ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HÀ MẠNH QUYẾT XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘT BIẾN Ở CÁC GEN NPM1 VÀ FLT3 Ở BỆNH NHÂN LEUKEMIA CẤP DÒNG TỦY BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HÀ MẠNH QUYẾT XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘT BIẾN Ở CÁC GEN NPM1 VÀ FLT3 Ở BỆNH NHÂN LEUKEMIA CẤP DÒNG TỦY BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8420101.21 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân TS Dương Quốc Chính Hà Nội - 2018 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới: PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân, Trưởng Bộ môn Di truyền học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQGHN Người thầy dìu dắt chia sẻ cho em kiến thức khoa học quý giá từ ngày đầu trình học tập nghiên cứu TS Dương Quốc Chính, Trưởng Khoa Di truyền - Sinh học phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương Người thầy tận tâm hướng đẫn, bảo cho em kiến thức, kỹ phương pháp nghiên cứu khoa học quý giá suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Khoa Sau đại học, Khoa Sinh học, Bộ môn Di truyền học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQGHN giúp đỡ em tận tình thời gian học tập hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thùy Trang, ThS Nguyễn Lê Anh, ThS Trần Tuấn Anh tập thể cán Khoa Di truyền - Sinh học phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện cho em trình học tập, nghiên cứu hồn thiện kỹ thuật đề tài nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Trung tâm Huyết học - Truyền máu, đơn vị Xét nghiệm Huyết học - Trung tâm Xét Nghiệm, bệnh viện Đa khoa tỉnh Phú Thọ tạo điều kiện xếp công việc thuận lợi cho em q trình hồn thành khóa học Sau cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, người ln theo sát, quan tâm, động viên, khích lệ chỗ dựa vững để em yên tâm học tập, công tác hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn Hà Nội, tháng 12 năm 2018 Hà Mạnh Quyết LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan nghiên cứu em tham gia thực Khoa Di truyền - Sinh học phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương cho phép sử dụng để làm luận văn Các số liệu luận văn có thật, em thu thập thực cách khoa học xác Kết nghiên cứu chưa công bố tài liệu khác Nghiên cứu nhằm mục đích khoa học, khơng nhằm mục đích riêng khác DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AML cDNA CML DNA DEPC dNTP ddNTP EB FAB FLT3 ITD MDS NC NST NPM1 POS PAS RNA RT-PCR TKD WHO Wt Leukemia cấp (Acute myelogenlous leukemia) -complementary Deoxyribonucleic Acid Chronic myeloid leukemia Deoxyribonucleic Acid Diethylpyrocarbonate Deoxynucleoside triphosphate Dideoxynucleoside triphosphate Elution buffer French - American - British FMS - like tyrosine kinase Internal tandem duplication Myelodysplastic Syndrome Negative Nhiễn sắc thể Nucleophosmine Positive Periodic - Acid - Shiff Ribonucleic Acid Reverse Transcriptase - Polymerasa Chain Reaction Tyrosin kinase domain World Health Organization Kiểu dại MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Leukemia cấp dòng tủy 1.2 Lịch sử phát leukemia cấp 1.3 Cơ chế bệnh sinh leukemia cấp 1.3.1 Sinh máu bình thường leukemia cấp 1.3.2 Sự liên quan hệ thống gen tế bào với ung thư 1.3.3 Cơ chế tổn thương mức độ phân tử dẫn đến leukemia cấp 1.3.4 Một số nguyên nhân khác liên quan đến bệnh leukemia cấp 1.4 Các phương pháp chẩn đoán leukemia cấp 1.4.1 Phương pháp Hình thái học 1.4.2 Phương pháp Miễn dịch học 1.4.3 Phương pháp Di truyền tế bào Sinh học phân tử 1.5 Phân loại leukemia cấp 1.5.1 Phân loại theo FAB (Pháp - Mỹ - Anh) 1.5.2 Phân loại theo WHO 1.6 Các đột biến gen leukemia cấp 1.6.1 Đột biến gen NPM1 1.6.2 Đột biến gen FLT3 1.6.3 Các loại đột biến khác 1.7 Một số kỹ thuật để phát đột biến gen leukemia cấp 1.7.1 Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) 1.7.2 Kỹ thuật RT - PCR 1.7.3 Kỹ thuật Nested PCR 1.7.4 Giải trình tự Sanger 1.7.4 Giải trình tự hệ hai NGS CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Hóa chất sinh phẩn 2.2.2 Trang thiết bị, máy móc 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 2.3.2 Cách chọn mẫu 2.3.3 Sơ đồ nghiên cứu 3 4 8 12 12 13 13 14 15 15 17 20 21 21 22 23 23 24 25 25 25 25 25 26 26 26 27 2.3.4 Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 2.4 Xử lý số liệu 2.5 Vấn đề đạo đức nghiên cứu CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Hoàn thiện quy trình phát đột biến FLT3 NPM1 3.1.1 Tách chiết RNA từ mẫu máu ngoại vi dịch tủy xương 28 34 34 35 35 35 3.1.2 Nhân đoạn gen chứa đột biến FLT3 - ITD 3.1.3 Nhân đoạn gen chứa đột biến FLT3 - TKD 3.1.4 Nhân đoạn gen chứa đột biến NPM1-mutA 3.2 Đặc điểm đột biến FLT3 NPM1-mutA 3.2.1 Tỷ lệ mắc bệnh AML theo tuổi 3.2.2 Tỷ lệ mắc bệnh AML theo giới 3.2.3 Đặc điểm người bệnh có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3 - ITD, FLT3 TKD theo nhóm tuổi 3.2.4 Tỷ lệ xuất loại đột biến NPM1-mutA, FLT3 - ITD, FLT3 TKD 3.2.5 Mối liên quan đột biến NPM1-mutA FLT3 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 35 39 42 45 45 46 47 48 49 51 52 DANH MỤC BẢNG Bảng Phân loại AML theo FAB 1986 Bảng Phân loại AML theo WHO 2008 13 14 Bảng Các loại đột biến NPM1 AML 15 Bảng Thể tích thành phần tổng hợp cDNA 30 Bảng Thành phần thể tích master mix phản ứng RT - PCR nhân đoạn 31 gen FLT3-ITD Bảng Thành phần thể tích master mix phản ứng RT - PCR nhân đoạn 32 gen FLT3-TKD cắt sản phẩm PCR với EcoRV Bảng Thành phần thể tích master mix phản ứng RT - PCR nhân đoạn gen NPM1mutA Bảng Tỷ lệ mắc AML theo tuổi Bảng Tỷ lệ người bệnh có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3 - ITD, FLT3 TKD theo nhóm tuổi Bảng 10 Tỷ lệ loại đột biến NPM1-mutA, FLT3 - ITD, FLT3 - TKD 33 45 47 48 DANH MỤC HÌNH Hình Hình ảnh leukemia cấp tiêu nhuộm giemsa Hình Hình ảnh leukemia cấp dương tính với Peroxydase Hình Hình ảnh leukemia cấp dương tính với Sudan B Hình Hình ảnh leukemia cấp dương tính với PAS Hình Hình ảnh nhuộm Esterase đặc hiệu không đặc hiệu leukemia cấp Hình Vị trí gen NPM1 NST Hình Vị trí gen FLT3 NST Hình Cấu trúc gen FLT3 Hình Sơ đồ nghiên cứu Hình 10 Sản phẩm FLT3-ITD điện di gel agarose Hình 11 Hình ảnh điện di sản phẩm FLT3-ITD sau thay đổi nhiệt độ nồng độ mồi Hình 12 Hình ảnh so sánh trình tự NGS trình tự kiểu dại Hình 13 Sản phẩm FLT3-TKD trước (A) sau ủ với EcoRV (B) Hình 14 Sản phẩm FLT3-TKD trước (A) sau thay đổi nhiệt độ ủ với EcoRV (B) Hình 15 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR chứa đột biến NPM1-mutA Hình 16 Hình ảnh tối ưu nhiệt độ Tm mồi NPM1-mutA Hình 17 Tỷ lệ mắc bệnh AML theo giới Hình 18 Tỷ lệ xuất đột biến kép 10 10 11 15 17 17 27 36 37 38 40 41 43 44 46 49 ĐẶT VẤN ĐỀ Leukemia cấp bệnh thường gặp bệnh máu, tỷ lệ tử vong cao Các phương pháp chẩn đốn cổ điển hình thái học tế bào, hóa học tế bào tiêu chuẩn khơng thể thiếu chẩn đốn leukemia Tuy nhiên, phương pháp có số hạn chế trường hợp khó chẩn đoán việc theo dõi tiến triển bệnh Từ năm 2001, Tổ chức Y tế giới đề xuất phân loại leukemia cấp dòng tủy dựa biến đổi di truyền Một số gen nghiên cứu ghi nhận có vai trò quan trọng trình điều trị, theo dõi tiên lượng bệnh hiệu [27] Trong nghiên cứu giới, xác định biến đổi vật chất di truyền bệnh leukemia là: đột biến nhiễm sắc thể đột biến gen Qua nuôi cấy tế bào, làm tiêu xác định NST đồ (Karyotype), nhà khoa học phát khoảng 55% người bệnh có đột biến NST, 45% số người bệnh có NST bình thường Vì vậy, việc xác định đột biến gen cần thiết [20, 23] Hơn 80% đột biến gen tìm thấy người bệnh mắc leukemia cấp có NST bình thường xảy gen Nuleophosmin (NPM1), Fms-like tyrosine kinase (FLT3) CCAAT - enhancer binding protein alpha (CEBPA) [40] Trong thời gian qua, việc chẩn đoán leukemia cấp sinh học phân tử có nhiều bước tiến vượt bậc, có nhiều kỹ thuật nghiên cứu ứng dụng cho kết đáng tin cậy như: RT-PCR, Real Time PCR, giải trình tự Sanger, NGS có phương pháp RT-PCR phương pháp đơn giản, hiệu áp dụng ngày rộng rãi Thế giới Việt Nam Phương pháp bổ sung, hỗ trợ cho phương pháp hình thái học như: tăng tính đặc hiệu chẩn đoán, điều trị tiên lượng bệnh Ở Việt Nam, có số nghiên cứu đột biến gen NPM1 FLT3 người bệnh leukemia cấp tiến hành nhiều góc độ khác nhau: nghiên cứu tỷ lệ đột biến, mối liên quan đột biến với lâm sàng Nên nghiên cứu áp dụng kỹ thuật cho chẩn đoán, điều trị tiên lượng bệnh cần thiết Vì tiến hành nghiên cứu với mục tiêu sau: Hồn thiện quy trình kỹ thuật RT - PCR để xác định đột biến gen NPM1-mutA FLT3 leukemia cấp dòng tủy Khảo sát tỷ lệ đột biến NPM1-mutA FLT3 người bệnh leukemia cấp dòng tủy thu thập Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương thời gian từ tháng 8/2017 đến tháng 7/2018 10 Các nghiên cứu đột biến FLT3 - ITD đưa tiên lượng xấu kết hợp với đột biến NPM1-mutA lại làm cải thiện tình trạng bệnh tật tăng thời gian sống người bệnh Kết nghiên cứu Boddu cho thấy tầm quan trọng tiên lượng đột biến kép [41] Do đó, đột biến FLT3-TKD nên xác định cách có hệ thống thời điểm chẩn đốn ban đầu người bệnh AML áp dụng phân loại, tiên lượng AML KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã hoàn thiện quy trình kỹ thuật RT-PCR để phát đột biến FLT3 - ITD, FLT3 - TKD NPM1-mutA bệnh leukemia cấp dòng tủy Bước đầu khảo sát tỷ lệ xuất đột biến, bao gồm: - Tỷ lệ đột biến gen FLT3 - ITD 16,5%, chủ yếu nhóm tuổi từ 31 - 60 (56,0%) - Tỷ lệ đột biến gen FLT3 - TKD 9,3%, chủ yếu nhóm tuổi 16 - 30 (25,0%) - Tỷ lệ đột biến gen NPM1-mutA 13,9%, chủ yếu nhóm tuổi 46 - 60 (40,0%) - Tỷ lệ xuất đột biến kép: NPM1+/FLT3-ITD+: 5%, NPM1+/FLT3-TKD+ : 3,5% KIẾN NGHỊ Tiếp tục triển khai xét nghiệm xác định đột biến FLT3 - ITD, FLT3 TKD NPM1-mutA sở y tế chuyên khoa Huyết học cho bệnh leukemia cấp dòng tủy Nghiên cứu đặc điểm đột biến FLT3 NPM1 với cỡ mẫu lớn để có đánh giá tổng quan tỷ lệ xuất người bệnh cộng đồng TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Vũ Bảo Anh, Nguyễn Hà Thanh (2012), ʺMột số biến đổi gen lơ xê mi cấp dòng tủyʺ, Một số chuyên đề Huyết học - Truyền máu, Nhà xuất Y học, Hà Nội, 4, tr 167 - 172 Trần Văn Bé (2004), ʺTình hình điều trị bệnh bạch cầu cấp Bệnh viện Truyền máu Huyết học Thành phố Hồ Chí Minh năm 1998 - 2003ʺ, Tạp chí Y học Việt Nam, 6, tr 41-51 Trương Cơng Duẩn (2004), ʺSinh máu bình thườngʺ, Bài giảng Huyết học Truyền máu, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 8-19 Nguyễn Công Khanh, Dương Bá Trực, Đỗ Thị Minh Cầm (1987), ʺPhân loại lơ xê mi cấp trẻ emʺ, Y học Việt Nam, 6, tr 216-223 Nguyễn Công Khanh, Dương Bá Trực, Trần Thị Hồng Hà (2006), ʺNghiên cứu phân loại bệnh lơ xê mi cấp trẻ em Bệnh viện Nhi Trung ươngʺ, Y học thực hành, 545, tr 118-122 Nguyễn Ngọc Minh (2007), ʺLơ xê mi cấp dòng hạtʺ, Bài giảng Huyết học Truyền máu, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr.221-222 Kiều Thị Vân Oanh (2013), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy với đột biến gen FLT3-ITD NPM1-mut A, Luận văn thạc sỹ Y khoa, Trường Đại học Y Hà Nội Đỗ Trung Phấn (2009), Bệnh lý tế bào nguồn, Nhà xuất y học, Hà Nội Vũ Thị Minh Phương 2009, Nghiên cứu số biến đổi gen đặc trưng đáp ứng điều trị công bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy, Luận án tiến sỹ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội 10 Bạch Quốc Tuyên, Đỗ Xuân Thiêm (1980), ʺHóa học tế bào chẩn đoán leukemia cấpʺ, Y học Việt Nam, 100, tr 35-40 11 Nguyễn Triệu Vân, Đỗ Trung Phấn, Nguyễn Anh Trí cs (2006), ʺỨng dụng phương pháp miễn dịch chẩn đoán số thể bệnh lơ xê mi cấpʺ, Y học thực hành, 545, tr.99-102 12 Nguyễn Triệu Vân, Nguyễn Anh Trí, Đỗ Trung Phấn (2009) ʺGiá trị số dấu ấn miễn dịch chẩn đoán, phân loại leukemia cấp Viện Huyết học Truyền máuʺ, Y học Việt Nam, 362, tr 67-72 13 Nguyễn Triệu Vân, (2008), Nghiên cứu giá trị số dấu ấn biệt hóa tế bào máu chẩn đoán phân loại tiên lượng bệnh lơ xê mi cấp người lớn Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Luận án tiến sỹ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội 14 Phan Thanh Vân, 2013, Ứng dụng kỹ thuật khuếch đại gen khảo sát tổ hợp gen thường gặp bệnh lý bạch cầu cấp, Luận án tiến sỹ Y học, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh 15 Phạm Quang Vinh, Đỗ Trung Phấn, Trương Công Duẩn cs (1998), Một số biến loạn nhiễm sắc thể bệnh nhân lơ xê mi cấp theo FAB, Y học Việt Nam, 12, tr 32-35 16 Phạm Quang Vinh (2003), Nghiên cứu bất thường nhiễm sắc thể bệnh lơ xê mi cấp người lớn Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Luận án tiến sỹ Y học, Trường đại học Y Hà Nội 17 Phạm Quang Vinh (2012), ʺLơ xê mi cấpʺ, Bài giảng bệnh học nội khoa, Nhà xuất Y học, Hà Nội 18 Phạm Quang Vinh (2013), Bất thường di truyền tế bào bệnh máu ác tính, Nhà xuất Y học 19 Phạm Quang Vinh, Vũ Minh Phương, Kiều Thị Vân Oanh (2013), Nghiên cứu tỷ lệ xuất đột biến gen NPM1-mutA FLT3-ITD bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy, Kỷ yếu cơng trình nghiên cứu khoa học năm 2013, tr206-212 Tiếng Anh 20 Becker H, Marcucci G, Maharry K, Radmacher MD, Margeson KM, Whitman SP, Wu YZ, Schwind S, Paschka P, Powell BL, Carter TH, Kolitz ZE, Wetzler M, Carrol AJ, Baer MR, Caligiuri MA, Larson RA, Bloomfield CD (2010), Favorable prognostic impact of NPM1 mutations in older patients with cytogenetically normal de novo acute myeloid leukemia and associated gene and microRNA-expression signatures: a Cancer and Leukemia Group B study, J Clin Oncol, 28, pp.596-604 21 Bennett J.M., Catovsky D et al (1986), ʺProposals for the classification of the acute leukaemias (FAB cooprative group)ʺ, Brj Haematol, 33, pp 451-458 22 Boddu, Hagop Kantarjian, Gautam Borthakur, Tapan Kadia, Naval Daver, Sherry Pierce, Michael Andreeff, Farhad Ravandi, Jorge Cortes, and Steven M Kornblau (2017), ʺCo-occurrence of FLT3-TKD and NPM1 mutations defines a highly favorable prognostic AML groupʺ, blood advance, DOI 10.1182 23 Brunangelo Falini and et al (2011) ʺAcute myeloid leukemia with mutated mucleophosmin (NPM1): is it a distinct entily?ʺ, Blood, 117, pp.1109-1120 24 Calvo K.L., Ojeda M.J., Ammatuna E., Lavorgna S., Ottone T., Targovnik H.M., Lo-Coco F., Noguera N.L (2009), Detection of the nucleophosmin gen mutations in acute myelogenuos leukemia through RT-PCR and polyacrylamide gel electrophoresis, European Journal of Hematology, 82, pp 69-72 25 Chetsada B, Wanna T, Chirayu U, et al 2005, Nucleophomin mutation in Southeast Asian acute myeloid leukemia: eight novel variants, FLT3 coexistence and prognostic impact of NPM1/FLT3 mutation, Hematologica, 93, pp 57-65 26 Christian Thiede, Christine Steudel, Brigitte Mohr, Markus Schaich, Ulrike Schaăkel, Uwe Platzbecker, Martin Wermke, Martin Bornhaăuser, Markus Ritter, Andreas Neubauer, Gerhard Ehninger, and Thomas Illmer (2002), ʺAnalysis of FLT3-activating mutations in 979 patients with acute myelogenous leukemia: association with FAB subtypes and identification of subgroups with poor prognosisʺ, Bool 99, pp 4326-4335 27 Dalia N, et al (2001), ʺMohammed Abdel Rahman and al Incidence and Prognostic Value of NPM1 and FLT3 Gene Mution an AML with Normal Karyotypeʺ, The open Hematology jourmal, pp 33-38 28 Davey F.R, Nelson D.A (1995), Periodic acid - Schiff stain In: Williamʹs Hematology, Mc Graw-Hill Inc, edited by Beutler E Lichtman M.A, Coller B.S, Chapter L26 29 Dushyant Kumar, Anurag Mehta, Manoj Kumar Panigrahi, Sukanta Nath, Kandarpa Kumar Saikia (2018), ʺNPM1 Mutation Analysis in Acute Myeloid Leukemia: Comparison of Three Techniques - Sanger Sequencing, Pyrosequencing, and Real-Time Polymerase Chain Reactionʺ, Turk J Hematol, 35, pp.49-53 30 Falini B, Mecucci C, Tiacci E, Alcalay M, Rosati R, Pasqualucci L, La Starza R, Diverio D, Colombo E, Santucci A, Bigerna B, Pacini R, Pucciarini A, Liso A, Vignetti M, Fazi P, Meani N, Pettirossi V, Saglio G, Mandelli F, LoCoco F, Pelicci PG, Martelli MF (2005), ʺGIMEMA Acute Leukemia Working Party Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotypeʺ, N Engl J Med, 352, pp.254-266 31 Gale RE, Green C, Allen C, Mead AJ, Burnett AK, Hills RK, Linch DC; Medical Research Council Adult Leukaemia Working Party (2008), ʺThe impact of FLT3 internal tandem duplication mutant level, number, size, and interaction with NPM1 mutations in a large cohort of young adult patients with acute myeloid leukemiaʺ, Blood,111, pp.2776-2784 32 Gilliland D.G and Griffin J.D (2002), “Role of FLT3 in leukemia”, Current opinion in hematology, 9, pp 274-281 33 Griffin J.D, et al (2003), “The roles of FLT3 in hematopoiesis and leukemia”, Blood, 100, pp 1532-1542 34 Goodeve A.C., Wilson G.A., Care R.S., et al (2001), Identification of novel FLT3 Asp 835 mutations in adult acute myeloid leukemia, Bristish Journal Hematology, 113, pp 983-988 35 Gorello P, Cazzaniga G, Alberti F, Dell’Oro MG, Gottardi E, Specchia G, Roti G, Rosati R, Martelli MF, Diverio D, Lo Coco F, Biondi A, Saglio G, Mecucci C, Falini B (2006), ʺQuantitative assessment of minimal residual disease in acute myeloid leukemia carrying nucleophosmin (NPM1) gene mutationsʺ, Leukemia, 20, pp 1103–1108 36 Hitoshi Kiyoi and Tomoki Naoe (1999), “FLT3 Mutations in Acute Myeloid Leukemia”, Leukemia, 91, pp 236-244 37 James M.F (2010), New prognostic marker in acute myelogenous leukemia: Perspective from the Clinic Hematology, pp 47-55 38 John PG, Maria RB, M CK (2004), Acute Myeloid Leukemia in Adults Wintrobeʹs Clinical Hematology, 11th Edition 39 Lichtman M.A, Lieveld J.L (2001), ʺAcute myelogenous leukemiaʺ, William`s Hematology, Mc Graw - Hill 40 Lin L.I., Chen C.Y., Lin D.T., Tsay W., Tang J.L., Yeh Y.C., Shen H.L., Su F.H., Yao M., Huang S.Y., and Tien H.F (2005), Characterization of CEBPA mutations in acute myeloid leukemia: most patients with CEBPA mutations have biallelic mutations and show a distinct immunophenotype of the leukemic cells, Clicnical Cancer Research, 11, pp 1372-1379 41 Liu Y, He P, Liu F, Shi L, Zhu H, Zhao J, Wang Y, Cheng X, Zhang M (2014), ʺPrognostic significance of NPM1 mutations in acute myeloid leukemia: a metaanalysisʺ Mol Clin Oncol, 2, pp.275-281 42 Marielle Perry, Sarah Bertoli, Clément Rocher, Sandrine Hayette, Sophie Ducastelle, Fiorenza Barraco, Hélène Labussière-Wallet, Gilles Salles, Christian Recher, Xavier Thomas, Etienne Paubelle (2018), FLT3-TKD mutations associated to NPM1 mutations define a favorable-risk group in patients with acute myeloid leukemia, Clinical Lymphoma, Myeloma and Leukemia, 1133 43 Meshinchi S., Stirewalt D.L., Alonzo T.A., Boggon T.J., Gerbing R.B., Rocnik J.L., Lange B.J., Gilliland D.G., and Radich J.P (2008), “Structural and numerical variation of FLT3/ITD in pediatric AML”, Blood, 15, pp 42634269 44 Naeim F (1998), Acute Leukemia, in Pathology of Bone Marrow Second Edition, Edited by Charles W, Mitcheel, William and Wilkins, pp 194-240 45 Press O W (2001), ʺFollicular lymphomaʺ, Williams Hematology edit by K Kaushansky, M.A Lichtman, E Beutler Mc Graw Hill 46 Reikvam H, Hatfield KJ, Kittang AO, Hovland R, Bruserud (2011), ʺAcute myeloid leukemia with the t(8; 21) translocation: clinical consequences and biological implicationsʺ, Journal of Biomedicine and Biotechnology, 23 pages doi: 10.1155/2011/104631 47 Rosemary E.G and al (2008), ʺThe impact of FLT3 internal tandem duplication mutan lever, number, size, and interraction with NPM1 mutation in a large cohort of young adult patients acute myeloid leukemiaʺ, Blood, 111, pp 27762784 48 Schnittger, Schoch C, Kern W, et al (2005), ʺNucleophosmin gene mutations are predictors of favorable prognosis in acute myelogenous leukemia with a normal kayotypeʺ Blood, 106, pp 3733-3739 49 Shalvi V.M, Shilin N, shukla, et al (2011), ʺComprehensive FLT3 analysis in Indian acute myeloid leukemiaʺ, Blood & Lympho, 50 Suzuki T, Kiyoi H, Ozeki K, Tomita A, Yamaji S, Suzuki R, Kodera Y, Miyawaki S, Asou N, Kuriyama K, Yagasaki F, Shimazaki C, Akiyama H, Nishimura M, Motoji T, Shinagawa K, Takeshita A, Ueda R, Kinoshita T, Emi N, Naoe T (2005), ʺClinical characteristics and prognostic implications of NPM1 mutations in acute myeloid leukemiaʺ, Blood, 106, pp 2854-2861 51 Stirewalt D.L., Kopecky K.J., Meshinchi S., Appelbaum F.R., Slovak M.L., Willman C.L., and Radich J.P (2001), “FLT3, RAS, and TP53 mutations in elderly patients with acute myeloid leukemia”, Blood, 97, pp 3589-3595 52 Swerdlow S.H., Campo E, Harris N.L., et al (2008), Tumours Haematopoietic and Lymphoid Tissues 4th ed Lyon, France: IARC Press; 2008 World Health Organization Classification of Tumours; vol 2, WHO 53 Thai MC, Steven EC (2004), ʺAcute Lymphoblastic Leukemia in Adultsʺ, Wintrobeʹs Clinical Hematology, 11th Edition 54 Thiede C, Creutzig E, Reinhardt D, Ehninger G, Creutzig U (2007), ʺDifferent types of NPM1 mutations in children and adults: evidence for an effect of patient age on the prevalence of the TCTG-tandem duplication in NPM1-exon 12ʺ, Leukemia, 21, pp.366-367 55 Tiziana Ottone and al (2008), An Allele-Specific RT-PCR Assay to Detect Type A Mutation of the Nucleophosmin-1 Gene in Acute Myeloid Leukemia, Journal of Molecular Diagnostics, 10, pp 212-216 56 Yamamoto Y., Kiyoi H., Nakano Y., Suzuki R., Kodera Y., Miyawaki S., Asou N., Kuriyama K., Yagasaki F., Shimazaki C., et al (2013), “Activating mutation of D835 within the activation loop of FLT3 in human hematologic malignancies”, Blood, 97, pp 2434-2439 57 Yeo-Kyeoung Kim, Sang-Ho Kim (2009), FLT3 intenrnal tandem duplication on acute myeloid Leukemia with normal karyotype Korean J Hematol, 42, pp 57-71 58 Zhao T, Zhu HH, Wang J, Jia JS, Yang SM, Jiang H, Lu J, Chen H, Xu LP, Zhang XH, Jiang B, Ruan GR, Wang DB, Huang XJ, Jiang Q (2013), Prognostic significance of early assessment of minimal residual disease in acute myeloid leukemia with mutated NPM1 patients, Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi, 38, pp.10-16 PHỤ LỤC NỒNG ĐỘ RNA TÁCH CHIẾT Mẫu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Nồng độ RNA 280,2 282,3 768,1 813,2 286,3 152,5 104,2 145,1 968,7 106,7 184,6 242,2 230,6 510,7 387,9 481,2 640,1 218,6 630,3 649,2 727,7 767,9 777,7 379,6 76,2 107 400,4 149,3 596,4 109,4 507,6 508,6 517,3 Đơn vị ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl 260/280 1,95 1,95 1,99 2,08 2,04 1,95 1,99 2,08 1,99 2,01 1,96 2,04 1,99 2,03 2,04 2,01 2,04 1,99 2,01 1,98 1,95 1,97 1,95 2,01 1,95 2,01 2,01 1,93 1,95 1,98 1,99 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 447,3 222,9 351,2 343,9 225,9 845,1 434,1 716,9 678,3 714,6 323,3 1409 822,1 904 689,2 486,6 583,9 522,5 630,7 729 472,5 197,3 1267,1 420,2 681,1 504,4 344,4 447,8 369,3 517,2 813,3 337,4 214,7 715,9 394 234,3 652,3 ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl 1,97 1,92 2,04 2,04 1,93 1,93 1,97 2,01 1,93 1,98 2,1 2,07 2,07 2,02 1,97 1,98 1,99 1,92 2,02 1,93 2,05 1,94 2,04 2,02 2,05 2,06 1,99 2,02 1,93 1,96 1,94 2,03 2,03 1,95 2,08 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 688,8 409,6 516,9 622 83,6 513 830,2 421 725,4 489,7 689,6 553,8 1164,6 688,5 597,6 488,4 373,5 512,4 304,3 227,1 286,7 825,6 558,6 829,9 414,6 599,7 245,3 404,6 430 351,5 487,5 331,1 812,5 646,1 465,8 367,2 747,2 ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl 2,07 2,04 2,01 2,07 2,02 2,06 2,08 2,05 2,07 2,05 2,08 1,94 2,07 1,99 1,95 2,05 2,03 2,06 2,06 1,97 2,03 1,91 2,02 1,96 1,93 1,93 1,97 1,99 2,03 1,97 1,95 2,02 1,93 1,96 1,95 2,02 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 208,5 274,2 265,4 246,8 585 203,1 213,5 224,3 357,6 258,9 255,1 98,4 156,9 403,5 263,3 254,5 446,4 352,3 433,3 323,2 236 164,8 286,7 419,2 601,5 245,1 690,1 214,6 688,9 199,2 624 424,2 322,1 476,4 415,9 480,7 253,7 ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl 1,94 2,08 2,05 2,03 2,02 1,99 2,04 2,09 2,01 2,03 2,06 2,05 2,08 2,04 2,02 2,01 2,04 2,05 2,02 2,04 1,99 1,94 1,99 1,97 1,96 2,08 1,95 2,05 2,02 1,99 1,93 2,03 2,07 1,98 2,05 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 473,4 517,6 338,7 263,4 1457,5 563,9 253,5 181,1 958,5 546 456,6 1009,3 324,4 258,1 648,3 621,6 375,4 422,3 321,2 497,3 401,7 843 288,9 738,4 369,8 570 460,1 330,7 129 456,4 630,2 161,6 290,5 627,3 447,7 528,6 757,6 ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl 2,09 1,99 2,01 2,03 2,03 1,99 2,01 1,96 1,94 1,97 2,01 2,09 1,99 1,97 2,06 2,04 1,98 1,94 1,96 1,95 2,01 2,07 2,02 2,04 2,02 1,99 2,03 1,94 1,94 1,94 2,06 1,96 1,98 2,07 1,96 2,02 1,97 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 515,6 163,2 427,2 575,9 250,7 280,6 438,7 611,7 205,9 786,5 259,6 325,5 1071,3 299,5 779 889,5 ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl ng/µl 2,05 1,91 2,02 1,98 1,99 2,04 2,01 1,91 2,06 1,98 1,97 2,05 2,02 2,07 2,1 ... truyền học Mã số: 8420101.21 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân TS Dương Quốc Chính Hà Nội - 2018 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn em xin bày tỏ lòng cảm... dựa vững để em yên tâm học tập, công tác hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn Hà Nội, tháng 12 năm 2018 Hà Mạnh Quyết LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan nghiên cứu em tham gia thực Khoa Di truyền... thức, kỹ phương pháp nghiên cứu khoa học quý giá suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Khoa Sau đại học, Khoa Sinh học, Bộ môn Di truyền học,