Đang tải... (xem toàn văn)
NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA PROTEIN KOD DNA POLYMERASE TÁI TỔ HỢP Ở E. COLI erase đang được sử dụng hiện nay. KOD DNA polymerase có vai trò quan trọng và được ưu tiên sử dụng trong PCR khuếch đại các sản phẩm gen kích thước lớn, giải trình tự hệ gen, hay nghiên cứu đột biến và tổng hợp gen. Do đó, enzyme này đang được áp dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh, y học, lĩnh vực pháp y, khoa học hình sự và nông nghiệp như: xét nghiệm sinh học phân tử để chuẩn đoán các bệnh liên quan đến virus, vi khuẩn, phát hiện mầm mống gây ung thư… Trên thị trường hiện nay, KOD DNA polymerase đang được cung cấp bởi công ty TOYOBO Ltd, Nhật Bản hay Millipore, Sigma của Mỹ với các đặc tính ưu việt như tần số đột biến thấp, tính ổn định cao, và tốc độ kéo dài rất nhanh. Tuy nhiên việc nhập khẩu hoàn toàn từ các công ty nước ngoài kèm theo những vấn đề không mong muốn cho người sử dụng khi như (1) giá thành cao, (2) thời gian vận chuyển kéo dài lâu, (3) chất lượng enzyme có thể bị ảnh hưởng do điều kiện bảo quản không đảm bảo trong thời gian vận chuyển. Xuất phát từ thực tiễn nhu cầu enzyme KOD DNA polymerase trong các phòng thí nghiệm cũng như các công ty công nghệ sinh học ở Việt Nam là rất lớn. Để đảm bảo tính chủ động trong nghiên cứu và làm chủ về mặt công nghệ, Việt Nam cần có quy trình sản xuất enzyme DNA polymerase đạt chất lượng tốt và giá thành rẻ hơn. Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về DNA polymerase, tuy nhiên số lượng công bố liên quan đến quá trình tinh sạch KOD DNA polymerase tái tổ hợp vẫn còn rất hạn chế. Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất nghiên cứu “Nhân dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của protein KOD DNA polymerase tái tổ hợp ở E. coli” với mục tiêu tạo ra KOD DNA polymerase tái tổ hợp bằng phương pháp đơn giản, từ đó có thể sản xuất lượng lớn enzyme này, làm chủ về mặt công nghệ ở Việt Nam.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA PROTEIN KOD DNA POLYMERASE TÁI TỔ HỢP Ở E COLI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA PROTEIN KOD DNA POLYMERASE TÁI TỔ HỢP Ở E COLI Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8420101.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Văn Sáng Hà Nội – Năm 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Sáng, môn Di truyền học, khoa Sinh học, trường Khoa học tự nhiên, người hướng dẫn, giúp đỡ tận tình bảo tơi Tơi cảm ơn thầy cho tơi có hội làm việc nhóm thầy, giúp tơi học tập nhiều điều có niềm đam mê với khoa học Tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Nguyễn Thị Thu Huyền anh Lê Tuấn Anh, học viên cao học, phòng thí nghiệm Sinh học phân tử tế bào, trung tâm khoa học sống giúp đỡ đồng hành tơi q trình học tập q trình làm việc phòng thí nghiệm Tơi xin cảm ơn tới thầy cô môn Di truyền học, PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân, TS Đỗ Thị Phúc, TS Trần Đức Long, ThS Trần Thùy Anh truyền đạt cho kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập làm việc trường Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số 106-NN 02-2016 58” Nghiên cứu có hợp tác hỗ trợ cung cấp gen mã hóa cơng ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa Cuối cùng, tơi xin cảm ơn tới gia đình bạn bè ln bên cạnh, chia sẻ động viên tơi q trình học tập hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 12 năm 2019 Học viên i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC HÌNH v BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan PCR 1.1.1 Giới thiệu 1.1.2 Ứng dụng PCR 1.1.1 Nguyên lý 1.1.2 Thành phần phản ứng PCR 1.2 Giới thiệu DNA polymerase 1.2.1 Giới thiệu chung 1.2.2 Phân loại DNA polymerase dựa vào trình tự protein 1.2.3 Các loại DNA polymerase thương mại 1.2.4 Cấu trúc DNA polymerase 1.3 KOD DNA polymerase 10 1.3.1 Giới thiệu KOD 10 1.3.2 Đặc điểm cấu trúc 11 1.4 Lựa chọn hệ thống biểu 12 1.4.1 Vật chủ biểu 12 1.4.2 Vector 13 1.5 Phương pháp tinh sử dụng sắc ký lực 16 1.5.1 Sắc ký lực Nickel 17 1.5.2 Sắc ký lực Glutathione 18 Chƣơng – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 1.1 Vật liệu hóa chất 20 1.1.1 Vật liệu 20 1.1.2 Hóa chất 20 1.1.3 Dụng cụ thiết bị 21 ii 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Nhân dòng gen KOD 22 2.2.2 Thiết kế vector biểu mang gen KOD 23 2.2.3 Biểu protein tái tổ hợp 26 2.2.4 Tinh protein sử dụng sắc ký lực 26 2.2.5 Thẩm tách protein 28 2.2.6 Thử hoạt tính enzyme 29 2.2.7 Sơ đồ nghiên cứu 29 Chƣơng – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Nhân dòng gen KOD 30 3.1.1 Tối ưu mã ba tổng hợp gen KOD 30 3.1.2 Khuếch đại đoạn chèn phản ứng PCR 30 3.1.3 Chèn đoạn gen mã hóa KOD vào vectơ biểu pET-M pGEX-4T-1 31 3.1.4 Kết tách chiết plasmid DNA 33 3.1.5 Giải trình tự plasmid 34 3.2 Biểu protein tái tổ hợp 35 3.3 Tinh protein sử dụng sắc ký lực 37 3.3.1 Tinh protein phương pháp sắc ký lực Nickel 37 3.3.2 Tinh protein phương pháp sắc ký lực GST 41 3.4 Thẩm tách protein 41 3.5 Thử họat tính enzyme 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1: So sánh đặc tính số loại DNA polymerase phổ biến [4] 11 Bảng 2: Trình tự mồi sử dụng phản ứng 20 Bảng 3: Thiết bị dụng cụ 21 Bảng 5: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn 24 Bảng 6: Thành phần phản ứng nối 24 Bảng 7: Kết phân tích tối ưu mã ba sử dụng GenScript 30 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1: Ứng dụng kỹ thuật PCR [11] Hình 2: Nguyên lý nhân DNA qua chu kỳ nhiệt [16] Hình 3: Các thành phần phản ứng PCR [35] Hình 4: Cấu trúc chung DNA polymerase [39] Hình 5: Cấu trúc KOD DNA polymerase [15] 12 Hình 6: Cơ chế biểu gen hệ thống pET tế bào E coli BL21 (DE3) [9] 13 Hình 7: Cấu trúc vector biểu pET-32a 15 Hình 8: Cấu trúc vector biểu pGEX-4T-1 15 Hình 9: Các bước tinh phương pháp sắc ký lực 16 Hình 10: Cơ chế tinh phương pháp sắc ký lực với Nickel [27] 18 Hình 11: Cơ chế phương pháp sắc ký lực với GST [21] 19 Hình 12: Sơ đồ phương pháp nghiên cứu 22 Hình 13: Kết điện di sản phẩm PCR gen KOD từ vector pUC19-KOD 31 Hình 14: Kết biến nạp sản phẩm lai KOD-pET-M KOD-pGEX-4T-1 vào tế bào E coli BL21 DE3 32 Hình 15: Kết PCR khuẩn lạc 33 Hình 16: Kết điện di plasmid .34 Hình 17: Kết PCR kiểm tra plasmid 34 Hình 18: So sánh trình tự axit amin KOD với trình tự KOD gốc 35 Hình 19: Kết biểu KOD gắn 6xHis tế bào BL21 36 Hình 20: Kết biểu KOD gắn đuôi GST tế bào BL21 37 Hình 21: Kết tinh protein KOD-His 38 Hình 22: Kết tối tinh KOD-His kết hợp với biến tính nhiệt 39 Hình 23: Kết tinh protein KOD-His điều kiện biến tính 40 Hình 24: Kết tinh KOD-His điều kiện biến tính khơng biến tính 40 Hình 25: Kết tinh KOD-GST 41 Hình 26: Kết PCR xác định hoạt độ enzyme KOD-His .42 Hình 27: Kết PCR xác định hoạt độ enzyme KOD-GST 43 Hình 28: Kết PCR thử hoạt tính enzyme KOD-His KOD-GST với kích thước gen đệm PCR khác .44 v BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Tên đầy đủ Kí hiệu APS Ammonium Persulfate Aa Axit amin BSA Bovine serum albumin Bp Base pair DNA Axit deoxyribonucleic DTT Dithiothreitol dNTPs Deoxynucleoside triphosphates EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid E coli Escherichia coli GST Glutathione S-transferase IMAC Immobilized metal affinity chromatography IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Kb Kilo base pair LB Luria-Bertani PCR Polymerase Chain Reaction RNA Axit ribonucleic SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Điện di polyacrylamide với SDS TAE Tris – acetic EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine vi MỞ ĐẦU KOD DNA polymerase enzyme có hoạt tính tốt số DNA polymerase sử dụng KOD DNA polymerase có vai trò quan trọng ưu tiên sử dụng PCR khuếch đại sản phẩm gen kích thước lớn, giải trình tự hệ gen, hay nghiên cứu đột biến tổng hợp gen Do đó, enzyme áp dụng rộng rãi nghiên cứu sinh, y học, lĩnh vực pháp y, khoa học hình nơng nghiệp như: xét nghiệm sinh học phân tử để chuẩn đoán bệnh liên quan đến virus, vi khuẩn, phát mầm mống gây ung thư… Trên thị trường nay, KOD DNA polymerase cung cấp công ty TOYOBO Ltd, Nhật Bản hay Millipore, Sigma Mỹ với đặc tính ưu việt tần số đột biến thấp, tính ổn định cao, tốc độ kéo dài nhanh Tuy nhiên việc nhập hoàn toàn từ cơng ty nước ngồi kèm theo vấn đề không mong muốn cho người sử dụng (1) giá thành cao, (2) thời gian vận chuyển kéo dài lâu, (3) chất lượng enzyme bị ảnh hưởng điều kiện bảo quản không đảm bảo thời gian vận chuyển Xuất phát từ thực tiễn nhu cầu enzyme KOD DNA polymerase phòng thí nghiệm công ty công nghệ sinh học Việt Nam lớn Để đảm bảo tính chủ động nghiên cứu làm chủ mặt công nghệ, Việt Nam cần có quy trình sản xuất enzyme DNA polymerase đạt chất lượng tốt giá thành rẻ Hiện nay, giới có nhiều nghiên cứu DNA polymerase, nhiên số lượng công bố liên quan đến trình tinh KOD DNA polymerase tái tổ hợp hạn chế Trên sở đó, chúng tơi đề xuất nghiên cứu “Nhân dòng, biểu hiện, tinh xác định hoạt tính protein KOD DNA polymerase tái tổ hợp E coli” với mục tiêu tạo KOD DNA polymerase tái tổ hợp phương pháp đơn giản, từ sản xuất lượng lớn enzyme này, làm chủ mặt công nghệ Việt Nam Căn vào mục tiêu đề tài, chúng tơi đề mục tiêu cụ thể sau: Tối ưu hóa mã ba gen KOD DNA polymerase cơng cụ tin sinh Tổng hợp nhân dòng gen mã hóa cho KOD DNA polymerase Chèn đoạn gen mã hóa cho KOD DNA polymerase vào vectơ biểu pET-M pGEX-4T-1 Biểu protein KOD tái tổ hợp tế bào vi khuẩn E coli BL21 DE3 Tinh protein tái tổ hợp phương pháp sắc ký lực với cột Niken GST Đánh giá hoạt tính enzyme KOD kỹ thuật PCR A B Hình 16: Kết điện di plasmid A – Sản phẩm điện di plasmid pETM-KOD, B – Sản phẩm điện di plasmid pGEX4T-1 KOD 3.1.5 Giải trình tự plasmid Plasmid tách chiết sử dụng làm khn cho phản ứng PCR để giải trình tự Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 1.5% cho kết có băng sáng (Hình 17) đủ tiêu chuẩn để gửi đọc trình tự công ty 1st BASE (Malaysia) theo phương pháp Sanger Trình tự KOD giải cặp mồi T7 promoter T7 terminator; Kod-F Kod-R để xác định đoạn gen chèn khung đọc xác định xác trình tự tồn đoạn gen mã hóa cho KOD DNA polymerase A B Hình 17: Kết PCR kiểm tra plasmid 34 A: Kết PCR kiểm tra plasmid pETM-KOD từ hai vùng biên để giải trình tự, B: Kết PCR có khn plasmid pGEX4T1-KOD Trình tự gen thu tiếp tục dịch mã thành trình tự axit amin sử dụng cơng cụ SnapGene so sánh với trình tự axit amin KOD gốc Kết so sánh trình tự cơng cụ tin sinh CLUSTALW trình bày Hình 18 Kết so sánh trình tự rằng, trình tự gen mà chúng tơi chèn vào vector biểu pET-M hay pGEX-4T-1 giống với trình tự gốc, khác trình tự giải vector pET-M có chứa trình tự cắt thrombin 6xHis, vector pGEX-4T-1 có chứa trình tự cắt thrombin Như kết chứng tỏ gen KOD chèn vào vecto biểu khơng có đột biến khung đọc vector Hình 18: So sánh trình tự axit amin KOD với trình tự KOD gốc 3.2 Biểu protein tái tổ hợp Gen mã hóa cho KOD DNA polymerase vectơ pET-M pGEX-4T-1 biến nạp biểu tế bào E coli BL21 (DE3) Chủng E coli BL21 chủng thiết kế mang gen khử tính độc promoter T7 sử dụng hệ thống vector biểu pET, dùng để biểu với hệ thống promoter tac vector biểu pGEX-4T-1 Tế bào chứa vector tái tổ 35 hợp biểu mơi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin với nồng độ chất cảm ứng IPTG 0.3 mM 16 tiếng Kết biểu KOD DNA polymerase phân tích phương pháp điện di SDS-PAGE thể Hình 19 20 Kết biểu protein KOD gắn Histidine (KOD-His) thể Hình 19 Ở đường chạy thứ 3, mẫu tế bào có cảm ứng IPTG 0.3 mM (mẫu BL21-KOD-His + IPTG) xuất băng đậm có kích thước gần 92 kDa Kích thước tương ứng với kích thước KOD DNA polymerase có gắn His Trong đó, mẫu đối chứng (mẫu BL21-KOD-His khơng IPTG), khơng có băng protein có kích thước tương ứng Kết chứng tỏ rằng, protein KOD-His biểu tế bào BL21 (DE3) Hình 19: Kết biểu KOD gắn đuôi 6xHis tế bào BL21 Mẫu BL21-KOD-His +IPTG mẫu cảm ứng biểu IPTG so sánh với mẫu đối chứng BL21-KOD-His không IPTG (mẫu khơng có chất cảm ứng IPTG) Ở mẫu có chất cảm ứng, xuất băng đặc trưng có kích thước 92 kDa, tương ứng với kích thước protein KOD-His Tương tự, Hình 20 thể kết biểu protein tái tổ hợp KOD gắn đuôi GST Ở giếng BL21-KOD-GST +IPTG, có băng đặc trưng kích thước protein KOD có gắn GST (KOD-GST) khoảng 116 kDa, kích thước bao gồm protein KOD (90 kDa) đuôi GST (26 kDa) Trong khi, giếng đối chứng 36 khơng có băng Như vậy, protein KOD gắn đuôi GST biểu thành công nồng độ IPTG 0.3 mM 37°C Hình 20: Kết biểu KOD gắn đuôi GST tế bào BL21 Mẫu BL21-KOD-GST +IPTG mẫu cảm ứng biểu IPTG 0.3 mM so sánh với mẫu đối chứng BL21-KOD-GST khơng IPTG (mẫu khơng có chất cảm ứng IPTG) Ở mẫu có chất cảm ứng, xuất băng đặc trưng có kích thước 92 kDa, tương ứng với kích thước protein KOD-GST, so sánh với thang chuẩn protein 3.3 Tinh protein sử dụng sắc ký lực 3.3.1 Tinh protein phƣơng pháp sắc ký lực Nickel Kết tinh protein KOD-His phương pháp sắc ký lực nickel trạng thái tự nhiên Sau biểu thành cơng protein KOD có gắn Histidine, tiếp tục tiến hành tinh protein phương pháp sắc ký lực, sử dụng cột có gắn ion nickel Do biểu hệ thống vector biểu pET-M nên protein tạo có thêm trình tự gồm axit amin Histidin Trình tự His-tag giúp protein tái tổ hợp bám với hạt nikel cột, protein khác bị rửa trôi dung dịch đệm rửa Protein tinh phân tích gel SDS-PAGE 10% thể Hình 21 Trên đường chạy cuối cùng, KOD-His sản phẩm protein sau tinh sạch, có xuất băng KOD, nhiên nhiều băng protein tạp Do đó, cần có quy trình tối ưu trình tinh protein KOD-His 37 Hình 21: Kết tinh protein KOD-His Đường chạy thang chuẩn protein Đường chạy thứ kết biểu protein có chất cảm ứng IPTG so sánh với mẫu khơng có IPTG đường chạy Đường chạy cuối protein KOD-His sau tinh Do kết tinh điều kiện thường khơng cho kết tốt, đó, chúng tơi tối ưu quy trình tinh protein KOD-His với nhiều phương pháp khác dùng nhiệt độ để loại bỏ băng tạp, hay tinh điều kiện biến tính protein sử dụng Urea nồng độ khác Kết tinh protein KOD-His phương pháp sắc ký lực Nickel kết hợp biến tinh nhiệt Dựa vào tính bền nhiệt DNA polymerase số nghiên cứu tinh loại DNA polymerase khác áp dụng phương pháp dùng nhiệt để biến tính protein khác [13, 20, 33] Chúng tiến hành ủ dịch tế bào sau phá vỡ nhiệt độ 75°C 15 phút để loại bỏ protein tổng số, nhiên kết hình 22 cho thấy, lượng protein tái tổ hợp tồn hầu hết pha cặn (mẫu Tủa sau ủ 75) so sánh với pha dịch sau ủ 75°C (Dịch pv sau ủ 75) băng protein KOD-His giảm đáng kể Mẫu tinh protein giếng cuối (Dịch tinh sạch) khơng có băng protein KOD-His Như nhiệt độ làm ảnh hưởng đến tính tan KOD DNA polymerase, protein bám vào polymerase bị phân hủy kéo theo KOD DNA polymerase tồn pha cặn 38 Hình 22: Kết tối tinh KOD-His kết hợp với biến tính nhiệt Protein KOD-His biểu tế bào E coli BL21 cảm ứng IPTG (đường chạy KOD-His + IPTG), để đánh giá khả biểu KODHis tế bào BL21 có chứa plasmid mang gen khơng bổ sung chất cảm ứng IPTG (đường chạy K IPTG), tế bào biểu KOD-His sau phá vỡ sóng siêu âm ly tâm chia thành pha cặn (Cặn pv) pha dịch (Dịch pv) Pha dịch tinh sắc ký lực Nickel đường chạy cuối Dịch tinh Kết tinh protein KOD-His phương pháp sắc ký lực Nickel điều kiện biến tính Urea Khi tinh protein KOD-His điều kiện biến tính Urea, chúng tơi lựa chọn nồng độ Urea khác 2M, 4M hay 6M Hình 21-A kết tinh điều kiện biến tính với hệ đệm có bổ sung Urea 2M, protein KOD-His (KOD-His + IPTG) biểu so sánh với giếng K IPTG, không thêm chất cảm ứng Tế bào có biểu sau phá vỡ sóng siêu âm, phần dịch phá vỡ (Dịch pv) xuất băng protein tái tổ hợp tinh cột nickel Kết tinh proteins KOD-His đường chạy cuối (Dịch tinh sạch) cho thấy nhiều băng phụ Do đó, chúng tơi tăng nồng độ Urea lên 4M, kết thể Hình 21- B cho thấy protein KOD tinh (mẫu Dịch tinh sạch) protein tạp 39 A B Hình 23: Kết tinh protein KOD-His điều kiện biến tính A – Kết tinh KOD-His điều kiện biến tính sử dụng Urea nồng độ 2M, protein KOD-His tinh thể giếng cuối (Dịch tinh sạch) B – Kết tinh KOD-His điều kiện biến tính với Urea nồng độ 4M, protein sau tinh điện di giếng cuối (Dịch tinh sạch) Kết điện di SDS-PAGE Hình 24 so sánh protein tinh điều kiện khơng biến tính biến tính cột Nickel Kết cho thấy protein KOD-His tinh điều kiện biến tính (Elute 2M, 4M, 6M) băng protein phụ có mờ băng protein tái tổ hợp giảm so với protein tinh điều kiện thường (Elute) Hình 24: Kết tinh KOD-His điều kiện biến tính khơng biến tính Protein KOD-His tinh phương pháp sắc ký lực nickel điều kiện thường (Elute), so sánh với protein KOD-His tinh điều kiện biến tính nồng độ Urea 2M, 4M, 6M (Elute 2M, Elute 4M, Elute 6M) 40 3.3.2 Tinh protein phƣơng pháp sắc ký lực GST Sau biểu thành công protein KOD gắn đuôi GST, tiến hành tinh phương pháp sắc ký lực với đuôi GST Được biểu hệ thống biểu vector pGEX nên protein biểu gắn GST có kích thước khoảng 26 kDa, protein tinh nhờ lực đuôi GST với cột glutathione Kết tinh protein phân tích phương pháp điện di gel SDS-PAGE Kết điện di thể Hình 20, chạy dịch tinh KOD-GST elute có băng đậm kích thước tương đương với protein KOD-GST Tuy nhiên xuất số băng protein tạp So sánh với phương pháp tinh protein KOD có gắn Histidine KOD có gắn GST có độ tinh cao hơn, độ đặc hiệu đuôi GST tốt với Histidine Hình 25: Kết tinh KOD-GST Protein KOD-GST biểu tế bào E coli BL21 cảm ứng IPTG (đường chạy KOD-GST có IPTG), để đánh giá khả biểu KODGST tế bào BL21 có chứa plasmid mang gen không bổ sung chất cảm ứng IPTG (đường chạy K IPTG), KOD-GST tinh đường chạy KODGST elute 3.4 Thẩm tách protein Protein sau tinh thẩm tách lít dung dịch đệm A (50mM Tris-HCl pH 8.0, 0.3M NaCl) tiếng Sau đó, protein thẩm tách tiếp lít dung dịch đệm B (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl) qua đêm Cuối protein thẩm tách chuyển sang dung dịch đệm bảo quản (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, mM DTT, 0.5% Nonidet P41 40, 0.5% Tween 20, 50% glycerol) Enzyme dung dịch bảo quản để 20°C sử dụng cho phản ứng kiểm tra hoạt tính enzyme 3.5 Thử họat tính enzyme Xác định hoạt độ enzyme Để xác định hoạt độ enzyme KOD-His KOD-GST, tiến hành phản ứng PCR để xác định lượng enzyme tối ưu cho phản ứng PCR, so sánh với enzyme Phusion DNA polymerase Thermo scientific 2U/µl Thực phản ứng PCR với lượng enzyme bổ sung cho phản ứng 0.3; 0.5; 1; enzyme Kết enzyme KOD-His Hình 26 cho thấy sản phẩm phản ứng PCR có bổ sung 0.5 µl µl KOD-His đóng vai trò xúc tác có băng sáng nồng độ Bằng mắt thường, so sánh tương đối độ đậm độ sáng nét sản phẩm PCR dùng 0.5 µl enzyme KOD-His với băng tạo thành 0.2 µl enzyme thương mại Phusion 2U/µl (Thermo scientific), ước lượng hoạt độ KOD-His sau tinh khoảng 0.8U /µl, tương đương với khoảng 800-1000 đơn vị ml enzyme tinh Hình 26: Kết PCR xác định hoạt độ enzyme KOD-His Tương tự với protein KOD-GST tiến hành PCR xác định hoạt độ, so sánh với KOD-His Phusion Thermo scientific Kết Hình 22 cho thấy, với lượng tế bào ban đầu sử dụng để tinh sạch, hoạt tính enzyme thu lại thấp so với KOD-His Khi sử dụng 0.5 – µl enzyme KOD-GST khơng có băng xuất hiện, thể tích – µl enzyme có băng sản phẩm mong muốn, nhiên độ sáng mờ so với enzyme KOD- 42 His Phusion DNA polymerase Khi so sánh tương đối độ đậm sắc nét băng sản phẩm PCR bổ sung µl enzyme KOD-GST xúc tác với µl KOD-His 0.2 µl Phusion, ước lượng hoạt độ enzyme KOD-GST tinh khoảng 0.1U/µl, tương đương 100 đơn vị enzyme ml enzyme tinh Hình 27: Kết PCR xác định hoạt độ enzyme KOD-GST Thử hoạt tính enzyme với loại đệm chạy PCR kích thước gen khác Sauk hi xác định lượng enzyme tương đương với đơn vị enzyme thương mại, tiến hành pha chế dung dịch đệm cho phản ứng PCR dành riêng cho enzyme KOD tinh Thành phần pha chế dung dịch đệm pha dựa nghiên cứu công bố bao gồm 10 mM Tris HCl, mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, mM MgSO4, 0.01% Triton X100 0.1 mg/ml BSA, giá trị pH thử nghiệm khác 7.5, 8.0 8.8, so sánh với 5X HF buffer hãng Thermo scientific Cả enzyme thử hoạt tính gen có kích thước khác từ 0.5 kp, 1.1 kp 2.4 kp Kết thể Hình 28 hàng kết enzyme KOD-His hàng thứ enzyme KOD-GST Đối với enzyme KOD-His, cách kích thước khác buffer khau băng sản phẩm PCR lên sáng có băng đặc hiệu, buffer pH 7.5 8.8 sản phẩm có băng phụ mờ mật độ băng mờ so với buffer pH 8.0 HF buffer Trái ngược lại hoạt tính enzyme KOD-GST chưa ổn định 43 Hình 28: Kết PCR thử hoạt tính enzyme KOD-His KOD-GST với kích thước gen đệm PCR khác 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết đạt được, chúng tơi có kết luận sau: Chúng tơi tối ưu trình tự gen nhân dòng gen mã hóa cho KOD DNA polymerase kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu Chèn thành cơng đoạn gen mã hóa cho KOD DNA polymerase vào vectơ biểu pET-M pGEX-4T-1 Biểu protein KOD tái tổ hợp tế bào vi khuẩn E coli BL21 Protein tái tổ hợp KOD-His tinh phương pháp sắc ký lực Nicken chưa có độ tinh cao, protein KOD-GST tinh phương pháp sắc ký lực với GST Hoạt tính enzyme gắn đuôi GST không ổn định so với protein gắn đuôi His Kiến nghị Trong phạm vi nghiên cứu luận văn thạc sỹ này, đạt kết định song hạn chế độ tinh protein tái tổ hợp, gây ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Vì vậy, tơi có số kiến nghị sau: Loại bỏ protein dung hợp GST khỏi protein KOD-GST protease thrombin Sử dụng sắc ký lọc gel sau để loại bỏ protein tạp khỏi protein KOD-His, đuôi GST khỏi hỗn hợp KOD-GST Thiết kế thí nghiệm thử độ bền hoạt tính DNA polymerase tái tổ hợp thu 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Dương Thị Kim Chi T V L., Lê Mậu Long (2016), "Xác định tham số quan trọng cho việc thiết kế gen dùng tái tổ hợp", Hội nghị Khoa học Quốc gia lần thứ IX “Nghiên cứu ứng dụng Công nghệ thông tin (FAIR'9), pp Tiếng Anh Barnes W M (1994), "PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates", Proc Natl Acad Sci U S A, 91, pp 2216-20 Benson L M., A P Null and D C Muddiman (2003), "Advantages of Thermococcus kodakaraenis (KOD) DNA Polymerase for PCR-mass spectrometry based analyses", J Am Soc Mass Spectrom, 14, pp 601-4 Block H., B Maertens, A Spriestersbach, N Brinker, J Kubicek, R Fabis, J Labahn and F Schafer (2009), "Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review", Methods Enzymol, 463, pp 439-73 Carson M., D H Johnson, H McDonald, C Brouillette and L J Delucas (2007), "His-tag impact on structure", Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 63, pp 295-301 Chou Q., M Russell, D E Birch, J Raymond and W Bloch (1992), "Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copynumber amplifications", Nucleic Acids Research, 20, pp 1717-1723 Clark D P and N J Pazdernik (2010), Biotechnology: Applying the Genetic Revolution, Place, Published Dąbrowski S and J Kur (1998), "Cloning and Expression inEscherichia coliof the Recombinant His-Tagged DNA Polymerases fromPyrococcus furiosusandPyrococcus woesei", Protein expression and purification, 14, pp 131-138 Donahue Jr R A and R L Bebee (1999), "BL21-SI™ competent cells for protein expression in E coli", Protein Expr Purif, 7, pp 289 10 Drouin R., W Dridi and O Samassekou (2007), DNA Polymerases for PCR Applications, 11 Edwards M C and R A Gibbs (1994), "Multiplex PCR: advantages, development, and applications", Genome Research, 3, pp S65-S75 12 Elshawadfy A M., B J Keith, E Ooi, T Kinsman, P Heslop and B A Connolly (2014), "DNA polymerase hybrids derived from the family-B enzymes of Pyrococcus furiosus and Thermococcus kodakarensis: improving performance in the polymerase chain reaction", Frontiers in microbiology, 5, pp 224 13 Ghasemi A., A H Salmanian, N Sadeghifard, A A Salarian and M K Gholi (2011), "Cloning, expression and purification of Pwo polymerase from Pyrococcus woesei", Iranian journal of microbiology, 3, pp 118 14 Hashimoto H., T Matsumoto, M Nishioka, T Yuasa, S Takeuchi, T Inoue, S Fujiwara, M Takagi, T Imanaka and Y Kai (1999), "Crystallographic 46 studies on a family B DNA polymerase from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis strain KOD1", J Biochem, 125, pp 983-6 15 Hashimoto H., M Nishioka, S Fujiwara, M Takagi, T Imanaka, T Inoue and Y Kai (2001), "Crystal structure of DNA polymerase from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis KOD1", J Mol Biol, 306, pp 469-77 16 Innis M A., D H Gelfand, J J Sninsky and T J White (2012), PCR protocols: a guide to methods and applications, Place, Published 17 Kaltenboeck B and C Wang (2005), "Advances in real-time PCR: application to clinical laboratory diagnostics", Advances in clinical chemistry, 40, pp 219-259 18 Li Y., S Korolev and G Waksman (1998), "Crystal structures of open and closed forms of binary and ternary complexes of the large fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I: structural basis for nucleotide incorporation", The EMBO journal, 17, pp 7514-7525 19 Lo Y D (1998), Introduction to the polymerase chain reaction, 20 Lu C and H P Erickson (1997), "Expression inEscherichia coliof the Thermostable DNA Polymerase fromPyrococcus furiosus", Protein expression and purification, 11, pp 179-184 21 Magdeldin S (2012), Affinity chromatography, Place, Published 22 Mizuguchi H., M Nakatsuji, S Fujiwara, M Takagi and T Imanaka (1999), "Characterization and application to hot start PCR of neutralizing monoclonal antibodies against KOD DNA polymerase", J Biochem, 126, pp 762-8 23 Morikawa M., Y Izawa, N Rashid, T Hoaki and T Imanaka (1994), "Purification and characterization of a thermostable thiol protease from a newly isolated hyperthermophilic Pyrococcus sp", Appl Environ Microbiol, 60, pp 4559-66 24 Mroczkowski B S., A Huvar, W Lernhardt, K Misono, K Nielson and B Scott (1994), "Secretion of thermostable DNA polymerase using a novel baculovirus vector", Journal of Biological Chemistry, 269, pp 13522-13528 25 Papas T S and G Vande Woude (1986), "Gene amplification and analysis", pp 26 Pelley J W (2007), Elsevier's Integrated Biochemistry, Place, Published 27 Pina A S., I L Batalha and A C Roque (2014), "Affinity tags in protein purification and peptide enrichment: an overview", Methods Mol Biol, 1129, pp 147-68 28 Rosano G L and E A Ceccarelli (2014), "Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges", Frontiers in microbiology, 5, pp 172-172 29 Saiki R K., D H Gelfand, S Stoffel, S J Scharf, R Higuchi, G T Horn, K B Mullis and H A Erlich (1988), "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase", Science, 239, pp 487-91 30 Saiki R K., S Scharf, F Faloona, K B Mullis, G T Horn, H A Erlich and N Arnheim (1985), "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia", Science, 230, pp 1350-4 31 Spriestersbach A., J Kubicek, F Schafer, H Block and B Maertens (2015), "Purification of His-Tagged Proteins", Methods Enzymol, 559, pp 1-15 47 32 Steitz T A (1999), "DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms", Journal of Biological Chemistry, 274, pp 17395-17398 33 Takagi M., M Nishioka, H Kakihara, M Kitabayashi, H Inoue, B Kawakami, M Oka and T Imanaka (1997), "Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp strain KOD1 and its application to PCR", Appl Environ Microbiol., 63, pp 4504-4510 34 Takagi M., M Nishioka, H Kakihara, M Kitabayashi, H Inoue, B Kawakami, M Oka and T Imanaka (1997), "Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp strain KOD1 and its application to PCR", Appl Environ Microbiol, 63, pp 4504-10 35 van Pelt-Verkuil E., A Van Belkum and J P Hays (2008), Principles and technical aspects of PCR amplification, Place, Published 36 Vikis H G and K.-L Guan (2004), Glutathione-S-transferase-fusion based assays for studying protein-protein interactions, 37 Wang F., S Li, H Zhao, L Bian, L Chen, Z Zhang, X Zhong, L Ma and X Yu (2015), "Expression and Characterization of the RKOD DNA Polymerase in Pichia pastoris", PLoS One, 10, pp e0131757 38 Waugh D S (2005), "Making the most of affinity tags", Trends in biotechnology, 23, pp 316-320 39 Wu S., W A Beard, L G Pedersen and S H Wilson (2013), "Structural comparison of DNA polymerase architecture suggests a nucleotide gateway to the polymerase active site", Chemical reviews, 114, pp 2759-2774 40 Yamashita M., J Xu, D Morokuma, K Hirata, M Hino, H Mon, M Takahashi, S M Hamdan, K Sakashita, K Iiyama, Y Banno, T Kusakabe and J M Lee (2017), "Characterization of Recombinant Thermococcus kodakaraensis (KOD) DNA Polymerases Produced Using SilkwormBaculovirus Expression Vector System", Mol Biotechnol, 59, pp 221-233 41 Zheng W., Q Wang and Q Bi (2016), "Construction, Expression, and Characterization of Recombinant Pfu DNA Polymerase in Escherichia coli", The protein journal, 35, pp 145-153 48 ... Nhân dòng, biểu hiện, tinh xác định hoạt tính protein KOD DNA polymerase tái tổ hợp E coli với mục tiêu tạo KOD DNA polymerase tái tổ hợp phương pháp đơn giản, từ sản xuất lượng lớn enzyme... DNA polymerase vào vectơ biểu pET-M pGEX-4T-1 Biểu protein KOD tái tổ hợp tế bào vi khuẩn E coli BL21 DE3 Tinh protein tái tổ hợp phương pháp sắc ký lực với cột Niken GST Đánh giá hoạt tính enzyme... ribonucleic SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Điện di polyacrylamide với SDS TAE Tris – acetic EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine vi MỞ ĐẦU KOD DNA polymerase enzyme có hoạt tính tốt số DNA polymerase