Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ Môi trường: 34 (2014): 8-17 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU ĐIỀU KIỆN PH THẤP VÀ KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA HỆ VI KHUẨN ACID LACTIC PHÂN LẬP TỪ SỮA DÊ VÀ CHẾ PHẨM SINH HỌC Nguyễn Phước Hiền1, Lê Diệp Thúy1, Trần Trà My2 Nguyễn Hữu Hiệp2 Sinh viên ngành Cơng nghệ Sinh học khóa 36, Trường Đại học Cần Thơ Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Thông tin chung: Ngày nhận: 20/06/2014 Ngày chấp nhận: 30/10/2014 Title: The survey of tolerance to low pH condition and antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated from goat's milk and probiotics Từ khóa: Enterococcus, kháng kháng sinh, pH thấp, probiotic, sữa dê, vi khuẩn acid lactic Keywords: Antibiotic resistance, Enterococcus, goat's milk, lactic acid bacteria, low pH, probiotic ABSTRACT Sixteen bacterial strains were isolated in MRS medium, including 13 isolates from goat's milk and isolates from probiotics Most colonies of them were round, opalescent white color to milky white, raised or convex elevation, lobulated or intact margin Results of the survey of biological characteristics showed that strains had rod shape (25.0%) and 12 strains had spherical shape (75.0%) and existed as single or double cells All isolates were Grampositive, unable to move and gave oxidase-negative test Besides, isolates had catalase-negative test The results experienced that strains belonging to lactic acid bacteria group were selected (43.8%) Surveyed results for the resistance to low pH environment illustrated that strains had the resistance to pH for hours Two strains Bio1.2 and G6.1 had the resistance to environmental condition of pH for hours with density of 9.01 log(CFU/ml) Strain Bio2.1 resisted to types of antibiotic as Streptomycin, Cephalexin, Penicillin V (256 mg/l concentration) and Ampicillin (128 mg/l concentration) Three strains G1.1, G5.6 and G6.1 were resistant to types of antibiotic as Streptomycin, Cephalexin (256 mg/l concentration) and Ampicillin (128 mg/l concentration) In addition, Probi strain had the resisitance to types of antibiotic as Streptomycin, Cephalexin and Tetracycline (256 mg/l concentration) TÓM TẮT Mười sáu dòng vi khuẩn phân lập mơi trường MRS, 13 dòng phân lập từ sữa dê dòng từ chế sinh học Phần lớn dòng vi khuẩn có khuẩn lạc tròn, màu sắc trắng đục đến trắng sữa, độ dạng mô hay lài, bìa nguyên hay chia thùy Kết khảo sát đặc tính sinh học cho thấy dòng có hình que (tỷ lệ 25,0%) 12 dòng hình cầu (tỷ lệ 75,0%) tồn trạng thái đơn hay kết đơi Tất dòng vi khuẩn phân lập Gram dương, không di động thử nghiệm oxidase âm tính; bên cạnh dòng có thử nghiệm catalase âm tính Kết tuyển chọn dòng thuộc nhóm vi khuẩn lactic (tỷ lệ 43,8%) Kết khảo sát mơi trường pH thấp cho thấy dòng có khả chống chịu môi trường pH Đặc biệt, dòng Bio1.2 G6.1 có khả tồn điều kiện môi trường pH với mật số 9,01 log(CFU/ml) Dòng Bio2.1 kháng loại kháng sinh Streptomycin, Cephalexin Penicillin V (256 mg/l) Ampicillin (128 mg/l) Ba dòng G1.1, G5.6 G6.1 phân lập từ sữa dê kháng loại kháng sinh Streptomycin, Cephalexin (256 mg/l) Ampicillin (128 mg/l) Ngồi ra, dòng Probi có khả kháng loại kháng sinh Streptomycin, Cephalexin Tetracycline (256 mg/l) Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ Môi trường: 34 (2014): 8-17 ĐẶT VẤN ĐỀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU Hiện nay, bệnh truyền nhiễm vấn đề quan tâm hàng đầu giới năm bệnh nhiễm trùng đường tiêu hóa ngun nhân gây bệnh tật tử vong toàn giới (Culligan et al., 2009) Bên cạnh đó, q trình điều trị bệnh thuốc kháng sinh tiêu diệt phần lớn quần thể vi sinh vật cách không chọn lọc, dẫn đến cân hệ vi sinh vật gây rối loạn vùng ruột bệnh tiêu chảy liên quan đến kháng sinh (Tambekar Bhutada, 2010) Đồng thời, khả kháng thuốc kháng sinh loài vi sinh vật gây bệnh cao, đặc biệt kháng sinh Streptomycin Oxytetracycline (Dung et al., 2008) Nhiều nghiên cứu cho probiotic có lợi điều trị bệnh rối loạn tiêu hóa tiêu chảy, kiết lỵ, thương hàn vi khuẩn gây bệnh đường ruột gây Bổ sung probiotic xem hoạt động hiệu việc cải thiện tình trạng sức khoẻ người (Fuller, 1989) Sự gia tăng hoạt động kháng vi sinh vật gây bệnh vi khuẩn probiotic mở hướng ứng dụng phòng điều trị bệnh, lựa chọn để thay thuốc kháng sinh (Ahmed, 2003) Hơn nữa, sữa động vật (bao gồm sữa người, sữa bò, sữa dê ) xem nguồn vi khuẩn lactic có tiềm probiotic chưa nghiên cứu sâu Nguồn mẫu sử dụng bao gồm mẫu sữa dê mẫu chế phẩm sinh học Probio Bioacimin Các loại kháng sinh sử dụng nghiên cứu dạng bột bán hiệu thuốc địa bàn thành phố Cần Thơ Trong đó, Streptomycin Trung Quốc sản xuất, loại lại Penicillin V, Cephalexin, Ampicillin Tetracycline Công ty Dược Việt Nam sản xuất dựa nguồn nguyên liệu nhập Môi trường nuôi cấy, phân lập khảo sát bao gồm: môi trường MRS (De Man, Rogosa and Sharpe), dung dịch đệm PBS (Phosphate buffer saline), môi trường nước muối peptone SPW (Saline peptone water) Các hóa chất dùng để phân tích chuẩn độ: CaCO3, NaOH, HCl phương tiện cần thiết khác phòng thí nghiệm PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thu thập xử lý mẫu Đối với mẫu sữa dê, 10 mẫu sữa thu thập từ 10 dê cho bú vòng tháng đầu sau sinh thu huyện Chợ Lách, tỉnh Bến Tre Mỗi mẫu sữa chứa túi nylon vô trùng trữ lạnh để mang phòng thí nghiệm Mẫu chế phẩm Probio Bioacimin mua cửa hàng thuốc địa bàn Thành phố Cần Thơ Đồng thời, tiến hành đo pH mẫu sữa dê 3.2 Phân lập vi khuẩn lactic từ sữa dê chế phẩm men tiêu hóa Vi khuẩn probiotic có vai trò tiềm vơ to lớn Tuy nhiên, nghiên cứu khai thác ứng dụng tiềm nhiều hạn chế Việt Nam giới Bên cạnh việc ứng dụng tiềm probiotic vi khuẩn lactic chưa thật phổ biến mang lại hiệu cao, đặc biệt người Khả chống chịu môi trường pH thấp kháng với loại kháng sinh đặc tính quan trọng để vi khuẩn probiotic tồn mà khơng bị tiêu diệt nhằm phục hồi hệ vi sinh vật có lợi đường ruột (Tambekar Bhutada, 2010) Trước thực trạng trên, nghiên cứu thực nhằm tuyển chọn dòng vi khuẩn probiotic từ sữa dê có khả chống chịu mơi trường pH thấp kháng loại kháng sinh phổ biến nồng độ cao Kết đề tài tiền đề cho nghiên cứu chuyên sâu probiotic, sản xuất chế phẩm sinh học ứng dụng bảo vệ nâng cao sức khoẻ người trước vấn đề dịch bệnh Trộn mẫu sữa dê cho vào môi trường MRS lỏng vô trùng với tỷ lệ ml mẫu/4 ml mơi trường để hoạt hóa 24 điều kiện kỵ khí 37oC Đối với men tiêu hóa, tiến hành hòa tan gram chế phẩm vào 100 ml môi trường MRS lỏng vô trùng để hoạt hóa 24 điều kiện kỵ khí 37oC Điều kiện kỵ khí tạo cách đặt nến cháy vào bình thủy tinh đậy kính chứa mơi trường ni cấy vi khuẩn, nến cháy hết tạo điều kiện kỵ khí Sau hoạt hóa, dung dịch mẫu chứa vi khuẩn pha lỗng trải mơi trường MRS agar để tạo khuẩn lạc rời rạc Tiến hành phân lập dòng vi khuẩn mơi trường MRS agar đến đạt độ ròng định quan sát kính hiển vi quang học Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ Môi trường: 34 (2014): 8-17 pH sau với quy trình thực khảo sát mơi trường pH 3.3 Khảo sát đặc tính sinh học sinh hóa 3.3.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào, khả chuyển động nhuộm Gram 3.5 Khảo sát khả kháng thuốc kháng sinh 3.5.1 Quan sát hình dạng, màu sắc, độ khuẩn lạc sau 48 ủ điều kiện kỵ khí 37oC Hình dạng, kích thước tế bào khả di động vi khuẩn quan sát ghi nhận kính hiển vi quang học Sau đó, tiến hành nhuộm Gram tế bào 3.3.2 Kiểm tra đặc tính sinh hóa Phương pháp tiến hành Thí nghiệm tiến hành khảo sát loại kháng sinh Penicillin V, Streptomycin, Cephalexin, Ampicillin Tetracycline, dựa phương pháp khuếch tán đĩa NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) (1997) có thay đổi bổ sung phù hợp với điều kiện yêu cầu thí nghiệm: Tiến hành trải dung dịch chứa vi khuẩn nuôi tăng sinh môi trường MRS lỏng 24 37oC đĩa petri Đồng thời, pha loại kháng sinh thành dãy gồm 12 nồng độ giảm dần từ 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 mg/l theo phương pháp pha loãng bậc hai từ nồng độ gốc 256 mg/l lọc lọc vi khuẩn (Dung et al., 2008) Mỗi nồng độ loại kháng sinh chứa riêng biệt lọ thủy tinh vô trùng Dùng thủ thuật vô trùng đặt đĩa giấy tẩm dung dịch kháng sinh lên đĩa petri ủ đĩa thí nghiệm điều kiện kỵ khí 37oC 48 Sau thời gian ủ, đo đường kính vòng ức chế sinh trưởng so sánh với giá trị tiêu chuẩn mức độ nhạy cảm với kháng sinh 3.5.2 Phân tích kết Các thử nghiệm sinh hóa bao gồm khả tổng hợp enzyme catalase, oxidase khả phân giải CaCO3 Từ kết khảo sát đặc tính sinh học thử nghiệm sinh hóa sơ chọn dòng vi khuẩn lactic để thực thí nghiệm đánh giá khả chống chịu mơi trường pH thấp kháng thuốc kháng sinh 3.4 So sánh đánh giá khả chống chịu môi trường pH thấp 3.4.1 Mơi trường pH Các dòng vi khuẩn lactic chủng vào ml môi trường MRS lỏng, vô trùng để nuôi tăng sinh điều kiện kỵ khí 37oC 24 Sau đó, thu lấy sinh khối vi khuẩn cách ly tâm 5.000 vòng/phút 4oC 10 phút Rửa sinh khối thu hai lần với dung dịch PBS pH 7,2 Chuyển dịch huyền phù vi khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trường PBS pH Sau thời điểm 0, 1, giờ, hút 100 l dung dịch ống chuyển sang môi trường MRS lỏng, ủ 37oC 24 Sau đó, tiến hành đếm mật số vi khuẩn thời điểm khảo sát phương pháp pha loãng mẫu phương pháp đếm sống (Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp, 2009) Các dòng vi khuẩn lactic khảo sát đồng thời môi trường pH 6,4 để đánh giá phát triển mơi trường pH thích hợp 3.4.2 Mơi trường pH Khả kháng kháng sinh đánh giá theo mức độ dựa vào đường kính vòng ức chế sinh trưởng sau: Kháng mạnh (K): ≤ 13mm, Kháng trung bình (TB): 14-16mm, Nhạy cảm (N): ≥ 17mm (Nguồn: White et al., 2003) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Giá trị pH mẫu sữa dê Mười mẫu sữa dê ký hiệu mẫu từ GM1 đến GM10 Kết cho thấy giá trị pH mẫu dao động từ 6,69-6,93 Giá trị pH thấp nhóm mẫu GM1 (6,69) khác biệt khơng có ý nghĩa với mẫu GM2 (6,73) khác biệt có ý nghĩa thống kê với mẫu lại Mẫu GM3 GM7 có giá trị pH cao (6,93) khác biệt có ý nghĩa thống kê với mẫu lại Tuy nhiên, tất giá trị pH mẫu nằm khoảng trung tính phù hợp với khả tiêu hóa dê giai đoạn đầu sau sinh Các dòng vi khuẩn lactic có khả chống chịu điều kiện pH chọn để tiếp tục khảo sát điều kiện mơi trường pH Thí nghiệm tiến hành theo phương pháp tương tự điều kiện môi trường pH 3.4.3 Môi trường pH Tương tự vậy, tiếp tục khảo sát điều kiện pH dòng có khả chống chịu 10 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 7,00 Phần A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ Môi trường: 34 (2014): 8-17 a 6,95 a bc Giá trị pH 6,90 de 6,85 ab cd cd e 6,80 6,75 6,70 f f 6,65 6,60 6,55 GM1 GM2 GM3 GM4 GM5 GM6 GM7 GM8 GM9 GM10 Mẫu Hình 1: Sự biến động giá trị pH mẫu sữa dê Ghi chú: Số liệu trung bình lần lặp lại Giữa mẫu, giá trị trung bình có chữ thể khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê độ tin cậy 95% mơi trường MRS agar có bổ sung 1,5% CaCO3 (Hình 2) Kết khảo sát đặc tính sinh học cho thấy có 4/16 dòng có dạng hình que (chiếm tỷ lệ 25,0%) 12/16 dòng có dạng hình cầu (chiếm tỷ lệ 75,0%) tồn trạng thái đơn kết đơi Tất dòng vi khuẩn Gram dương không di động Kết thử nghiệm sinh hóa cho thấy tất dòng có thử nghiệm oxidase âm tính 7/16 dòng có thử nghiệm catalase âm tính (chiếm tỷ lệ 43,8%) Kết tuyển chọn dòng thuộc nhóm vi khuẩn lactic dựa vào hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào, đặc điểm Gram thử nghiệm sinh hóa (Bảng 1) 4.2 Kết phân lập vi khuẩn lactic từ sữa dê men tiêu hóa Mười sáu dòng vi khuẩn phân lập từ 10 mẫu sữa dê loại chế phẩm Bioacimin Probio Trong đó, có 13 dòng phân lập từ 10 mẫu sữa dê (chiếm 81,3%) 03 dòng phân lập từ chế phẩm Bioacimin Probio (chiếm 18,7%) Phần lớn dòng vi khuẩn phân lập có dạng khuẩn lạc hình tròn; màu trắng đục trắng sữa; độ dạng mơ hay lài; bìa ngun hay chia thùy Ngồi ra, hầu hết dòng có khả sinh acid mạnh tạo vòng sáng xung quanh khuẩn lạc A B Hình 2: Hình dạng khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập từ sữa dê chế phẩm sinh học: G6.1 (A) Bio2.1 (B) 11 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ Môi trường: 34 (2014): 8-17 Bảng 1: Đặc tính sinh học dòng vi khuẩn lactic phân lập từ sữa dê chế phẩm sinh học Dòng vi khuẩn Nguồn phân lập Bio1.2 Bioacimin Bio2.1 Bioacimin Probi Probio G1.1 G5.1 G5.6 G6.1 Hình dạng tế bào Hình thái khuẩn lạc Sữa dê (mẫu GM1) Sữa dê (mẫu GM5) Sữa dê (mẫu GM5) Sữa dê (mẫu GM6) Tròn, bìa ngun, mơ, trắng sữa Tròn, bìa ngun, mơ, trắng sữa Tròn, chia thuỳ, lài, trắng đục Tròn, bìa ngun, mơ, trắng sữa Tròn nhỏ, bìa ngun, mơ, trắng sữa Tròn, bìa ngun, mơ, trắng sữa Tròn, bìa ngun, mơ, trắng sữa Thử nghiệm catalase Thử nghiệm oxidase Que ngắn   Que ngắn   Cầu đôi   Cầu đôi   Cầu đôi   Cầu đơn   Cầu đơi   Ghi chú: (): Âm tính Đến thời điểm giờ, mật số dao động khoảng 7,74-8,89 log(CFU/ml), thể thay đổi hay gần không thay đổi so với thời điểm ban đầu Kết khảo sát chứng tỏ pH 6,4 điều kiện pH thích hợp cho tồn ổn định mật số dòng vi khuẩn phân lập 4.3 Kết so sánh đánh giá khả chống chịu môi trường pH thấp 4.3.1 Môi trường pH 6,4 Ở pH 6,4, mật số ban đầu vào thời điểm dòng vi khuẩn phân lập có khác dao động khoảng từ 7,69-8,91 log(CFU/ml) Bảng 2: Mật số (logCFU/ml) dòng vi khuẩn lactic mơi trường pH 6,4 Dòng vi khuẩn Bio1.2 Bio2.1 Probi G1.1 G5.1 G5.6 G6.1 8,87 8,91 7,69 8,72 8,79 8,74 8,78 Thời gian (giờ) 8,87 8,90 7,82 8,74 8,80 8,74 8,78 8,86 8,88 7,82 8,73 8,79 8,74 8,79 8,87 8,89 7,74 8,72 8,80 8,74 8,78 LSD ns ns ns ns ns ns ns CV (%) 0,24 0,25 2,81 0,22 0,37 0,30 0,28 Ghi chú: ns: khác biệt khơng có ý nghĩa Số liệu kết trung bình lần lặp lại Trong hàng, giá trị trung bình thể khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê độ tin cậy 95% 4.3.2 nhiên, xét tiêu chí đánh giá khả chống chịu mơi trường pH thấp, kết khảo sát chứng minh phần lớn dòng vi khuẩn lactic phân lập có khả chống chịu điều kiện pH Môi trường pH dịch dày người đạt pH cao chứa thực phẩm sản phẩm từ sữa (Matijasic Rogelj, 2000) Kết khảo sát chứng minh hầu hết dòng vi khuẩn lactic phân lập từ sữa dê chế phẩm men tiêu hóa có khả chịu đựng pH Nói cách khác, chúng có khả chống chịu với điều kiện acid dày để đến ruột non Môi trường pH Kết khảo sát điều kiện pH cho thấy mật số ban đầu thời điểm dòng vi khuẩn phân lập có khác dao động khoảng từ 7,93-9,10 log(CFU/ml) Dòng G5.1 khơng có khả chống chịu sau với mật số log(CFU/ml) Sáu dòng vi khuẩn lại (chiếm tỷ lệ 85,7%) có mật số giảm sau thí nghiệm dao động khoảng từ 7,82-9,05 log(CFU/ml) Sự khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê cho thấy thay đổi đáng kể mật số dòng vi khuẩn so với thời điểm ban đầu (Bảng 3) Tuy 12 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ Môi trường: 34 (2014): 8-17 Bảng 3: Mật số (logCFU/ml) dòng vi khuẩn lactic mơi trường pH Dòng vi khuẩn Bio1.2 Bio2.1 Probi G1.1 G5.1 G5.6 G6.1 8,95a 8,81a 7,93a 9,02a 8,95a 9,04a 9,10a Thời gian (giờ) 8,88ab 8,81c 8,80a 8,78a a 7,89 7,86a a 9,01 9,00a b 0,00 0,00b 9,04a 9,03a a 9,09 9,08ab 8,82bc 8,76a 7,82a 8,98a 0,00b 9,03a 9,05b CV (%) 0,30 0,45 1,26 0,25 0,63 0,22 0,15 Ghi chú: Số liệu kết trung bình lần lặp lại Trong hàng, giá trị trung bình có chữ thể khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê độ tin cậy 95% giờ, tất dòng vi khuẩn khơng khả chống chịu với giá trị mật số (Bảng 4) Sự khác biệt khả chống chịu điều kiện pH dòng vi khuẩn giải thích điều kiện pH thấp tồn nhiều nhóm vi sinh vật, có nhóm vi khuẩn lactic Điều kiện pH có ảnh hưởng lớn đến hoạt động enzyme trao đổi chất vi sinh vật Do đó, phần lớn vi sinh vật khơng có khả tồn phát triển điều kiện pH đến thấp (Cakir, 2003) Kết khảo sát chưa tuyển chọn dòng chống chịu mơi trường pH nên khơng tiến hành thí nghiệm điều kiện pH 4.3.3 Mơi trường pH Sáu dòng vi khuẩn có khả chống chịu mơi trường pH tuyển chọn để khảo sát điều kiện pH Khác với kết khảo sát điều kiện pH 6,4, môi trường pH tất dòng vi khuẩn có mật số giảm rõ rệt sau thí nghiệm Sau khảo sát, tất dòng vi khuẩn thể khả chống chịu pH với mật số thay đổi không đáng kể so với thời điểm Ở thời điểm giờ, dòng vi khuẩn (chiếm tỷ lệ 33,3%) có khả chống chịu với điều kiện pH Các dòng vi khuẩn có khả chống chịu bao gồm Bio1.2 G6.1 với giá trị mật số 9,01 log(CFU/ml) Tuy nhiên, đến thời điểm Bảng 4: Mật số (logCFU/ml) dòng vi khuẩn lactic mơi trường pH Dòng vi khuẩn Bio1.2 Bio2.1 Probi G1.1 G5.6 G6.1 9,07a 9,06a 8,05a 8,97a 9,07a 9,06a Thời gian (giờ) 9,06a 8,90b 7,50b 8,87b 9,02b 9,04a 9,01b 0,00c 0,00c 0,00c 0,00c 9,01a 0,00c 0,00c 0,00c 0,00c 0,00c 0,00b CV (%) 0,26 0,22 2,31 0,39 0,22 0,36 Ghi chú: Số liệu kết trung bình lần lặp lại Trong hàng, giá trị trung bình có chữ thể khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê độ tin cậy 95% Kết thí nghiệm cho thấy tất dòng vi khuẩn lactic phân lập có khả kháng Penicillin V nồng độ từ 0,125-8 mg/l Ở nồng độ từ 16-128 mg/l, có đến 5/6 dòng vi khuẩn (chiếm tỷ lệ 83,3%) biểu kháng với Penicillin V; đó, dòng Probi biểu nhạy cảm nồng độ 16 mg/l Đến nồng độ 256 mg/l, dòng Bio2.1 biểu kháng với Penicillin V (chiếm tỷ lệ 16,6%) Kết thí nghiệm chứng minh dòng vi khuẩn phân lập có khả kháng Penicillin V nồng độ cao so với nhóm vi khuẩn gây bệnh người động vật so sánh với giá trị MIC 4.4 Kết khảo sát khả kháng thuốc kháng sinh 4.4.1 Kháng sinh Penicillin V Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimum Inhibitory Concentration) nồng độ thấp loại kháng sinh có khả ức chế phát triển vi khuẩn sau khoảng 24 ni cấy (Dung et al., 2008) Do đó, thí nghiệm hiệu kháng kháng sinh dòng vi khuẩn phân lập đánh giá dựa vào giá trị MIC khảo sát vi sinh vật gây bệnh Penicillin V loại kháng sinh thuộc nhóm ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn có giá trị MIC thường nằm khoảng 0,01-0,1 mg/l 13 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ Môi trường: 34 (2014): 8-17 Bảng 5: Khả kháng kháng sinh Penicillin V số dòng vi khuẩn lactic phân lập từ sữa dê chế phẩm sinh học STT Dòng vi khuẩn Bio1.2 Bio2.1 Probi G1.1 G5.6 G6.1 0,125 K K K K K K 0,25 K K K K K K 0,5 K K K K K K K K K K K K Nồng độ kháng sinh (mg/l) 16 K K K K K K K K K K K N K K K K K K K K K K K K 32 K K N K K K 64 K K N K K K 128 K K N K K K 256 TB K N TB TB TB Ghi chú: K: Kháng mạnh; TB: Kháng trung bình; N: Nhạy cảm 4.4.2 Kháng sinh Streptomycin Cephalexin ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn bền vững với enzyme penicilinase Kết thí nghiệm cho thấy tất dòng vi khuẩn lactic phân lập có khả kháng Streptomycin Cephalexin nồng độ từ 0,125-256 mg/l (Bảng 6) Điều chứng minh kháng sinh Streptomycin Cephalexin giới hạn nồng độ khảo sát lên đến 256 mg/l chưa ảnh hưởng đến tồn phát triển dòng vi khuẩn phân lập Streptomycin kháng sinh thuộc nhóm ức chế tổng hợp protein vi khuẩn Theo Korhonen (2010), giá trị MIC Streptomycin phần lớn vi khuẩn lactic nằm khoảng 2-256 μg/ml Ngoài ra, theo nghiên cứu Dung et al (2008), có đến 98,7% (trong tổng số 50 dòng vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ cá tra) bị nhạy cảm với kháng sinh Cephalexin nồng độ 30 μg/ml Hiệu cao kháng sinh Cephalexin nhờ vào khả Bảng 6: Khả kháng kháng sinh Streptomycin Cephalexin số dòng vi khuẩn lactic phân lập từ sữa dê chế phẩm sinh học STT Dòng vi khuẩn Bio1.2 Bio2.1 Probi G1.1 G5.6 G6.1 0,125 K K K K K K 0,25 K K K K K K 0,5 K K K K K K K K K K K K Nồng độ kháng sinh (mg/l) 16 K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K 32 K K K K K K 64 K K K K K K 128 K K K K K K 256 K K K K K K Ghi chú: K: Kháng mạnh; TB: Kháng trung bình; N: Nhạy cảm A B Hình 3: Khả kháng kháng sinh Penicillin V (P), Streptomycin (S) Cephalexin (C) nồng độ 256 mg/l dòng vi khuẩn Bio2.1 (A) G6.1 (B) 14 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ Môi trường: 34 (2014): 8-17 4.4.3 Kháng sinh Ampicillin với Ampicillin nồng độ 10 μg/ml Kết khảo sát thể hiện, tất dòng vi khuẩn phân lập kháng Ampicillin nồng độ từ 0,125-64 mg/l Tuy nhiên, nồng độ 128 mg/l, 4/6 dòng vi khuẩn (chiếm tỷ lệ 66,6%) biểu kháng (bao gồm dòng Bio2.1, G1.1, G5.6 G6.1) Đến nồng độ 256 mg/l, khơng có dòng vi khuẩn biểu kháng với kháng sinh Ampicillin Ampicillin loại kháng sinh phổ rộng thuộc nhóm beta-lactam có tác động chủ yếu vào q trình nhân đơi vi khuẩn, ức chế tổng hợp mucopeptide màng tế bào vi khuẩn Theo Dung et al (2008), có đến 86% (trong tổng số 50 dòng vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ cá tra) nhạy cảm Bảng 7: Khả kháng kháng sinh Ampicillin số dòng vi khuẩn lactic phân lập từ sữa dê chế phẩm sinh học STT Dòng vi khuẩn Bio1.2 Bio2.1 Probi G1.1 G5.6 G6.1 0,125 K K K K K K 0,25 K K K K K K 0,5 K K K K K K K K K K K K Nồng độ kháng sinh (mg/l) 16 K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K 32 K K K K K K 64 K K K K K K 128 TB K TB K K K 256 TB TB N N N N Ghi chú: K: Kháng mạnh; TB: Kháng trung bình; N: Nhạy cảm bệnh gan thận mủ cá tra) nhạy cảm với Tetracycline nồng độ 30 μg/ml 4.4.4 Kháng sinh Tetracycline Kết khảo sát cho thấy, tất dòng vi Các nghiên cứu ủng hộ việc sử khuẩn phân lập có khả kháng Tetracycline dụng probiotic để phòng ngừa bệnh tiêu chảy có nồng độ từ 0,125-16 mg/l Ở nồng độ 32 mg/l, có liên quan đến kháng sinh Hiệu kháng thuốc 5/6 dòng vi khuẩn (chiếm tỷ lệ 83,3%) biểu kháng sinh nồng độ cao rằng, sử dụng kháng Với nồng độ 64 mg/l, 3/6 dòng vi probiotic phân lập từ sữa động vật cho bệnh khuẩn (chiếm tỷ lệ 50,0%) biểu kháng, bệnh nhân điều trị kháng sinh hữu ích dòng lại thể mức độ trung gian với việc phục hồi bệnh nhanh thiết lập Tetracycline nồng độ Đến nồng độ 128 mg/l hệ vi sinh vật có ích đường ruột cách 256 mg/l, có dòng vi khuẩn Probi (chiếm tỷ nhanh chóng Khả kháng vi khuẩn lệ 16,6%) biểu kháng với Tetracycline probiotic với số kháng sinh sử Tetracycline ức chế tổng hợp protein tế bào dụng cho hai mục đích phòng ngừa điều trị vi khuẩn cách gắn vào phần 30S bệnh nhiễm trùng đường ruột (EI-Naggar, ribosome, ức chế gắn aminoacyl-tRNA 2004) vào vị trí tiếp nhận Theo Dung et al (2008) có khoảng 30% (trong tổng số 50 dòng vi khuẩn gây Bảng 8: Khả kháng kháng sinh Tetracycline số dòng vi khuẩn lactic phân lập từ sữa dê chế phẩm sinh học STT Dòng vi khuẩn Bio1.2 Bio2.1 Probi G1.1 G5.6 G6.1 0,125 K K K K K K 0,25 K K K K K K 0,5 K K K K K K K K K K K K Nồng độ kháng sinh (mg/l) 16 K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K Ghi chú: K: Kháng mạnh; TB: Kháng trung bình; N: Nhạy cảm 15 32 K TB K K K K 64 TB TB K K TB K 128 N N K TB TB TB 256 N N K N N N Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ Môi trường: 34 (2014): 8-17 A B Hình 4: Khả kháng kháng sinh Ampicillin (A) Tetracycline (T) nồng độ 64 mg/l dòng vi khuẩn Probi (A) G6.1 (B) KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO Mười sáu dòng vi khuẩn phân lập mơi trường MRS agar từ nguồn sữa dê chế phẩm sinh học Phần lớn dòng vi khuẩn có dạng khuẩn lạc hình tròn, màu trắng đục đến trắng sữa, độ dạng mơ lài, bìa ngun hay chia thùy; hình dạng chủ yếu có dạng que cầu tồn trạng thái đơn hay kết đôi Tất dòng vi khuẩn phân lập Gram dương, khơng di động có thử nghiệm oxidase âm tính; bên cạnh đó, có 7/16 dòng cho kết thử nghiệm catalase âm tính Từ kết khảo sát tuyển chọn dòng thuộc nhóm vi khuẩn lactic Trong dòng khảo sát, có đến dòng có khả chống chịu môi trường pH Đặc biệt, dòng Bio1.2 G6.1 có khả tồn điều kiện môi trường pH Dòng Bio2.1 có khả kháng loại kháng sinh Streptomycin, Cephalexin Penicillin V nồng độ 256 mg/l Ampicillin nồng độ 128 mg/l Ba dòng G1.1, G5.6 G6.1 có khả kháng loại kháng sinh Streptomycin, Cephalexin nồng độ 256 mg/l Ampicillin nồng độ 128 mg/l Ngồi ra, dòng Probi có khả kháng loại kháng sinh Streptomycin, Cephalexin Tetracycline nồng độ 256 mg/l Ahmed, F.E 2003 Genetically modified probiotics in foods Trends Biotechnol, 21: 491–497 Cakır, I 2003 Determination of some probiotic properties on Lactobacilli and Bifidobacteria Ankara University Thesis of Ph.D Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp 2009 Vi sinh học đại cương Nxb Đại học Cần Thơ: trang 1-15 Culligan, E.P., C Hill and R.D Sleator 2009 Probiotics and gastrointestinal disease: successes, problems, and future prospects Gut pathogens, 1(19): 1-12 Dung, T.T., F Haesebrouck, N.A Tuan, P Sorgeloos, M Baelem and A Decostere, 2008 Antimicrobial susceptibility pattern of Edwarsiella ictaluri isolate from natural outbreaks of bacillary necrosis of Pangasianodon hypophthalmus in Vietnam Microbial Drug Resistance, 14(4): 311-316 EI-Naggar MYM (2004) Comparative study of probiotic cultures to control the growth of E coli O157:H7 and Salmonella typhimurium Biotechnol, 3: 173-180 Fuller, R 1989 Probiotics in man and animals J Appl Bacteriol, 66: 65-78 Korhonen, J 2010 Antibiotic Resistance of Lactic Acid Bacteria Dissertations in Forestry and Natural Sciences University of Eastern Finland, pp.27-29 LỜI CẢM TẠ Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, anh chị bạn Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Công nghệ Sinh học Thực phẩm Sinh học phân tử Thực vật tận tình hỗ trợ nhiều từ q trình thực đến hồn thành nghiên cứu 16 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ Môi trường: 34 (2014): 8-17 12 Tambekar, D.H and S.A Bhutada 2010 An evaluation of probiotic potential of Lactobacillus sp from milk of domestic animals and commercial available probiotic preparations in prevention of enteric bacterial infections Recent Research in Science and Technology, 2(10): 82-88 13 White, D.G., P.F McDermott and R.D Walker 2003 Chapter 5: Antimicrobial Susceptibility Testing Methodologies Microbial food Safetry in Animal Agriculture Current Topics ME Torrence and RE Isaacson, eds Iowa State Press, Iowa, USA Martin, R., M Olivares, M.L Marin, L Fernandez, J Xaus and J.M Rodriguez 2005 Probiotic potential of Lactobacilli strains isolated from breast milk J Hum Lact, 21(1): 8-17 10 Matijasic, B.B., and I Rogelj 2000 Lactobacillus K7 – a New Candidate for a Probiotic Strain Food Technol Biotechnol., 38(2): 113-119 11 National Committee for Clinical Laboratory Standards 1997 Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests Approved standard M2-A6 National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa 17 ... giá khả chống chịu mơi trường pH thấp, kết khảo sát chứng minh ph n lớn dòng vi khuẩn lactic ph n lập có khả chống chịu điều kiện pH Môi trường pH dịch dày người đạt pH cao chứa thực ph m sản ph m... nghiệm sinh hóa (Bảng 1) 4.2 Kết ph n lập vi khuẩn lactic từ sữa dê men tiêu hóa Mười sáu dòng vi khuẩn ph n lập từ 10 mẫu sữa dê loại chế ph m Bioacimin Probio Trong đó, có 13 dòng ph n lập từ 10... Cần Thơ Ph n A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ Môi trường: 34 (2014): 8-17 Bảng 1: Đặc tính sinh học dòng vi khuẩn lactic ph n lập từ sữa dê chế ph m sinh học Dòng vi khuẩn Nguồn ph n lập Bio1.2