Đang tải... (xem toàn văn)
Salmonella (Salm) là vi khuẩn phổ biến gây ngộ độc thực phẩm, với hàng triệu ca nhiễm khuẩn hàng năm trên thế giới và có hàng trăm nghìn người chết. Salm có hơn 2.500 typ huyết thanh khác nhau, trong đó, Salmonella Typhimurium (ST) là một trong hai typ chính gây ngộ độc thực phẩm cho người. ST là typ huyết thanh kháng kháng sinh mạnh nhất hiện nay, nó gây thiệt hại cho ngành chăn nuôi và ảnh hưởng tới sức khỏe cộng đồng.
TAPgiá CHI HOC 39(2): 210-218 Đánh SINH biểu một2017, số gen kháng thuốc DOI: 10.15625/0866-7160/v39n2.9370 ĐÁNH GIÁ SỰ BIỂU HIỆN MỘT SỐ GEN KHÁNG THUỐC CỦA CHỦNG VI KHUẨN Salmonella Typhimurium PHÂN LẬP TỪ THỊT LỢN TƯƠI Ở HÀ NỘI Nguyễn Thị Hoài Thu1, Nguyễn Thanh Việt2, Nguyễn Thị Nhã Quyên3, Nghiêm Ngọc Minh1, Võ Thị Bích Thủy1* Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trung tâm ứng dụng sinh y dược, Học viện Quân y Phòng Y tế huyện Phú Bình, tỉnh Thái Ngun TĨM TẮT: Salmonella (Salm) vi khuẩn phổ biến gây ngộ độc thực phẩm, với hàng triệu ca nhiễm khuẩn hàng năm giới có hàng trăm nghìn người chết Salm có 2.500 typ huyết khác nhau, đó, Salmonella Typhimurium (ST) hai typ gây ngộ độc thực phẩm cho người ST typ huyết kháng kháng sinh mạnh nay, gây thiệt hại cho ngành chăn nuôi ảnh hưởng tới sức khỏe cộng đồng Thực phẩm có nguồn gốc động vật, đặc biệt thịt lợn từ lâu cơng nhận nguồn lây truyền Salm người Trong nghiên cứu này, ba chủng ST gây ngộ độc thực phẩm phân lập từ thịt lợn tươi Hà Nội có khả kháng 100% với ampicillin, streptomycin tetracyclin, 66,67% với chloramphenicol sulfamethoxazol/trimetoprim, kháng 33,33% với gentamycin Ngoài ra, 100% chủng ST nghiên cứu phát bảy kiểu gen (gồm aadA, avrA, gyrB, prmA, sul II, tetA blaTEM/TEM) đại diện cho bảy kiểu hình kháng kháng sinh khác Mức độ biểu bảy gen so với gen đối chứng 16S rRNA chiếm tỷ lệ cao 65% Sự xuất kiểu gen kháng thuốc chủng ST gây ngộ độc thực phẩm phân lập từ thịt lợn điều đáng lo ngại người sử dụng thực phẩm nhiễm chủng vi khuẩn hệ gen xâm nhập vào hệ gen người dẫn đến kháng thuốc người Từ khóa: Salmonella Typhimurium, gen kháng kháng sinh, thịt lợn tươi MỞ ĐẦU Salmonella enterica mầm bệnh thực phẩm phổ biến làm cho hàng triệu trường hợp bị viêm dày ruột, hàng nghìn bệnh nhân phải nhập viện chí chết năm giới (Pui et al., 2011; Hur et al., 2012) Năm 1990 bắt đầu xuất Salmonella (Salm) kháng thuốc tỷ lệ kháng thuốc từ đến không ngừng tăng lên trở thành mối đe dọa nghiêm trọng tới sức khỏe cho người Trong nhiều thập kỷ qua, việc lạm dụng kháng sinh chăn ni, điều trị phòng bệnh giới tạo nhiều loài vi khuẩn kháng thuốc (Zdziarski et al., 2003) Thịt gia súc, gia cầm sản phẩm từ chúng xem nguyên nhân nguồn chứa quan trọng Salm gây bệnh cho người (Adzitey et al., 2012) Do việc sử dụng kháng sinh tràn lan cho gia súc, gia cầm để kích thích tăng trưởng ngăn ngừa 210 bệnh tật làm tăng nhanh chóng chủng Salm kháng thuốc người động vật điều trở thành vấn đề nghiêm trọng sức khỏe toàn cầu (Yang et al., 2010) Trong năm gần đây, nghiên cứu chủng Salm phân lập Việt Nam nước khác cho thấy, kháng thuốc chủng Salm ngày tăng (Van et al., 2007; Vo et al., 2010; Yang et al., 2010; Wannaprasat et al., 2011) Trong loài Salm, serovar Enteritidis Typhimurium hai loài phổ biến gây bệnh truyền từ động vật sang người Ở Việt Nam, kháng kháng sinh tìm thấy vi khuẩn phân lập từ người, có Salmonella enterica serovar Typhimurium mầm bệnh khác gây tiêu chảy (Isenbarger et al., 2002; Ehara et al., 2004; Nguyen et al., 2016) Nghiên cứu mẫu thịt lợn cho thấy tỷ lệ nhiễm Salm cao miền Bắc, Việt Nam (39,6%) (Thai & Yamaguchi, 2012), Nguyen Thi Hoai Thu et al Sài Gòn (69,7%) (Nguyen et al., 2016), Lào (34,6%), Thái Lan (47,4%) (Sinwat et al., 2016), có nhiều Salmonella serovars xác định, có Salmonella serovars Typhimurium Bên cạnh chủng Salm có khả kháng cao với nhiều loại kháng sinh tetracycline (53.3%), ampicillin (43,8%), chloramphenicol (37,5%), and trimethoprim/sulfamethoxazole (31,3%) (Nguyen et al., 2016) Các chủng Salm phân lập báo cáo Yang (2010) kháng với sulfamethoxazole (67%), trimethoprim/sulfamethoxazole (58%), tetracycline (56%), nalidixic acid (35%), ciprofloxacin (21%) ceftriaxone (16%) (Yang et al., 2010) Các chủng Salm gây ngộ độc thực phẩm có khả kháng thuốc mối lo ngại an toàn thực phẩm sức khỏe người Vì nghiên cứu tập trung xác định tính kháng thuốc chủng Salmonella Typhimurium (ST) phân lập từ thịt lợn tươi bán lẻ số chợ Hà Nội, tìm kiếm số gen đại diện cho tính kháng kháng sinh đánh giá biểu gen VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Ba typ ST kí hiệu S181, S361và S384 phân lập từ thịt lợn tươi số chợ Hà Nội Phòng Hệ gen học Vi sinh, Viện Nghiên cứu Hệ gen cung cấp Các loại khoanh giấy kháng sinh BioRad (France) gồm: ampicillin 10µg, ceftazidime 30µg, gentamycin 10µg, streptomycin 10µg, ciprofloxacin 5µg, chloramphenicol 30 µg, tetracyclin 30 µg, sulfamethoxazol/trimetoprim 23/75 µg, colistin 10 µg polymycin B 300 units Các loại hóa chất dùng tách chiết RNA (bộ kít RNeasy Mini, Qiagen, Đức), tổng hợp cDNA (bộ ProtoScript® First Strand cDNA Synthesis Kit, New England Biolabs, Hoa Kỳ), thành phần chạy phản ứng PCR (Thermo Scientific, Hoa Kỳ) Kiểm tra tính kháng kháng sinh Ba typ ST làm kháng sinh đồ khoanh giấy theo phương pháp Kirby - Bauer (Bauer et al., 1966) Pha hỗn dịch vi khuẩn nồng độ 0,5 McF, cấy lên bề mặt đĩa thạch Muller-Hilton Đặt khoanh giấy kháng sinh lên đĩa thạch, sau đem nuôi tủ ấm 37oC 24 Đo đường kính vơ khuẩn so sánh với tiêu chuẩn đánh giá Viện Tiêu chuẩn lâm sàng phòng thí nghiệm Hoa Kỳ (The Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI: 2015) Tách chiết RNA tổng số Ba typ ST nuôi cấy lại môi trường thạch dinh dưỡng Nutrient Agar (Sigma, Hoa Kỳ) Tăng sinh môi trường Brain Heart Infusion Broth (BHI) (Sigma, Hoa Kỳ) để thu canh khuẩn đạt nồng độ 108 dùng tách RNA Quy trình tách RNA tổng số thực theo hướng dẫn kít RNeasy Mini (Qiagen, CHLB Đức) RNA tổng số điện di kiểm tra gel agarose 1% đo nồng độ, độ tinh máy Nanodrop bước sóng 260 nm 280 nm Mẫu RNA thu bảo quản tủ âm 80oC Phương pháp phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR) Đầu tiên, tiến hành tổng hợp cDNA sau: Hiệu chỉnh mẫu RNA đạt nồng độ µg/ µl Biến tính RNA nhiệt độ 75oC/ phút, lấy đặt vào hộp đá phút Chuẩn bị hỗn hợp cDNA gồm: X buffer (4 µl); 0.1M DTT (4 µl); dNTP (2 µl); Random Primer (2 µl); RNase Inhibitor (0,5 µl); M MLV-RT (1 µl) Lượng tính cho mẫu Cho 11,8 µl hỗn hợp cDNA + 8,5 µl mẫu RNA hiệu chỉnh (nồng độ µg/ µl) Ủ nhiệt độ 37oC/ 60 phút Biến tính nhiệt độ 95oC/ phút, lấy đặt vào hộp đá bào phút Sản phẩm cDNA bảo quản -20oC RT-PCR: Phản ứng RT-PCR thực với thành phần nồng độ sau: 1X đệm PCR (đã bao gồm 1,5 mM MgCl2, 200 µM dNTPs, pmol mồi, U Taq DNA polymerase 5U, µg mẫu cDNA bổ sung nước khử ion để tổng thể tích phản ứng 20 µl Chu trình nhiệt: 94°C/5 phút, 25 chu kỳ (94°C/30 giây, nhiệt độ gắn mồi tương ứng với gen bảng 1/45 giây, 72°C/45 giây), 72°C/10 phút Phương pháp xử lý số liệu Mức độ biểu gen phân tích chương trình Quantity One (Bio-Rad) Các số liệu thống kê phương pháp phân 211 Đánh giá biểu số gen kháng thuốc tích phương sai nhân tố (One-way ANOVA) Sự khác biệt có ý nghĩa gen kháng kháng sinh typ ST phân tích hệ số hồi quy bội tuyến tính (Bonferroni's Multiple Comparison Test) với độ sai khác p