Nghiên cứu sản xuất enzyme protease tái tổ hợp trong hệ thống lên men quy mô pilot và thử nghiệm ứng dụng sản xuất nước chấm Ngày cập nhật: 26/03/2012 Đây là đề tài khoa học và công nghệ cấp tỉnh do Viện Tài nguyên Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế chủ trì thực hiện trong 2 năm (2010-2011). Đề tài này đã được Hội đồng Khoa học và Công nghệ tỉnh Thừa Thiên Huế nghiệm thu vào cuối tháng 2 vừa qua. Tổng quan về đề tài Enzyme là chất xúc tác sinh học đang được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Do đó, nhu cầu về enzyme ngày càng tăng do hiệu quả của chúng đem lại. Năm 1995, ước tính ngành công nghiệp enzyme thế giới thu được 1 tỷ USD, năm 2005 khoảng 1,7-2 tỷ USD. Châu Âu sản xuất 60% tổng số enzyme trên thế giới, số còn lại do Mỹ và Nhật Bản sản xuất. Trong các loại enzyme công nghiệp thì hydrolase chiếm lượng lớn nhất (75%), tiếp đến là carbonhydrolase. Enzyme vi sinh vật có nhiều ưu điểm hơn enzyme động vật và thực vật do chúng có hoạt tính thủy phân cao hơn và sản lượng lớn hơn. Bên cạnh đó, nguồn cung cấp enzyme này ổn định, không phụ thuộc theo mùa và vi sinh vật sinh trưởng nhanh trên môi trường đơn giản, rẻ tiền. Khoảng 2% vi sinh vật trên thế giới đã được thử nghiệm là có enzyme. Protease (còn gọi là proteinase hoặc peptidase) là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-) của chuỗi polypeptide. Chức năng của protease giống như con dao phân tử cắt những trình tự amino acid dài thành những đoạn ngắn. Quá trình này cần thiết cho sự tổng hợp, kiểm soát kích thước, thành phần, hình dạng của các phân tử protein và cuối cùng là phân hủy chúng. Protease chiếm khoảng 2% trong genome của người và 1-5% trong genome của côn trùng. Protease điều hòa hầu hết các quá trình sinh lý thông qua việc kích hoạt tổng hợp protein. Protease được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như động vật (gan, dạ dày…), thực vật (đu đủ, dứa…) và vi sinh vật (vi khuẩn, nấm…). Trong đó, enzyme vi sinh vật có vai trò to lớn trong các ngành sản xuất công nghiệp. Sử dụng enzyme trong sản xuất sẽ nâng cao chất lượng, hạ giá thành sản phẩm, cải thiện lao động và giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease từ vi sinh vật bằng con đường truyền thống chưa đáp ứng được việc mở rộng qui mô sản xuất và ứng dụng của nhóm enzyme này trong đời sống. Chính vì vậy, việc nghiên cứu cải thiện hoạt tính và tăng khả năng tổng hợp protease bằng các kỹ thuật hiện đại như tạo dòng và biểu hiện gen, thăm dò các điều kiện nuôi cấy tối ưu để sản xuất một lượng lớn enzyme này cho sản xuất là vấn đề cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn to lớn. Công nghệ DNA tái tổ hợp và kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật là cơ sở để sản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp như vaccine, hormone, cytokine và enzyme. Nhờ có những ưu điểm như chu kỳ sinh trưởng ngắn, có thể nuôi cấy trên môi trường đơn giản nên Escherichia coli là cơ thể vật chủ được sử dụng thường xuyên cho sự biểu hiện protein tái tổ hợp. Ở Việt Nam, chưa có nhiều công trình nghiên cứu sản xuất protease tái tổ hợp, sản xuất chế phẩm protease từ nguyên liệu tự nhiên ở quy mô công nghiệp cũng trong tình trạng tương tự. Các công trình nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc tách chiết enzyme này từ các nguồn tự nhiên (thực vật, động vật và vi sinh vật), khảo sát các tính chất lý-hóa và hoạt tính sinh học của chúng. Nhìn chung, sử dụng protease ở Việt Nam vẫn còn hạn chế do nguồn đáp ứng chưa đủ và thiếu ổn định. Trước đây, nhóm tác giả cũng đã thành công trong việc tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa npr C10 từ Bacillus subtilis C10 trong E. coli BL21 (DE3) nhờ hệ thống vector pET200/D-TOPO. Hoạt tính thủy phân protein thu được từ enzyme tái tổ hợp (NPRC10) rất cao và đây là cơ sở để chuyển qua giai đoạn tiếp theo, đó là sản xuất enzyme ở quy mô lớn hơn. Trong đề tài này, đối tượng nghiên cứu là chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp có chứa vector pET200/D-TOPO mang gen nprC10 (accession number: FJ822054 trên NCBI) mã hóa enzyme protease trung tính ngoại bào của chủng B. subtilis C10. E. coli BL21 (DE3) là chủng vi khuẩn thương mại không có độc tính, được sử dụng phổ biến trong biểu hiện gen ở prokaryote. Nội dung của đề tài là tập trung vào nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất enzyme protease tái tổ hợp từ vi khuẩn E. coli ở quy mô pilot như thăm dò môi trường nuôi cấy; chất cảm ứng, mật độ tế bào vào thời điểm cảm ứng, tốc độ khuấy trộn, tỷ lệ cấy giống…; nghiên cứu điều kiện bảo quản enzyme (bảo quản thô, bảo quản có phụ gia và bảo quản trong đệm); và thử nghiệm ứng dụng enzyme protease tái tổ hợp để sản xuất nước chấm từ bột đậu nành. Kết quả đạt được Với mục tiêu sản xuất được chế phẩm enzyme protease tái tổ hợp ở quy mô pilot, ứng dụng thành công enzyme protease tái tổ hợp để sản xuất nước chấm và đề xuất phương án sản xuất và hướng mở rộng ứng dụng tại Thừa Thiên Huế, sau 2 năm triển khai thực hiện, đề tài đã đạt được một số kết quả nhất định. Theo đó, đề tài đã xây dựng được quy trình sản xuất sinh khối chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp có chứa vector pET200/D-TOPO mang gen nprC10. Để sản xuất giống cấp 1, chủng E. coli được nuôi cấy qua đêm ở 37 o C trong bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường LB (0,5% dịch chiết nấm men, 1% tryptone và 1% NaCl, pH 7) có bổ sung 50 mg/l kanamycine, tỷ lệ cấy giống 2% (v/v) và tốc độ lắc 220 vòng/phút cho kết quả tốt nhất, OD 600 đạt 2,86 sau 15 giờ nuôi cấy. Nhân giống cấp 2 được thực hiện trong hệ lên men 14-l (BioFlo 110, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) chứa 4l môi trường LB, ở 37 o C trong 40 giờ, nồng độ chất chống tạo bọt (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) là 0,1%, tốc độ sục khí 2l/phút, tốc độ khuấy 300 vòng/phút và tỷ lệ cấy giống 2% (v/v) cho kết quả tốt nhất. OD 600 đạt 6,60 sau 40 giờ nuôi cấy. Thứ hai đó là sản xuất thành công enzyme NPRC10 ở quy mô pilot. Để sản xuất enzyme NPRC10, chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp được chuyển lên nuôi cấy trong hệ lên men 40-l (BioFlo 510, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, US) chứa 20l môi trường HSG cải tiến (3% glycerol, 0,7% dịch chiết nấm men, 1,35% tryptone, 0,014% MgSO 4 .H 2 O, 0,15% KH 2 PO 4 , 0,23% K 2 HPO 4 , 0,5% glycine và 1,5% tinh bột tan) ở nhiệt độ 37 o C, tỷ lệ cấy giống 2%. Trong quá trình sản xuất enzyme, pH 7 của môi trường luôn được duy trì bằng cách bơm tự động các dung dịch H 3 PO 4 3M và NaOH 3M. Các thông số của quá trình lên men bao gồm tốc độ khuấy trộn 500 vòng/phút và tốc độ sục khí 5l/phút, chất chống tạo bọt (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) là 0,1%. Khi mật độ tế bào ở hệ lên men 40-L đạt OD 600 = 2, nhiệt độ trong hệ lên men được giảm xuống 20 o C, bổ sung 10 mM Ca 2+ và nồng độ lactose từ 0,5% để cảm ứng sinh enzyme NPRC10. Enzyme NPRC10 có HĐC cao nhất là 75,99 unit/ml sau 34 giờ cảm ứng. Thứ ba, xây dựng được quy trì bảo quản chế phẩm enzyme NPRC10 trong khoảng thời gian 6 tháng. Đối với dịch enzyme thô, chế phẩm được bảo quản tốt nhất ở -30 o C khi có bổ sung 10% glycerol, HĐC còn lại sau 6 tháng là 77%. Đối với bảo quản chế phẩm khô, 100ml dung dịch enzyme thô được kết tủa với ammonium sulphate bão hòa 60% ở 4 o C trong 2 giờ, sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 o C để thu kết tủa. Bổ sung vào kết tủa phụ gia bột gạo (tỷ lệ 1:4) sau đó hỗn hợp được đông khô bằng máy Micro Modulyo (Thermo Savant, USA) đến khối lượng không đổi. Chế phẩm enzyme khô được bảo quản ở nhiệt độ phòng, HĐC còn lại sau 3 tháng là 91,1%. Đối với bảo quản trong đệm, enzyme thô sau khi kết tủa như trên được hòa tan trở lại trong 20ml đệm (50 mM Tris.HCl, 1 mM DTT, 100 mM NaCl và 10 mM MgCl2, pH 7,9). Chế phẩm enzyme tinh sạch giữ được 86% HĐC sau 6 tháng bảo quản ở -30 o C. Thứ tư, thử nghiệm thành công sản xuất nước chấm từ bột đậu nành. Quy trình thực hiện như sau: nguyên liệu bột khô đậu nành được xử lý bằng cách trộn với nước theo tỷ lệ 1g bột/10ml nước, đun sôi rồi sau đó để nguội về nhiệt độ phòng, ly tâm 14.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ dịch. Sau đó, bột khô đậu nành đã xử lý (600g) được trộn với 50ml chế phẩm enzyme thô (khoảng 3.500 unit) và bổ sung nước cất đến 8,5l. Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ 50 o C và pH 6,5 trong 2,5 giờ, tốc độ khuấy trộn trong quá trình ủ từ 300 vòng/phút. Sau khi xử lý bằng enzyme, phần bã đậu nành còn lại tiếp tục được xử lý bằng HCl, sau đó bổ sung các chất phụ gia để tạo thành nước chấm. Sản phẩm nước chấm thử nghiệm đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm. Đối với tỉnh Thừa Thiên Huế, chế phẩm enzyme NPRC10 có thể ứng dụng vào các lĩnh vực như sản xuất nước chấm từ đậu nành hoặc đậu phụng, xử lý vỏ tôm để thu chitin dùng trong sản xuất glucosamine và có thể bổ sung vào trong khẩu phần thức ăn chăn nuôi. http://luanvan.co/luan-van/cac-buoc-san-xuat-enzyme-protease-tai-to- hop-tu-chung-bacillus-san-pham-viet-nam-biet-tren-genbank-co-mot-so-trinh- tu-ma-2248/ Đóng góp mới của đề tài Các kết quả trên thế giới tại thời điểm công bố: Tạo dòng và biểu hiện thành công enzyme protease trong E. coli và các loại vật chủ khác; sản xuất enzyme protease ở quy mô pilot; ứng dụng protease trong một số ngành công nghiệp như chế biến thực phẩm, sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, xử lý môi trường . Kết quả nghiên cứu của đề tài đã kế thừa những thành tựu đạt được trên thế giới để áp dụng vào Việt Nam (chưa có công trình tương tự được công bố tại Việt Nam). Đề tài thực hiện dựa trên gen nprC10 có nguồn gốc từ chủng Bacills subtilis được phân lập tại Thừa Thiên Huế, do đó thích hợp cho những ứng dụng trực tiếp tại địa phương. Từ kết quả đã đạt được, đề tài đã đưa ra được quy trình sản xuất enzyme NPRC10 có thể áp dụng trong thực tế đồng thời đề xuất các hướng ứng dụng của enzyme này trên địa bàn Thừa Thiên Huế. Đề tài cũng mở ra hướng mới cho việc sản xuất các enzyme tái tổ hợp khác ngay trên địa bàn Thừa Thiên Huế. Trong tương lai, các nghiên cứu sâu hơn về ứng dụng của enzyme này sẽ được thực hiện, góp phần nâng cao hiệu quả trong công nghiệp sản xuất nước chấm, thức ăn chăn nuôi, sản xuất glucosamine đồng thời góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường do sản xuất công nghiệp gây ra. PGS. TS Nguyễn Hoàng Lộc (skhcn.thuathienhue.gov.vn) . Nghiên cứu sản xuất enzyme protease tái tổ hợp trong hệ thống lên men quy mô pilot và thử nghiệm ứng dụng sản xuất nước chấm Ngày cập nhật:. tiêu sản xuất được chế phẩm enzyme protease tái tổ hợp ở quy mô pilot, ứng dụng thành công enzyme protease tái tổ hợp để sản xuất nước chấm và đề xuất