đến nay, chỉ mới có một vài trường hợp này được báo cáo trên thế giới, làm thay đổi quan niệm cũ về bệnh than chỉ được giới hạn trong B. anthracis (Hoffmaster, 2004; Klee, 2006; Kim, 2015) Đây trường hợp hiếm, cá thể khi bị nhiễm những chủng đặc biệt này đều bị tử vong giống bệnh than, và cũng có thể được xác định bằng kỹ thuật mPCR phát triển (Chun, 2012; Irenge, 2012; Girault, 2014). Như vậy, kỹ thuật mPCR tối ưu chứa chứng nội tại tái tổ hợp này đã cho phép xác định B. anthracis cũng như Y. pestis gây bệnh. Kỹ thuật mPCR này đã chứng tỏ đây là cơng cụ hữu ích cho việc xác định nhanh đồng thời cũng như phân biệt chính xác các chủng B. anthracis, Y. pestis độc lực và không độc lực trong tự nhiên KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Phát triển thành công kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng thời B. anthracis và Y. pestis Phát triển thành cơng kỹ thuật mPCR tối ưu với 6 cặp mồi và chứng nội tại tái tổ hợp, cho phép xác định nhanh đồng thời B anthracis và Y. pestis, trong đó: 3 cặp mồi phát hiện 3 gen đặc hiệu của B. anthracis là vrrA, pagA, capA và 3 cặp mồi phát hiện 3 gen đặc hiệu của Y pestis là ypo2088, pla, caf1 trong kỹ thuật mPCR Chứng nội tái tổ hợp pJET1.2capAIC1 được bổ sung trong q trình tách chiết với nồng độ 5x104 copy/ mẫu để xác minh kết quả chẩn đốn, tránh hiện tượng âm tính giả Đánh giá thành công khả phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu chuẩn và các chủng phân lập Các bộ mẫu chuẩn được thiết lập gồm bộ mẫu chuẩn DNA độ nhạy, độ đặc hiệu riêng rẽ của B. anthracis, Y. pestis và bộ hỗn hợp B. anthracis và Y. pestis. Kỹ thuật mPCR có khả năng xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis độc lực đạt độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 100%, độ ổn định của kit hơn 12 tháng trên các bộ mẫu chuẩn Đã xác định trình tự đầy đủ gen đặc trưng vrrA (nhiễm sắc thể), các gen độc lực pagA, lef, cya (plasmid pXO1), capA, capB, capC (plasmid pXO2) của 10 chủng B. anthracis và gen đặc trưng ypo2088 (nhiễm sắc thể), gen độc lực pla (plasmid pPCP1), caf1 (plasmid pMT1) của 02 chủng Y. pestis Việt Nam. Các chủng B. anthracis và Y. pestis có tính ổn định cao, khơng có sự biến đổi đáng kể về trình tự nucleotide so với chủng tham chiếu. Kỹ thuật mPCR có khả năng xác định nhanh đồng thời B. anthracis và Y. pestis trên các chủng phân lập, cho phép phân biệt chủng đầy đủ độc lực với chủng không đầy đủ độc lực trong tự nhiên KIẾN NGHỊ Nghiên cứu thử nghiệm kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng thời B. anthracis và Y. pestis để đánh giá bổ sung trên mẫu thực địa, sẵn sàng sử dụng có tình tấn cơng sinh học và phòng chống dịch bệnh. ... thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis 2. Mục tiêu nghiên cứu Phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis. .. các cặp mồi cho kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng thời B. anthracis và Y. pestis Thiết kế, tối ưu kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng thời B anthracis và Y. pestis Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ. .. các chủng B. anthracis và Y. pestis 4. Đóng góp mới của luận án Luận án là cơng trình đầu tiên Việt Nam đã thành công trong nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời B. anthracis và