ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––––––– VŨ THỊ NHƯ TRANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP FLAVONOID VÀ CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM (TALINUM PANICULATUM) LUẬN ÁN TIẾN SI SINH HỌC THÁI NGUYÊN, 2019 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––– VŨ THỊ NHƯ TRANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP FLAVONOID VÀ CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM (TALINUM PANICULATUM) Ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 LUẬN ÁN TIẾN SI SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu THÁI NGUYÊN, 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn GS.TS Chu Hoàng Mậu Các kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Mọi trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn nội dung số liệu trình bày luận án Thái Nguyên, tháng năm 2019 TÁC GIẢ Vũ Thị Như Trang ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu trực tiếp hướng dẫn thường xuyên chia sẻ, động viên khích lệ để tơi có tự tin lòng đam mê khoa học giúp tơi hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn cán bộ, nghiên cứu viên Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành số thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ thầy cô cán Bộ môn Sinh học đại & Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Được học tập sinh hoạt chuyên môn tập thể khoa học nghiêm túc, tơi nhận nhiều góp ý q báu, trang bị thêm phương pháp nghiên cứu có hiểu biết sâu sắc vấn đề Sinh học đại Tôi xin cảm ơn thầy cô cán Khoa Sinh học, thầy cô cán Bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khố học Cuối cùng, tơi xin tỏ lòng tri ân người thầy, đồng nghiệp, gia đình bạn bè điểm tựa tinh thần vững chắc, giúp đỡ, động viên, khích lệ, chia sẻ khó khăn ln đồng hành tơi q trình học tập Thái Nguyên, tháng năm 2019 TÁC GIẢ Vũ Thị Như Trang MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Những đóng góp luận án Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY THỔ NHÂN SÂM 1.1.1 Phân loại đặc điểm sinh học Thổ nhân sâm 1.1.2 Thành phần hóa học Thổ nhân sâm 1.1.3 Nghiên cứu định danh Thổ nhân sâm 1.2 FLAVONOID VÀ TỔNG HỢP FLAVONOID Ở THỰC VẬT 1.2.1 Flavonoid 1.2.2 Con đường tổng hợp flavonoid thực vật 16 1.2.3 Enzyme CHI biểu gen mã hóa CHI 21 1.3 NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM 28 1.3.1 Tái sinh in vitro Thổ nhân sâm 28 1.3.2 Nuôi cấy rễ tơ Thổ nhân sâm 34 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 42 2.1.1 Vật liệu thực vật 42 2.1.2 Chủng vi khuẩn loại vector 43 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 43 2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 43 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 44 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 2.3.1 Phương pháp định danh mẫu Thổ nhân sâm 46 2.3.2 Các phương pháp nuôi cấy in vitro 47 2.3.3 Phương pháp chuyển gen GmCHI Thổ nhân sâm 52 2.3.4 Phương pháp phân tích chuyển gen 54 2.3.5 Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu 57 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58 3.1 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU THỔ NHÂN SÂM 58 3.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu Thổ nhân sâm thu số địa phương 58 3.1.2 Đặc điểm trình tự nucleotide vùng ITS đoạn gen matK 60 3.1.3 Thảo luận kết định danh mẫu Thổ nhân sâm tự nhiên 66 3.2 TẠO DÒNG THỔ NHÂN SÂM CHUYỂN GEN GmCHI 67 3.2.1 Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro phục vụ chuyển gen Thổ nhân sâm 67 3.2.2 Kết chuyển gen GmCHI tạo Thổ nhân sâm chuyển gen 76 3.2.3 Kết phân tích Thổ nhân sâm chuyển gen 81 3.2.4 Thảo luận kết tạo dòng Thổ nhân sâm chuyển gen GmCHI 87 3.3 TẠO DÒNG RỄ TƠ TỪ CÂY THỔ NHÂN SÂM 90 3.3.1 Kết tạo dòng rễ tơ từ Thổ nhân sâm 90 3.3.2 Thảo luận kết tạo dòng rễ tơ từ Thổ nhân sâm 98 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 100 Kết luận 100 Đề nghị 100 TÀI LIỆU THAM KHẢO .104 PHỤ LỤC 118 DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu, viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt AS Acetosyringone BAP Benzylaminopurine bp base pairs Cặp bazơ nitơ CCM Co-cultivation medium Môi trường đồng nuôi cấy cDNA Complementary DNA bổ sung CHI Chalcone isomerase C4H Cinnamate 4-hydroxylase CHS Chalcone synthase 4CL 4-Coumarate CoA ligase cs CTAB Cộng Cetyltrimethyl ammonium bromide 2,4 D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid DFR Dihydroxyflavonol 4reductase DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate FAP Fatty-acid-binding proteins F3H Flavanone-3-hydroxylase ELISA Enzyme-linked Xét nghiệm ELISA immunosorbentassay FLS Flavonol synthase FNS II Flavone synthase II GA3 Gibberellic acid Axit gibberellic GM Germination medium Mơi trường nảy mầm Kí hiệu, viết tắt GmCHI Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt Glycine max chalcone Gen GmCHI phân lập từ isomerase đậu tương IAA Idole acetic acid Axit idole acetic IBA Idolbutylic acid Axit idolbutylic IFS Isoflavone synthase ITS Internal transcribed spacers Kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria Bertani Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn LDOX Leucoanthocyanidin oxygenase L-Tyr L-tyrosine Axit amin L-tyrosine mRNA Messenger ribonucleic acid RNA thông tin MS Murashige Skoog, 1962 Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô thực vật NAA Naphthaleneacetic acid Axit naphthaleneacetic OD Optical density Mật độ quang Ori Origin Điểm khởi đầu chép PAL Phenylalanine ammonia- lyase PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase Ri-plasmid Root inducing- plasmid RM Rooting medium Môi trường tạo rễ RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic Rol Root locus Gen rol rpm Revolutions per minute Số vòng/ phút scFv Single-chain variable fragment SDS Sodium dodecyl sulfate SEM Shoot elongation medium Mơi trường kéo dài chồi vii Kí hiệu, viết tắt Tiếng Anh SIM Shoot induction medium Taq DNA Thermus aquaticus DNA polymerase polymerase T-DNA Transfer DNA Nghĩa tiếng Việt Môi trường cảm ứng tạo chồi Đoạn DNA chuyển vào thực vật TDZ Thidiazuron Ti-plasmid Tumor inducing - plasmid Plasmid gây khối u T0, T1 Các hệ chuyển gen T0 Cây chuyển gen tái sinh từ chồi ống nghiệm T1 Hạt chuyển gen T0 nảy mầm thành T1 TL-DNA Transfer left -DNA Vùng biên trái đoạn DNA chuyển vào thực vật TR-DNA Transfer right -DNA Vùng biên phải đoạn DNA chuyển vào thực vật UV Ultraviolet Tia cực tím Vir Virus interferon resistance Gen vir vvm Volume volume minute Thể tích khí/thể tích chất lỏng/ phút WPM Woody plant medium Mơi trường dinh dưỡng nuôi cấy thân gỗ WT Wild type X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galacto-pyranoside ZT Zeatin Cây không chuyển gen DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thống kê trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 44 Bảng 3.1 Sự sai khác trình tự nucleotide vùng ITS phân lập từ mẫu Thổ nhân sâm so với T paniculatum, mã số EU410357 62 Bảng 3.2 Sự sai khác trình tự nucleotide đoạn gen matK phân lập từ mẫu Thổ nhân sâm so với T paniculatum, mã số AY015274 64 Bảng 3.3 Ảnh hưởng javel 60 % HgCl2 0,1 % đến ty lệ nảy mầm hạt 688 Bảng 3.4 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh sinh trưởng chồi từ mầm 70 Bảng 3.5 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 71 Bảng 3.6 Ảnh hưởng tổ hợp mg/l BAP IBA đến phát sinh, sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 73 Bảng 3.7 Ảnh hưởng IAA đến khả rễ Thổ nhân sâm 74 Bảng 3.8 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ Thổ nhân sâm 75 Bảng 3.9 Hiệu tạo đa chồi từ mầm đoạn thân mang mắt chồi bên sau lây nhiễm A tumefaciens 77 Bảng 3.10 Kết biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI vào Thổ nhân sâm 79 Bảng 3.11 Hàm lượng flavonoid tổng số hai dòng Thổ nhân sâm chuyển gen T1- 2.2; T1- 10 đối chứng không chuyển gen 87 Bảng 3.12 Kết khảo sát vật liệu thích hợp tạo rễ tơ Thổ nhân sâm 90 Bảng 3.13 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn A rhizogenes, nồng độ AS, thời gian nhiễm khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen tạo rễ tơ từ mô Thổ nhân sâm 93 Bảng 3.14 Xác định ngưỡng diệt khuẩn cefotaxime sau tuần 94 Bảng 3.15 Ảnh hưởng trạng thái môi trường đến tăng trưởng rễ tơ Thổ nhân sâm 96 105 Shaghai-Maroof M A., Soliman K M., Jorgensen R A., Allard R W (1984), “Ribosomal DNAsepacer-length polymorphism in barley: mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics”, Proc Natl Acad Sci USA, 81, pp 8014 - 8019 106 Sharma S., Rustgi S., Balyan H S., Gupta P K (2002), “Internal transcribed spacer (ITS) sequences of ribosomal DNA of wild barley and their comparison with ITS sequences in common wheat”, Barley Genet Newslett, 32, pp 38 - 45 107 Shashank K., Abhay K P (2013), “Chemistry and biological activities of flavonoid: An overview”, The Scientific World Journal, Article ID 162750, 16 pages 108 Shimada N., Aoki T., Sato S., Nakamura Y (2003), “A cluster of genes encodes the two types of chalcone isomerase involved in the biosynthesis of general flavonoid and legume-specific 5-deoxy(iso) flavonoid in Lotus japonicas”, Plant physiol, 3, pp 941 - 951 109 Shyamkumar B., Anjaneyulu C., Giri C C (2003), “Multiple shoot induction from cotyledonary node explants of Terminalia chebula”, Biologia Plantarum, 47, pp 585 - 588 110 Siddique I., Anis M (2006), “Thidiazuron induced high frequency shoot bud formation and plant regeneration from cotyledonary node explants of Capsicum annuum L.”, Indian J Biotechnol, 5, pp 303 - 308 111 Siddique I., Anis M (2009), “Morphogenic response of the alginate encapsulated nodal segment and antioxidative enzymes analysis during acclimatization of Ocimum basilicum L.”, Journal of Crop Science and Biotechnology, 12, pp 233 - 238 112 Smith S A., Brown J W., Yang Y., Bruenn R., Drummond C P., Brockington S F., Walker J F., Last N., Douglas N A., Moore M J (2018), “Disparity, diversity, and duplications in the Caryophyllales”, New Phytol, 217, pp 836 854 113 Southern E M (1975), “Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis”, J Mol Biol, 98, pp 503 - 517 114 Sun H J., Cui M., Ma B., Ezura H (2006), “Functional expression of the tastemodifying protein, miraculin, in transgenic lettuce”, FEBS Lett, 580, pp 620 - 626 115 Tatiana D Veselova, Khalima K D., Margarita V R., Alexander C T (2012), “Embryology of Talinum paniculatum (Jacq.) Gaertn and T triangulare (Jacq.) Willd (Portulacaceae s.l., Caryophyllales)”, Wulfenia, 19, pp.107 - 129 116 Thiruvengadam M., Praveen N., Kim E H., Kim S H., Chung I M (2014), “Production of anthraquinones, phenolic compounds and biological activities from hairy root cultures of Polygonum multiflorum Thunb”, Protoplasma, 251(3), pp 555 - 566 117 Thwe A., Arasu M V., Li X., Park C H., Kim S J., Al-Dhabi N A., Park S U (2016), “Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn)”, Front Microbiol, 7, e65349 118 Timonin A C (2005), “Cymoid evolution resulting in (closed) thyrse: Talinum Adans (Portulacaceae) versus Wilhelm Troll”, Wulfenia, 12, pp 1-19 119 Tomilov A., Tomilova N., Yoder J I (2007), “Agrobacterium tumefaciens and A rhizogenes transformed roots of the parasitic plant Triphysaria versicolor retain parasitic competence”, Planta, 225, pp 1059 - 1071 120 Tsumura Y., Kawahara T., Wickneswari R., Yoshimura K (1996), “Molecular phylogeny of Dipterocarpaceae in Southeast Asia using RFLP of PCRamplified chloroplast genes”, Theor Appl Genet, 93, pp 22 - 29 121 Vanhala L., Hiltunen R., Oksman-Caldentey K M (1995), “Virulence of different Agrobacterium strains on hairy root formation of Hyoscyamus muticus”, Plan Cell Rep, 14, pp 236 - 240 122 Veena V., Taylor C G (2007), “Agrobacterium rhizogenes: recent developments and promising applications”, In Vitro Cell Dev Biol Plant, 43, pp 383 - 403 123 Vijayan K., Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Curr Sci, 99, pp 1530 - 1540 124 Wang R K., Zhan S F., Zhao T J., Zhou X L., Wang C E (2015), “Positive selection sites in tertiary structure of Leguminosae Chalcone isomerase 1”, Genet Mol Res, 14, pp 1957 - 1967 125 Yao L H., Jiang Y M., Shi J (2004), “Flavonoid in food and their health benefits”, Plant Food Hum Nutr, 59, pp 113 - 122 126 Yogananth N., Jothi Basu M (2009), “TLC method for determination of plumbagin in hairy root culture of Plumbago rosea L.”, Glob J Biotechnol Biochem, 4, pp 66 - 69 127 Yulia W I., Razief N (2005), “Study of phytochemistry of Java ginseng compare to Korean ginseng in: Development of animal health and production for improving the sustainability of livestock farming in the integrated agriculture system”, German institute for tropical and subtropical agriculture, pp 45 - 49, Indonesia 128 Zenn Z C., Yi C C., Yi H C., Yen L (2006), “cDNA cloning and molecular characterization of 4-Coumarate: Coenzyme A ligase in Eucalyptus camaldulensis”, Taiwan J For Sci, 21, pp 87 - 100 129 Zhang X., Wang X., An L., Fan S., Xiang W (1995), “Plant regeneration from protoplasts of Talinum paniculatum”, Acta Botanica Sinica, 37(10), pp 754760 130 Zhao J., Ma L., Liu X., Wu H (2009), “Induction of calluses and establishment of plantlet rapid propagation in Talinum paniculatum”, Journal of Southwest University of Science and Technology, 1, pp 103 - 107 131 Zhu W., Jia Q., Wang Y., Zhang Y., Xia M (2012), “The anthocyanin cyanidin3-O-β-glucoside, a flavonoid, increases hepatic glutathione synthesis and protects hepatocytes against reactive oxygen species during hyperglycemia: involvement of a cAMP-PKA-dependent signaling pathway”, Free Radical Bio Med, 52, pp 314 - 327 PHỤ LỤC Phụ lục Hình ảnh mẫu Thổ nhân sâm thu thập số địa phương phía Bắc Việt Nam TN1 HT TN2 QN BG Hình P1.1 Năm mẫu Thổ nhân sâm thu thập địa phương phía Bắc Việt Nam TN1: thành phố Thái Nguyên; TN2: huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên; QN: huyện Hoành Bồ, tỉnh Quảng Ninh; HT: thị xã Sơn Tây, Hà Nội; BG: huyện Tân Yên tỉnh Bắc Giang Phụ lục Kết xác định vùng ITS, đoạn gen matK, rpoB, rpoC1 mẫu Thổ nhân sâm BLAST NCBI Hình P2.1 Kết xác định vùng ITS mẫu Thổ nhân sâm BLAST NCBI Hình P2.2 Kết xác định đoạn gen matK mẫu Thổ nhân sâm BLAST NCBI Hình P2.3 Kết xác định đoạn gen rpoC1 mẫu Thổ nhân sâm BLAST NCBI Hình P2.4 Kết xác định đoạn gen rpoB mẫu Thổ nhân sâm BLAST NCBI Phụ lục Kết so sánh vùng ITS, đoạn gen matK, rpoB, rpoC1 mẫu Thổ nhân sâm với trình tự GenBank Hình P3.1 Trình tự nucleotide vùng ITS phân lập từ năm mẫu Thổ nhân sâm (BG, TN2, QN, TN1, HT) trình tự nucleotide vùng ITS mang mã số EU410357 loài T paniculatum GenBank Hình P3.2 Trình tự nucleotide đoạn gen matK phân lập từ năm mẫu Thổ nhân sâm (BG, TN2, QN, TN1, HT) trình tự nucleotide đoạn gen matK mang mã số AY015274 lồi T paniculatum GenBank Hình P3.3 Trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 phân lập từ năm mẫu Thổ nhân sâm (BG, TN2, QN, TN1, HT) trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 mang mã số GQ436061 lồi T paniculatum GenBank Hình P3.4 Trình tự nucleotide đoạn gen rpoB phân lập từ năm mẫu Thổ nhân sâm (BG, TN2, QN, TN1, HT) trình tự nucleotide đoạn gen rpoB mang mã số MG710385 loài T paniculatum GenBank Phụ lục Thành phần môi trường tái sinh Thổ nhân sâm chuyển gen Hỗn hợp Stock I (N1) Thành phần cho lít dung dịch 16,6 g CaCl2.2 H2O 95 g KNO3 + 8,5 g KH2PO4 + 82,5 g (NH4)NO3 + 18,5 g Stock II (N2) MgSO4.7H2O 1,24 g H3BO3 + 4,46g MnSO4.4H2O + mg CuSO4.7H2O Stock III (N3) + 1,72g ZnSO4.7H2O + 50 mg Na2MoO4.2H2O + 166 mg KI + mg CoCl2.6H2O Stock IV (N4) 5,56 g FeSO4.7H2O + 7,46 g Na2EDTA 20 mg Thiamine HCl + 100 mg pyridoxine HCl + 100 mg Stock V (N5) nicotic acid + 0,4 g glycine + 20 g Myoinositol 20 ml stock I/l + 20 ml stock II/l + 5ml stock (III, IV, V)/l MS0 GM + g agarose MS0 + 30 g/l sucrose + 50 ml/l nước dừa MS0 + 30 g/l sucrose + 100 μmol/l acetosyringon + 50 ml/l CCM nước dừa Môi trường SIM lần 1: MS0 + 30 g/l sucrose + 50 ml/l nước dừa + 1,5 mg/l BAP + 500 mg/l cefotaxim + 50 mg/l kanamycine SIM Môi trường SIM lần 2: MS0 + 30 g/l sucrose + 50 ml/l nước dừa + 1,5 mg/l BAP + 500 mg/l cefotaxim + 50 mg/l kanamycine MS0 + 30 g/l sucrose + 50 ml/l nước dừa + 500 mg/l SEM cefotaxim + 50 mg/l kanamycine MS0 + 30 g/l sucrose + 0,5 mg/l IAA + 500 mg/l cefotaxim RM + 50 mg/l kanamycine * Ghi chú: Các môi trường chuẩn pH = 5,8 khử trùng Thí nghiệm tiến hành nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 16 sáng/ngày ... A rhizogenes Xuất phát từ sở chọn tiến hành đề tài: Nghiên cứu biểu gen GmCHI liên quan đến tổng hợp flavonoid cảm ứng tạo rễ tơ Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum) Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng... PHẠM –––––––––––––––––––– VŨ THỊ NHƯ TRANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP FLAVONOID VÀ CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM (TALINUM PANICULATUM) Ngành: Di truyền học Mã số:... tích hợp biểu gen chuyển GmCHI Thổ nhân sâm chuyển gen; Phân tích, so sánh hàm lượng flavonoid tổng số dòng Thổ nhân sâm chuyển gen không chuyển gen (iii) Nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ từ Thổ nhân