Đang tải... (xem toàn văn)
Toxocariasis là bệnh giun đũa chó/mèo lây từ thú sang người rất phổ biến, do ấu trùng giun đũa Toxocara canis (T. canis) hay Toxocara cati (T. cati) gây ra.
Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 46 Thiết lập qui trình ni ấu trùng giun đũa chó Toxocara canis Hồ ăng Minh Nhựt1, Nguy n Thị Kê2, Võ Doãn Trung1, Phan Thị Ngọc iệp3, Nguy n H u Hùng1,* Khoa Công nghệ Sinh học M i trường i học Nguy n Tất Thành Khoa Y i học Nguy n Tất Thành Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học i học Khoa học Tự nhiên i học Quốc gia TP HCM * nhhung@ntt.edu.vn Tóm tắt Toxocariasis bệnh giun đũa chó/mèo l y từ thú sang người phổ biến, ấu trùng giun đũa Toxocara canis (T canis) hay Toxocara cati (T cati) gây Chẩn đoán nhi m Toxocara spp phụ thuộc vào việc phát kháng thể kháng protein dịch xuất/tiết ấu trùng giun đũa Kể từ nghiên cứu De Savigny, nhiều tiến phương pháp nghiên cứu thực phương pháp thường khó thực hiện, tốn cho nhiều kết khác Nghiên cứu đề xuất phương pháp đơn giản hiệu để thu nhận tối đa trứng Toxocara canis thụ tinh Nu i giun trưởng thành m i trường dinh dưỡng để thu trứng, sau – ngày nu i giun mổ để tận thu trứng từ tử cung Sau tháng ấp trứng, ấu trùng bên trứng kích nở nhờ CO2 sinh từ phản ứng hoá học m i trường HBSS (Hank‟s Balanced Salt Solution) Ấu trùng sau lọc qua r y có đường kính lỗ 40µm để thu ấu trùng sống Kết cho thấy tỉ lệ ấu trùng hình thành ph i phương pháp nu i (82.5%) cao so với phương pháp mổ (40%) Phương pháp cho hiệu cao so với phương pháp De Savigny phương pháp khác theo ba cách: (i) tăng tối đa lượng ấu trùng thu được, (ii) cải thiện khả tinh s ch ấu trùng, (iii) giảm đáng kể thời gian công sức thực Protein xuất/tiết T canis có dịch ni cấy phân tích phương pháp điện di SDS – PAGE cho thấy có 17 protein phát Các protein có trọng lượng phân tử từ 19 đến 498,5kDa protein 33,1kDa thành phần chiếm tỉ trọng cao Nhận 20.09.2018 ược duyệt 18.02.2019 Cơng bố 26.03.2019 Từ khóa Toxocariasis, T canis, ấu trùng L2, kháng nguyên xuất/tiết, dịch E/S ® 2019 Journal of Science and Technology - NTTU Giới thiệu Bệnh giun đũa chó/mèo người Wilder mô tả lần đầu năm 1950 phát ấu trùng giun tròn u h t võng m c (retinal granuloma) Sau Beaver cộng (1952) lần dùng thuật ng “ấu trùng di chuyển nội t ng” (visceral larva migrans) để báo cáo lo t ca bệnh trẻ em có b ch cầu toan tăng cao máu, kèm với đau nhiều kéo dài nhiều quan làm sinh thiết phát ấu trùng T canis hay T cati Người bị nhi m ăn phải thức ăn nước uống có trứng chứa ấu trùng tiếp xúc nơi có trứng Ấu trùng bên trứng nở ruột non, xuyên qua ruột non vào máu theo dòng máu di chuyển đến quan khác thể gan não mắt, hệ thần kinh gây nhiều tổn thương như: ấu trùng di chuyển nội t ng, ấu trùng di chuyển mắt ấu trùng di chuyển đến não Chẩn đoán nhi m ấu trùng Toxocara spp thường thực xét nghiệm huyết mi n dịch tìm kháng thể đặc hiệu Đại học Nguyễn Tất Thành kháng kháng nguyên ấu trùng t o trình di chuyển Nhằm thu nhận lượng lớn nguồn nguyên liệu kháng nguyên xuất/tiết (E/S) có chất lượng cao phục vụ việc xét nghiệm, chẩn đoán bệnh nhi m giun đũa chó T canis, chúng tơi tiến hành nuôi lượng lớn ấu trùng T canis thời gian dài ể đ t mục tiêu này, cần phải thu thập lượng lớn trứng thụ tinh từ nh ng giun đũa trưởng thành Tuy nhiên, phương pháp mô tả trước đ y cho thấy tốn nhiều thời gian, nhân công, tỉ lệ nhi m cao Nghiên cứu trình bày phương pháp biến đổi, có hiệu đáng kể việc thu nhận ấu trùng giun đũa dùng nu i cấy thu kháng nguyên E/S Vật liệu phương pháp 2.1 Thu nhận giun trưởng thành T canis trưởng thành thu nhận từ ruột non nh ng chó (3 – tháng tuổi) (n= 45) t i khu vực Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số quận 12 Củ Chi Chó xác định nhi m giun đũa T canis phương pháp soi tìm trứng giun đũa ph n Chó gây mê Ketamin với liều 1ml/kg thể trọng R ch đường thẳng từ gi a bụng đến gần gi a lồng ngực, cho vị trí cắt trùng với đường trắng bụng Dùng kéo để thu nhận toàn phần ruột non ể thu giun trưởng thành, dùng tay vuốt dọc thân ruột cho toàn giun dồn phần đầu ruột, nhẹ nhàng gắp giun trưởng thành kẹp Sau dùng kéo cắt dọc phần ruột non để tận thu giun sót l i ể lo i bỏ làm giảm khả nhi m khuẩn giun rửa nhiều lần dung dịch PBS pH 7,0 bổ sung 1% formandehyde (FPBS) Sử dụng cọ vẽ để làm s ch giun lo i bỏ nh ng mảnh bám thân 2.2 Chuẩn bị trứng thụ tinh Có phương pháp dùng để thu trứng từ giun đũa gồm phương pháp nu i phương pháp mổ giun (Rodriguez - Caballero, Aarón, 2007) Nghiên cứu áp dụng hai phương pháp Phương pháp 1: Nu i giun dung dịch PBS vô trùng bổ sung 1% huyết thanh, 2% glucose, 5% CO2 37oC Sau - ngày nuôi, giun kiệt sức chết Thu trứng sau – ngày nuôi Trứng Toxocara li tâm, rửa ủ dung dịch F-PBS tháng ấu trùng hình thành bên trứng Phương pháp 2: Giun sau nu i giải phẩu thu tử cung cách sử dụng kính hiển vi soi dao mổ, r ch tử cung để lấy trứng Trứng sau ủ tháng dung dịch F-PBS để hình thành ấu trùng Quan sát theo dõi thường xuyên phát trứng t o phơi Sau trứng đếm cách cho mẫu trứng vào đĩa nhựa ELISA d ng 96 giếng đáy soi kính hiển vi soi ngược Tính tỉ lệ trứng hình thành phơi theo cơng thức sau: ∑ Tp: Số trứng hình thành phơi ∑ : Tổng số trứng hình thành ph i kh ng hình thành ph i 2.3 Ấp nở trứng mang phôi Ủ trứng với dung dịch NaClO 6% khử trùng phút nhiệt độ phòng Sau trứng ủ dung dịch HBSS pH 2,0 (HBSS; 5,4mM KCl; 0,3mM Na2HPO4; 0,4mM KH2PO4; 1,3mM CaCl2; 0,5mM MgCl2·6H2O; 0.6mM MgSO4 7H2O; 137mM NaCl) 30 phút 37oC HBSS trước dùng chỉnh pH = 7,4 sodium bicarbonate sau chỉnh pH 2,0 10N hypochloride acid Cuối cùng, ủ trứng m i trường DMEM 37oC CO2 5% nở hoàn toàn Khảo sát ấu trùng sau nở trứng đếm tính hiệu ấp nở theo cơng thức sau: Trong đó: - Ed: số ấu trùng chết nằm trứng; 47 - Ll: số ấu trùng sống (di chuyển); - Ld: số ấu trùng chết (không di chuyển); - Ep: số ấu trùng sống nằm trứng 2.4 Tinh s ch ấu trùng L2 Lọc ấu trùng khỏe m nh rây lọc tế bào (cell strainer) có đường kính lỗ 40µm 2.5 Nuôi ấu trùng Nuôi ấu trùng m i trường dinh dưỡng DMEM, bổ sung kháng sinh penicillin (100U/ml) streptomycin (100ug/ml) Tỉ lệ 1.000 ấu trùng/ml 2.6 Thu nhận kháng nguyên xuất/tiết (E/S) ấu trùng Toxocara canis Dịch E/S thu nhận định kì tuần 80% lượng mơi trường thu nhận Sau lượng môi trường bổ sung tương ứng với lượng lấy ể lo i bỏ hết cặn lắng, dịch tiết li tâm qua màng lọc có đường kính lỗ 0,45µm Dịch ni ấu trùng sau lọc bổ sung dung dịch NaN3 (nồng độ cuối 0,05 %) gi -20oC 2.7 ịnh lượng phương pháp Bradford Dùng thuốc nhuộm Coomassie Briliant Blue G-250 xây dựng đường chuẩn BSA ộ hấp phụ quang học đo máy Sunrise bước sóng 595nm Phương trình y = ax + b đường chuẩn tính tốn phần mềm Magellan dùng để tính lượng protein E/S mẫu Trong y giá trị OD595 x lượng protein 2.8 Phân tích thành phần protein dịch tiết Toxocara canis điện di SDS – PAGE 10% Protein E/S T.canis phân tích phương pháp điện di gel polyacrylamide 10% có diện sodium dodecyl sulfate (SDS) Kháng nguyên E/S (200µg/giếng) xử lý với β-mercaptoethanol, nhiệt độ 100oC 30 phút Mẫu protein điện di 300V, 10mA 40 phút gel gom 20mA gel tách Thang chuẩn sử dụng kèm để xác định trọng lượng phân tử protein sau điện di Sau điện di protein gel phát phương pháp nhuộm b c xác định trọng lượng phân tử phần mềm Quantity One Kết 3.1 Xét nghiệm chó bị nhi m giun đũa Toxocara canis Hình Trứng giun đũa vật kính 40X a số chó bị nhi m giun có biểu bụng to, tròn (khác với bụng ăn no) ăn sức khỏe yếu, mắt đổ ghèn, ph n thường có dấu hiệu sệt lỏng, số trường hợp Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 48 giun thải ngồi theo đường phân có dịch nơn mửa Kết xét nghiệm (Hình 1) cho thấy 100% chó phát nhi m trứng lo i kí sinh trùng Trong đó, tỉ lệ nhi m giun đũa T canis 95,5% (43/45 chó phát trứng giun đũa ph n) 3.2 Thu nhận giun đũa trưởng thành Xác định phần ruột non chó có giun cách vuốt dọc theo thân ruột phát giun cộm lên Trường hợp chó bị nhi m giun nặng, số lượng giun trưởng thành nhiều, dày đặc, phân bố khắp phần ruột, xác định mắt thường Dùng kéo thu đo n ruột non có giun Dùng mũi kéo cắt dọc theo thành ruột nhẹ nhàng Trong trình thao tác phải xác cẩn thận để tránh cắt nhầm giun trưởng thành (Hình 2) Hình Thu nhận giun trưởng thành từ ruột non A, Giun đũa trưởng thành cộm lên thành ruột, nhìn thấy mắt thường B Giun trưởng thành dồn đầu ruột cách vuốt dọc thân ruột C, Sử dụng mũi kéo cắt dọc thân ruột để tận thu nh ng giun sót l i Giun đũa trưởng thành sau thu nhận từ ruột non làm s ch đo kích thước xác định giới tính (Hình 3) Kết cho thấy, chiều dài trung bình giun đũa đực khoảng – 8cm Giun trưởng thành dài to có chiều dài lên đến 20cm (Hình 3B) Việc xác định giới tính nhờ vào hình d ng đu i giun: có móc đực khơng có móc (Hình 4) Hình Xác định T canis phương pháp hình thái học A, ầu T canis với hai lằn gợn hai bên B u i giun đực có móc nhỏ C u i giun đũa có đầu tù 3.3 Chuẩn bị trứng thụ tinh Kết cho thấy, với phương pháp nu i có khoảng 82.5% trứng hình thành phôi, so với phương pháp mổ 40% Tỉ lệ trứng hình thành ph i phương pháp nu i cao so với phương pháp mổ H Sự hình thành ấu trùng L2 bên trứng sau tuần ấp trứng Trứng có ấu trùng di động bên Ảnh chụp kính hiển vi soi ngược 3.4 Ấp nở tinh lọc ấu trùng L2 khỏe m nh Sau ấp nở đa số ấu trùng bên trứng ngồi, nh ng ấu trùng yếu chết khơng thể khỏi vỏ trứng M i trường nuôi ấu trùng không bị nhi m nấm vi sinh Sau tinh lọc ấu trùng, nhận thấy 100% ấu trùng chui qua khỏi màng lọc (Hình 6) Hình Ấu trùng L2 sau ấp nở H Xác định chiều dài giun trưởng thành A, Chiều dài giun trưởng thành lên đến 20cm B, Chiều dài trung bình giun đũa đực khoảng – 8cm Giun trưởng thành có chiều dài 15 – 20cm Đại học Nguyễn Tất Thành 3.5 Thu nhận phân tích protein tiết ấu trùng L2 M i trường sau ni cấy thẩm tích protein định lượng phản ứng Bradford Kết cho thấy, nồng độ protein E/S đ t 23,2µg/ml Bằng phương pháp điện di nhuộm b c, có 15 v ch phát hiện, cho thấy dịch E/S có đa d ng thành phần Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số protein (Hình 7) Sử dụng phần mềm phân tích Quantity One, protein ước tính có phân tử lượng từ 19,5kDa đến 111,1kDa Trọng lượng phân tử trung bình protein E/S T canis xác định phần mềm GraphPad Prism Hình Phân tích thành phần protein E/S dịch ni cấy ấu trùng sau tuần liên tiếp SDS-PAGE A, 200ng protein n p vào giếng nồng độ gel 10%; B, 0,8µg 1,6µg protein E/S sau c đặc li tâm lọc n p vào giếng nồng độ gel 10% Sử dụng phương pháp nhuộm b c Phân tử lượng protein mẫu tính tốn phần mềm Quantity One Trong số protein này, bật thành phần 33,1kDa chiếm tỉ trọng cao dịch E/S Phân tích phân tử lượng protein gel cho thấy có hai nhóm protein có trọng lượng phân tử nằm gần nhau: nhóm có trọng lượng phân tử thấp (gồm protein từ 30,9kDa đến 34,5kDa), nhóm có trọng lượng phân tử cao (gồm protein từ 97,2kDa đến 111,1kDa) Dịch E/S sau cô đặc phân tích SDS-PAGE cho thấy có 17 protein phát có trọng lượng phân tử từ 19 đến 498,5kDa protein 33,1kDa thành phần chiếm tỉ trọng cao Thảo luận Nghiên cứu trước đ y cho thấy việc nu i giun trưởng thành T canis (giun đực giun chung với nhau) để thu trứng, cho phép thu nhiều trứng với tỉ lệ trứng thụ tinh cao Ngược l i, phương pháp mổ tử cung giun để thu trứng cho số trứng trứng non kh ng thụ tinh nhiều Trong nghiên cứu này, kết hợp ni giun sau mổ giun để tận thu trứng, vậy, tổng số lượng ấu trùng thu tăng đáng kể Trong trình nu i giun đực chung, giun đẻ khoảng 31 nghìn trứng, 82,5% trứng phát triển thành ấu trùng Sau đó, giun kiệt sức chúng bị mổ để tận thu trứng sót l i tử 49 cung với số lượng trứng so với với số trứng mà chúng đẻ nuôi Chỉ 40% số trứng tận thu phát triển thành phơi Q trình ấp nở ấu trùng L2 cách sử dụng HBSS pH 2,0 tỏ phức t p so với cách công bố[5] CO2 sinh từ phản ứng gi a HCl sodium bicarbonat giúp kích nở ấu trùng tốt Bước q trình kích nở phản ứng trung hòa pH acid tồn trứng rửa với m i trường DMEM Nh ng thay đổi đột ngột tương tự điều kiện môi trường ruột non vật chủ làm tăng tỉ lệ ấu trùng thoát khỏi màng bao trứng Nghiên cứu áp dụng qui trình kích nở Kết cho thấy ấu trùng kích nở cách hiệu Trong nhiều nghiên cứu trước đ y để tinh s ch ấu trùng người ta thường áp dụng phương pháp Baerman[3] Theo ấu trùng lọc qua lớp vải g c đặt ph u có chứa m i trường dinh dưỡng Ấu trùng di chuyển xuống đáy ph u đặt m i trường ấm Tuy nhiên, nhiệt độ h trình thực hiện, ấu trùng yếu trở nên di động chậm, ra, khả nhi m khuẩn cao Nghiên cứu sử dụng phương pháp Baermann biến đổi, ấu trùng lọc qua rây lọc tế bào có đường kính lỗ 40µm Trong suốt q trình thực hiện, tồn thiết bị đặt tủ ấm 37oC đảm bảo cho di chuyển ấu trùng xuống đáy phương pháp lọc đơn giản, khơng gây nhi m Sau q trình lọc, ấu trùng thu nh ng ấu trùng khỏe m nh di động tốt Nh ng ấu trùng chết, yếu trứng chưa hình thành ph i gi l i bên Nghiên cứu khơng hồn toàn thống với nh ng nghiên cứu trước đ y[4] Trong nghiên cứu này, có số v ch xuất gel nghiên cứu Page khơng Nh ng khác biệt khác điều kiện thí nghiệm khác loài T canis phân bố nh ng khu vực địa lí khác cần có nhiều nghiên cứu s u vấn đề Kết luận Nghiên cứu xác định hình thái giun đũa chó Toxocara canis, giới tính đực/cái, trứng giun ni thành cơng ấu trùng giun đũa chó T canis để thu nhận protein E/S phục vụ cho ứng dụng chẩn đốn bệnh người Ngồi ra, nghiên cứu xác định dịch E/S SDS-PAGE gồm 17 thành phần protein protein 33 1kDa chiếm tỉ trọng lớn Lời cảm ơn Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ NTTU đề tài mã số 2017.01.50/ H KHCN Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 50 Tài liệu tham khảo Beaver PC, Snyder CH, Carrera GM, Dent JH & Lafferty JW (1952) Chronic eosinophilia due to visceral larva migrans: report of three cases Pediatrics, 9, – 19 Beaver PC (1956) Larva migrans Exp Parasitol., 5, 587 – 621 Dickson Despommier (2003) “Toxocariasis: Clinical Aspects Epidemiology Medical Ecology and Molecular Aspects” Clinical microbiology reviews, 16 (2), 265 – 272 Page A.P et al (1991) “Comparison of isolates and species of Toxocara and Toxocarasis by biosynthestic labelling of somatic and ES protein from infective larvae” Parasitology 103 Pt 3, pp 451 – 66 Ponce-Macotela Martha et al (2011) “A Simplified method for hatching and isolating Toxocara canis larvae to facilities excretory-secretory antigen collection in vitro” Veterinary Parasitology 175(3 - 4), pp 382 – 385 Rodríguez-Caballero Aarón et al (2007) “A simple and inexpensive in vitro method for retrieving fertilized Toxocara canis eggs” pp 829 – 832 The process establishment of raising Toxocara canis Ho Dang Minh Nhut1, Nguyen Thi Ke2, Vo Doan Trung1, Phan Thi Ngoc Diep3, Nguyen Huu Hung1,* Faculty of Biotechnology and Environment, Nguyen Tat Thanh University Faculty of Medicine, Nguyen Tat Thanh University Faculty of Biology and Biotechnology, Ho Chi Minh University of Science, Vietnam National University HCMC * nhhung@ntt.edu.vn Abstract Toxocariasis is a prevalent zoonotic disease which is caused by Toxocara canis larvae or Toxocara cati larvae Diagnosis of human toxocariasis depends on antibody detection against excretions–secretions (E/S) from Toxocara larvae Since the earliest work of De Savigny, describing the hatching methods and culturing Toxocara larvae, few advances in the method have been made, but those methods are difficult to follow, expensive and have different results In this work, we propose a simple and effective method for maximizing fertilized Toxocara canis eggs Adult worms were cultured in medium to collect fertilized eggs, after 5-7 days, eggs were obtained using uterus excision method The larvae inside the eggs will be triggered by CO2 produced by the HBSS reaction The larvae were then filtered through 40μl diameter sieve to collect larvae The results showed that the proportion of fertilized eggs from culture method (82.5%) is higher than that of those obtained using uterus excision method (40%) This method proved more effective than the original De Savigny method in three ways: (i) Maximizing the number of larvae collected, (ii) improving the larval purity, and (iii) markedly reducing the execution time and labours of the protocol E/S Toxocara canis proteins were analyzed by SDS-PAGE electrophoresis , showing at least 17 proteins detected These proteins have molecular weights from 19.5 to 498.5 kDa and the 33.1 kDa protein has the highest proportion Keywords Toxocariasis, T Canis, Larvae L2, excretion/secretion antigens, E/S product Đại học Nguyễn Tất Thành ... di chuyển); - Ep: số ấu trùng sống nằm trứng 2.4 Tinh s ch ấu trùng L2 Lọc ấu trùng khỏe m nh rây lọc tế bào (cell strainer) có đường kính lỗ 40µm 2.5 Ni ấu trùng Ni ấu trùng m i trường dinh... nghiệm chó bị nhi m giun đũa Toxocara canis Hình Trứng giun đũa vật kính 40X a số chó bị nhi m giun có biểu bụng to, tròn (khác với bụng ăn no) ăn sức khỏe yếu, mắt đổ ghèn, ph n thường có dấu hiệu... giun sau mổ giun để tận thu trứng, vậy, tổng số lượng ấu trùng thu tăng đáng kể Trong trình nu i giun đực chung, giun đẻ khoảng 31 nghìn trứng, 82,5% trứng phát triển thành ấu trùng Sau đó, giun