ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Thị Hồng Nhung PHÂN LẬP VI SINH VẬT TỪ CÂY RONG BIỂN THUỘC TỈNH KHÁNH HỊA VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Thị Hồng Nhung PHÂN LẬP VI SINH VẬT TỪ CÂY RONG BIỂN THUỘC TỈNH KHÁNH HỊA VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Hữu Cường PGS.TS Bùi Thị Việt Hà Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Hữu Cường PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, người thầy tận tình hướng dẫn bảo em trình hoàn thành đề tài luận văn này, chia sẻ với em nhiều kinh nghiệm quý báu cho đường phát triển nghiệp sau Em xin chân thành cảm ơn tới thầy cô Bộ mơn Vi sinh vật học tồn thể cán Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQGHN) giảng dạy, tạo điều kiện giúp đỡ truyền đạt kiến thức cho em suốt năm học tập nghiên cứu trường Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hố học hợp chất thiên nhiên,Viện Hàn lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam ủng hộ giúp đỡ em suốt trình thực luận văn Cuối em muốn gửi lời cảm ơn bố mẹ gia đình, bạn bè ln bên cạnh ủng hộ động viên em suốt thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Học viên Lê Thị Hồng Nhung DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BCS Bovine calf serum DPPH 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6- Huyết bò trinitrophenyl)hydrazyl pNPG 4-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside LB Luria Bertani Broth MEME Minimum essential medium with Môi trường tối Eagle’s salt thiểu với muối Eagle NAA Non-essential amino acids Axit amin không thiết yếu PCR Polymerase chain reaction Phản ứng kéo dài chuỗi PDA Potato dextrose agar Thạch đường khoai tây PSF Penicillim – streptomycin sulffat – fungizone VSV Vi sinh vật OTU operational taxonomic unit Đơn vị phân loại (tiến hóa) DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Hoạt tính ức chế enzyme glucosidase giá trị IC50 mẫu 26 Bảng 3.2 Hoạt tính gây độc tế bào cao chiết nấm 28 Bảng 3.3 Giá trị SC50 bao vây gốc tự DPPH* mẫu lựa chọn 30 Bảng 6.1 Các chủng vi khuẩn phân lập mẫu rong 42 Bảng 6.2 Các chủng nấm phân lập mẫu rong khác 45 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Ảnh minh họa đa dạng vi sinh vật bề mặt rong biển [6] Hình 1.2 Ảnh minh họa vi khuẩn, nấm rong biển sản xuất số chất trao đổi thứ cấp [29] 11 Hình 1.3 Bảng phân bố hợp chất từ nấm có nguồn gốc biển khác [32] 12 Hình 3.1 Ảnh phân lập vi khuẩn nội sinh 22 Hình 3.2 Ảnh số nấm sợi nội sinh phân lập rong 23 Hình 3.3 Quá trình lên men thu cao chiết vi sinh vật 25 Hình 3.4 Sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase 26 Hình 3.5 Hình ảnh khuẩn lạc nấm HN37 27 Hình 3.6 Ảnh thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào người HepG2 (trái) LU (phải), khoanh chữ nhật, màu trắng có hoạt tính gây độc (lặp lại lần) 29 Hình 3.7 Khuẩn lạc chủng nấm HN22 29 Hình 3.8 Xác định hoạt tính bao vây gốc tự DPPH* mẫu 30 Hình 3.9 Khuẩn lạc nấm HN33 31 Hình 3.10 Tinh sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi EF4f/EF3r nhân gene 18S rRNA nấm HN22, HN37 HN33 32 Hình 3.11 Cây phát sinh chủng nấm HN37 dựa trình tự 18S rDNA, sử dụng phần mềm MEGA7, phương pháp Neibor Joining, giá trị Bootstrap sử dụng 500 33 Hình 3.12 Cây phát sinh chủng nấm HN22 dựa trình tự 18S rDNA, sử dụng phần mềm MEGA7, phương pháp Neibor Joining, giá trị bootstrap sử dụng 500 34 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Vi sinh vật sống rong biển mối quan hệ chúng 1.1.1 Rong biển 1.1.2 Vi sinh vật sống rong biển 1.2 Vi sinh vật sống nội sinh rong 1.2.1 Đa dạng vi sinh vật sống rong 1.2.2 Sự tương tác vi sinh vật rong biển 1.2 Tình hình nghiên cứu hợp chất tự nhiên hoạt tính sinh học từ vi sinh vật sống rong biển 11 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14 2.1 Vật liệu 14 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.1.2 Hóa chất thiết bị 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật 15 2.2.2 Phương pháp lên men thu cao chiết vi sinh vật 18 2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 18 2.2.4 Phương pháp định danh phân loại 20 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Phân lập vi sinh vật sống rong 22 3.1.1 Vi khuẩn 22 3.1.2 Vi nấm 23 3.2 Lên men vi sinh vật thu cao chiết 24 3.3 Hoạt tính sinh học cao chiết vi sinh vật 25 3.3.1 Hoạt tính ức chế enzyme-glucosidase 25 3.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư người 27 3.3.3 Hoạt tính chống oxi hóa cao chiết nấm 30 3.3.4 Vị trí phân loại chủng vi sinh vật 31 KẾT LUẬN 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 MỞ ĐẦU Với chiều dài 3.260 km bờ biển diện tích bề mặt triệu km2, vùng biển nước ta đánh giá 16 trung tâm đa dạng sinh học lớn giới Vì vậy, cơng tác điều tra, nghiên cứu mơi trường tài nguyên sinh vật biển vấn đề cần quan tâm nghiên cứu Trong đó, theo ước tính Việt nam có 638 lồi rong biển, 100 lồi số có tiềm sử dụng khoảng 60 loài sử dụng làm thực phẩm, thuốc nguồn sản xuất keo công nghiệp (agar, carrageenan) hay alginate, fucoidan (một loại polysaccharide dùng điều trị ung thư) [13] Ở Việt Nam giới, nhiều loài rong biển ứng dụng y dược để chữa bệnh với vai trò kháng khuẩn, kháng virus, giảm cholesterol, chống tiểu đường, chống ung thư, lão hóa Bởi chúng chứa hợp chất có giá trị peptide, axit amin, vitamin, chất màu, chất polysaccharide (như fucoidan), chất trao đổi thứ cấp khác [1] Rong biển nơi cư trú nhiều loài sinh vật vi khuẩn, nấm, vi tảo, ấu trùng giáp xác, virus, vi khuẩn chiếm chủ yếu, với mật độ 102-107 CFU/cm2 mẫu, so với nấm khoảng 104 Bề mặt rong nơi có tính cạnh tranh cao nguồn thức ăn giới hạn không gian khắc nghiệt vi sinh vật tiết kháng sinh nên vi sinh vật rong có tính đặc thù định Vi sinh vật có chế tổng hợp chất trao đổi thứ cấp, chất kháng sinh tiêu diệt ức chế vi khuẩn cố định vi khuẩn lên rong Theo ước tính, hợp chất phát từ nấm biển sống rong chiếm đa số (21%), tiếp sau bọt biển (19%), đước biển (16%) thấp nước biển (chỉ 1%) Chính vậy, nguồn chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật có liên quan tới rong biển cho có tiềm [32] Việc phân lập vi sinh vật sống rong nghiên cứu hoạt tính sinh học có liên quan tới lĩnh vực y dược cần thiết Với vi sinh vật, chủ động lên men, sản xuất chất có hoạt tính nhằm tăng suất rút ngắn thời gian sản xuất hoạt chất, đảm bảo tính hiệu quả, ổn định sản suất Hơn nữa, việc tìm kiếm lồi vi sinh vật biển nhiệt đới có ý nghĩa khoa học thực tiễn Chính vậy, chúng tơi đề xuất thực đề tài: “Phân lập vi sinh vật từ rong biển thuộc tỉnh Khánh Hòa nghiên cứu số hoạt tính sinh học chúng’’ với mục tiêu tìm kiếm chủng vi sinh vật sống rong có hoạt tính ứng dụng ngành y dược Mục tiêu đề tài - Tạo sưu tập 100 chủng vi sinh vật từ rong biển thuộc tỉnh Khánh Hòa, Việt Nam - Nghiên cứu hoạt tính sinh học vi sinh vật phân lập Nội dung luận văn gồm: - Phân lập 100 chủng vi sinh vật (gồm vi khuẩn nấm) từ loài rong biển - Lên men chủng vi sinh vật 50-100 chủng/0,5 L chủng Từ dịch lên men đó, chiết chất trao đổi thứ cấp để thu cao chiết - Đánh giá hoạt tính (i) gây độc tế bào ung thư; (ii) chống oxi hóa (iii) ức chế enzyme -glucosidase 50-100 cao chiết vi sinh vật - Xây dựng phát sinh lồi chủng có hoạt tính (mỗi hoạt tính, chọn chủng) dựa trình tự gene 18S rRNA 18 Kizhakkekalam V.K, and Chakraborty K (2018) Pharmacological properties of marine macroalgae-associated heterotrophic bacteria Archives of Microbiology https://doi.org/10.1007/s00203-018-1592-1 19 Kumar S A., Brown L (Sep 2013) “Seaweeds as potential therapeutic interventions for the metabolic syndrome,” Rev Endocr Metab Disord., vol 14, no 3, pp 299–308 20 Lam C., Stang A., Harder T (Mar 2008) “Planktonic bacteria and fungi are selectively eliminated by exposure to marine macroalgae in close proximity,” FEMS Microbiol Ecol., vol 63, no 3, pp 283–291 21 Largo D B., Fukami K., Adachi M., Nishijima T (1997) “Direct enumeration of bacteria from macroalgae by epifluorescence microscopy as applied to the fleshy red algae Kappaphycus alvarezii and Gracilaria spp (Rhodophyta),” J Phycol., vol 33, no 3, pp 554–557 22 Liu F., Pang S (2010) “Nonculturability of the pathogenic Vibrio parahaemolyticus in live culture of Grateloupia turuturu is associated with bacterial attachment to the algal thalli,” Acta Oceanol Sin., vol 29, no 6, pp 92–103 23 Longford S., Tujula N., Crocetti G., Holmes A., Holmström C., et al (Aug 2007) “Comparisons of diversity of bacterial communities associated with three sessile marine eukaryotes,” Aquat Microb Ecol., vol 48, no 3, pp 217–229 24 Loque C P., Medeiros A O., Pellizzari F M., Oliveira E C., Rosa C A., et al (2010) “Fungal community associated with marine macroalgae from Antarctica,” Polar Biol., vol 33, no 5, pp 641–648 25 MacArtain P., Gill C I R., Brooks M., Campbell R., Rowland I R (2007) “Nutritional value of edible seaweeds,” Nutr Rev., vol 65, no 12, pp 535–543 39 26 Mahadevan G., Murugan A., Mahendran S., Gautam K., Ravi V (2013) “Antifouling activity of the green seaweed Ulva reticulata and its epiphytic bacterial,” Int J Advacesd Life Sci., vol 6, no 5, pp 417–424 27 Mathan S., Subramanian V., Nagamony S., Ganapathy K (2013) “Isolation of endophytic fungi from marine algae and its bioactivity,” Int J Res Pharm Sci., vol 4, no 1, pp 45–49 28 Mccue P., Kwon Y I., Shetty K (2005) “Anti-amylase, anti-glucosidase and anti-angiotensin I-converting enzyme potential of selected foods,” J Food Biochem., vol 29, no 3, pp 278–294 29 Saleem M., Ashraf M., Saleem M., Ali S., Hussain S., et al (2013) “NPR2007-fungal Marine natural products of fungal origin,” Nat Prod Rep., no OCTOBER 30 Shalaby E A., Shanab S M M (2013) “Comparison of DPPH and ABTS assays for determining antioxidant potential of water and methanol extracts of Spirulina platensis,” Indian J Mar Sci., vol 42, no 5, pp 556–564 31 Solis M J L., Draeger S., Dela Cruz T E E (2010) “Marine-derived fungi from Kappaphycus alvarezii and K striatum as potential causative agents of ice-ice disease in farmed seaweeds,” Bot Mar., vol 53, no 6, pp 587–594 32 Suryanarayanan T S., Thirunavukkarasu N., Govindarajulu M B., Gopalan V (2012) “Fungal endophytes: An untapped source of biocatalysts,” Fungal Divers., vol 54, pp 19–30 33 Tujula N A., Crocetti G R., Burke C., Thomas T., Holmström C., et al (2010) “Variability and abundance of the epiphytic bacterial community associated with a green marine Ulvacean alga,” ISME J., vol 4, no 2, pp 301–311 34 Villarreal-Gómez L (2010) “Antibacterial and anticancer activity of seaweeds and bacteria associated with their surface,” Rev Biol …, vol 45, pp 267–275 40 35 Wahl M., ShahnazL., Dobretsov S., Saha M., Symanowski F., et al (2010) “Ecology of antifouling resistance in the bladder wrack Fucus vesiculosus: Patterns of microfouling and antimicrobial protection,” Mar Ecol Prog Ser., vol 411, pp 33–48 36 Wiencke C (2012) “Seaweed Biology Novel Insights into Ecophysiology and Utilization Ecological Studies, Vol 219 Analysis and Synthesis,” pp 1–508 37 Zheng L., Han X., Chen H., Lin W., Yan X (2005) “Marine bacteria associated with marine macroorganisms: the potential antimicrobial resources,” Ann Microbiol., vol 55, no 2, pp 119–124 38 Zuccaro A., Schoch C L., Spatafora J W., Kohlmeyer J., Draeger S., et al (2008) “Detection and identification of fungi intimately associated with the brown seaweed Fucus serratus,” Appl Environ Microbiol., vol 74, no 4, pp 931–941 39 Flemming H.-C., Murthy P S., Venkatesan R., Cooksey K., Eds (2009) Marine and Industrial Biofouling, vol Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, 2009 41 VI PHỤ LỤC Bảng 6.1 Các chủng vi khuẩn phân lập mẫu rong STT Mẫu rong VP9 Nho CR-sứ CR03 NT01 NT02 Loại VK STT Đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc VK sinh To, tròn bóng, màu da người, mọc lồi Nhỏ, tròn bóng, mầu da người, mọc lồi 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Vàng cam tươi, mép nhăn, mọc dẹt Vàng cam, mép nhăn, lồi Trắng đục, mép nhăn Nâu đất, phớt hồng, To, tròn màu da người, Nhỏ, trắng đục Da cam, bóng, to Vàng tươi Tròn, màu da người, vàng Tròn, màu da người Tròn, màu vàng tươi Vàng cam, tròn khơ, mép viền, màu trắng đục Tròn, trắng đục, nhẵn Phớt hồng Phớt hồng, tròn Màu trắng đục, viền mép, trơn 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 45 36 37 Hồng phớt đỏ, mép tròn Vàng tươi, mép nhăn, khơ Nhỏ, vàng da cam Trắng đục, vơ định hình, khơ, bám Tròn, trơn, màu da người Vàng, nhăn, vơ định hình Trắng đục, nhỏ Hồng, mép Trắng, khô, vô định hình Vàng tươi nhạt, mép nhăn, Trắng vàng, to, vơ định hình Màu da người, tròn, bóng nhớt Màu da người, tròn, bóng, nhớt Trắng vàng, to, mép viền Hồng, nhỏ tròn Vàng Trắng Vàng da người, tròn, trơn Khuẩn lạc ngoại VK nội sinh VK ngoại sinh VK nội sinh VK ngoại sinh VK nội sinh Ngoại sinh Nội sinh 10 11 VK ngoại sinh VK nội sinh VK ngoại 42 sinh VK Nội sinh VP3rong mơ Sargas sum sp ngoại 38 39 40 Vàng, dính, trơn, mép Vàng, trơn, mép Vàng da người, tròn 2 2 5 3 2 2 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 73 74 75 76 77 78 ngoại 79 Cam đỏ, trơn, dính Vàng tươi Cam sẫm màu Trắng đục, trơn Trắng đục, mép nhăn, khô Vàng, mép nhăn Trắng sợi, vơ định hình, đống Màu da người, tròn, trơn Màu trắng, nhỏ Trắng, tròn mép Trắng, mép nhăn Trắng sợi, vơ định hình Màu da người, trơn, bóng Trắng xỉn, mép nhăn Cam tươi, mép trơn, nhẵn Hồng, mép nhăn Trắng hồng, không đồng Trắng đục, trơn ướt, Trắng đục, mép nhăn giống bacillus Màu da người, đồng tâm, mép nhăn Màu da người, lồi, mép tròn Màu vàng chanh, nhỏ tròn Màu hồng,nhỏ Màu trắng sứ, tròn, khơ (xk) Màu trắng đục, nhỏ mép tròn Màu vàng tươi, to, bóng , lồi Màu da cam nhạt, nhỏ lồi Màu phớt hồng, mấu lồi, bóng, tròn Màu vàng tươi, bóng tròn, mép nhăn Màu da người, trong, bóng, to Màu trắng đục, lồi, mép nhăn Màu vàng nhạt, vơ định hình, mép nhăn Màu trắng đục, rắn chắc, đồng tâm Màu vàng nhạt, tròn, bóng Màu nâu đỏ, nhỏ, lồi tròn Màu vàng cam, tròn, bóng, mép trơn Màu vàng nhạt, đồng tâm, mép nhăn Màu trắng trong, tròn bóng Màu trắng đục, mép ngồi trong, tròn lồi Màu da người, mọc dẹt, tròn VK sinh VK nội sinh VP sụn VK ngoại sinh VK nội sinh VP Lauder (LD) VK ngoại sinh VK nội sinh 10 VPG VK sinh ngoại Nội sinh 11 VP 11 VK sinh ngoại VK nội sinh 12 VP12 VK ngoại sinh VK nội sinh 13 VP13 VK ngoại sinh VK nội sinh 14 VP VK 43 sinh VK nội sinh 2 2 2 1 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 Màu đỏ, nhỏ tròn Nâu xỉn, nhỏ tròn Vàng nhạt, nhỏ tròn, lồi Màu da người, to dẹt Màu vàng tươi, nhỏ, tròn mép trơn Màu da cam, đỏ, tròn Màu vàng nhạt, trong, bóng tròn Vàng xỉn, nhỏ lồi đỏ,viền hồng, bóng tròn Trắng đục, lồi Trắng đục, nhỏ, mép trơn Trắng trong, mép nhăn Màu da cam sáng, tròn, bóng, mép trơn Trắng trong, tròn bóng dẹt 1 2 1 94 95 96 97 98 99 100 Hồng, vơ định hình, mép nhăn Trắng trong, tròn, dẹt Da người, nhỏ mọc lồi Trắng đục, vơ định hình ,chắc Da người, tròn, bóng Hồng phân, tròn, nhỏ Màu da người, tròn, mép nhăn, đồng tâm 1 1 101 102 103 104 105 Màu trắng đục, tròn, lồi, mép trơn Màu trắng đục, tròn, mép nhăn Màu trắng, mép nhăn nhiền Cam tươi, Màu trắng đục, to tròn, khơ 1 106 107 Màu trắng, tròn, mép nhăn Màu da người,vơ định hình, mép nhăn VK ngoại sinh VK nội sinh VK ngoại sinh VK nội sinh VK ngoại sinh VK nội sinh VK ngoại sinh 108 109 110 111 112 113 Màu vàng sẫm, nhỏ, tròn Màu hồng pha nâu, mép nhăn, tròn Màu trắng, mờ, tròn mép nhăn Màu vàng nhạt, to, dẹt, mép tròn Màu đỏ sẫm, tròn lồi, nhỏ Màu da người, tròn, nhỏ lồi 114 115 116 117 118 119 Hồng nhạt, vơ định hình Màu da người, mép trong, trơn Màu trắng, mờ, dẹt Hồng phấn trắng, khơ, tròn Màu trắng đục, mép tròn Màu da người, vòng đồng tâm, tròn 15 VP8 VK ngoại sinh VK nội sinh 16 VP VK ngoại sinh VK nội sinh 17 CR9 18 CR8 19 CR7 20 CR6 21 NT10 VK ngoại sinh VK nội sinh VK ngoại sinh VK nội sinh VK ngoại sinh VK ngoại sinh VK nội sinh VK ngoại sinh VK nội sinh VK ngoại sinh VK nội sinh VK ngoại sinh VK nội sinh VK ngoại sinh VK nội sinh 22 NT11 23 NT12 24 NT13 25 NT14 26 NT08 27 NT07 28 NT06 44 29 VP9 30 VP8 VK nội sinh VK ngoại sinh VK nội sinh VK ngoại sinh VK nội sinh 1 1 120 121 122 123 124 Màu cam sẫm, đỏ, lồi Màu da người, tròn mép trơn Màu trắng, trong, vơ định hình Màu nâu, nhỏ tròn Trắng vàng, tròn, mọc lồi 125 Da cam, tròn bóng, lồi Bảng 6.2 Các chủng nấm phân lập mẫu rong khác ST T Ký hiệu mẫu rong VP9 Nho Tên gọi STT nấm Ký hiệu nấm K striatum Rong sứ xanh VP9 -1 VP9 -2 Nho -1 Nho -2 Nho -3 Nho -4 Nho -5 Nho -6 Nho -7 Nho -8 CR sứ-1 CR sứ-2 CR sứ-3 CR sứ-4 Rong nho 10 CR-sứ Rong sứ 11 12 13 14 Loại nấm Loại Ngoại Nội nấm sinh sinh (nấm sợi, nấm men) X nấm men X nấm men X nấm men X nấm men X nấm men X nấm men X nấm men X nấm men X nấm sợi nấm X sợi nấm X men nấm X men nấm X men nấm X men 45 Đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc Trắng đục, to, mép đều, bóng, nhớt Trắng đục, to, mấu Vàng, to, bóng, vơ định hình Trắng đục, to, lồi Trắng, nhỏ Trắng phớt hồng, tròn Hồng, tròn, trơn, bóng Da cam, lồi, tròn bóng Xanh trắng, có mấu lồi Nâu hồng, mặt sau đen trắng đục, to, có mấu Vàng, nhỏ, tròn, bóng Nâu vàng, bóng, mấu Vàng, to, tròn, bóng 15 16 17 CR03 Rong tóc đốt 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 NT01 Rong gai chim 28 29 30 31 32 NT02 Rong câu cước 33 34 35 36 37 CR sứ-5 CR sứ-6 CR sứ-7 CR3 -1 CR3 -2 CR3 CR4 CR5 CR6 CR7 CR8 CR9 CR10 NT1 -1 NT1 -2 NT1 -3 NT1 -4 NT1 -10 NT2 -1 NT2 -2 NT2 -3 NT2 -4 NT2 -5 nấm men nấm men nấm sợi nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men nấm sợi nấm men nấm men nấm men nấm sợi nấm men 46 X X X X X Hồng, to, tròn, trơn mép, mấu Trắng ngà đục, vơ định hình Nâu vàng, nấu đất Trắng đục, to tròn X Vàng tròn, mép Hồng, mép trong, tròn Hồng, tròn bóng, nhỏ Màu da người, tròn X Trắng X Trắng, nhỏ X trắng sữa, vòng nâu X Hồng, lồi bóng mép nhăn trắng sữa, dẹt, vơ định hình Trắng phớt hồng, to, bóng, lồi Màu da người, tròn, bóng Vàng, nhỏ li ti X X X X X X X Trắng đục, nhớt bóng Trắng, sợi to mặt sau trắng Trắng đục, tròn, bóng Màu da người, nhớt X Vàng, bóng, nhỏ X X X Trắng đục X Vàng tươi, tâm trắng 38 39 40 VP3 Mơ nhánh bò 41 42 43 44 45 46 47 48 49 VP sụn Rong sụn 50 51 52 53 VP Lauder (LD) Lauder 54 55 56 10 VPG E.denticulatum Rong sụn gai 57 58 Gel 1.2 Gel 1.1 Gel 1.3 VP3 -1 VP3 -2 VP3 -3 VP3 -4 VP3 -5 VP3 -6 VP3 -7 VP3 -10 VP3 -11 VP sụn1 VP sụn2 VP sụn3 VP sụn4 LD1 LD10 LD11 VPG -1 VPG -2 Xanh thẫm xám, viền trắng Nhỏ, mọc chậm nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi X X Trắng đục, nhỏ nấm sợi X nấm sợi X nấm sợi X nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men X Xanh rêu nhạt Mặt sau viền trắng, xanh Trắng hồn phấn, chấm nâu Mặt sau đỏ hồng Xanh thấm giữa, viền trắng Mặt sau trắng trắng đục 47 X X X Trắng, xốp, mặt sau trắng Xanh rêu xỉn, mặt sau đen sẫm Xanh lục, viền mầu trắng Xanh lơ, mặt sau viền trắng Xanh rêu thẫm X trắng, khuẩn lạc nhỏ X X X X Xanh lơ tươi, X Trắng, tơ X Trắng xốp, cục X Trắng xốp, X Hồng X Trắng sứ X Trắng đục, to, tròn X Da người, trong, nhỏ 59 VPG -3 VPG -4 VPG -5 VPG -6 VPG -7 VP8 -1 VP8 -2 nấm men Nấm sợi nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men X 73 04-2 74 04-3 75 04-4 nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men nấmm en X 72 VP8 -3 VP8 -4 VP8 -5 VP8 -6 VP9 -1 VP9 -2 04-1 76 04-5 77 04-6 78 04-7 Rong đông gai 79 dày 80 NT6 -10 NT6 -11 60 61 62 63 11 VP8 Sụn 64 65 66 67 68 69 12 VP Bắp sú xanh 70 71 13 14 04 NT06 unknown nấm men nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi 48 Da người ,to X sợi trắng, lan rộng X Da cam, nhỏ, tròn X Nâu đen, nhỏ tròn X Trắng, nhỏ, tròn X Vàng da, to, bóng lồi, vòng đồng tâm Vàng phớt hồng, bóng lồi, khơng đồng tâm Trắng sữa, tròn X X Trắng, tròn ,dẹt, đồng tâm, Trắng sữa, dẹt X X Xanh rêu giữa, tròn, lồi Trắng đục, mép đều, bóng nhớt Trắng đục, to, có mấu lồi Vàng da người sẫm, to Vàng da người nhỏ X X X X X Vàng da người, bóng X Vàng ánh hồng, vơ định hình, mặt nhăn Hơi hồng, nhỏ, tròn, bóng Vàng da người, mọc dẹt Trắng vơi, bơng X X X X X Vàng,có tia, dẹt, mặt sau đne Xanh rêu đen, mặt sau đen 15 NT05 Rong nho 81 82 83 84 85 16 NT04 Gai chùm 86 87 88 89 17 VP8 K.alvarezii 90 91 92 93 94 95 96 18 CR04 Rong giác bạch 97 98 99 100 101 102 103 NT5 -1 NT5 -2 NT5 -3 NT5 -4 NT5 -5 NT4 -1 NT4 -2 NT4 -3 NT4 -4 VP8 -1 VP8 -2 VP8 -3 VP8 -4 VP8 -5 VP8 -6 VP8 -9 CR4 -1 CR4 -2 CR4 -3 CR4 -4 CR4 -5 CR4 -8 CR4 -9 nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men nấm sợi nấm sợi nấm men nấm men nấm men nấm men nấm men nấm sợi nấm sợi 49 X Vàng da người to, X Trắng sữa, đục, nhỏ X Vàng, to, tâm hồng, X Trắng vơi, nhỏ, lồi, tròn Nâu đất, tròn, lồi X X Vàng da người, to X Trắng sữa X Trắng sữa, lan vơ định hình Vàng da, đỏ X Vàng da người, to, bóng lồi Vàng hồng, to, bóng, lồi, khơng đồng tâm Trắng sữa, tròn X X X Trắng, tròn dẹt, đồng tâm Trắng sữa, dẹt X X X X Xanh rêu giữa, tròn, lồi Sợi trắng, nhạt, mọc thưa trắng hồng, to, dẹt X Trắng đục, tròn, nhỏ X Vàng tươi, tròn, lồi X Hồng nhạt, tròn, bóng Vàng sẫm, nhỏ X X X Trắng đục, X trắng đục, có tia 19 VP16 Rong quạt úc CR4 -10 nấm sợi 105 nấm sợi nấm sợi nấm men nấm sợi nấm sợi X 109 CR4 -11 VP1 6-10 VP1 6-11 VP1 6-12 Eu-1 110 Eu-2 X 111 K.st 1.1 K.st 2.1 K.st 2.2 VP1 5-1 Mơ1 Mơ2 Mơ3 Mơ4 Mơ5 Mơ6 Mơ7 nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi X Xám, viền trắng, chắc, dày Mặt sau trắng Xám, nhỏ, bóng X Trắng, xốp bơng X Sợi trắng, bào tử xanh lục, mặt sau trắng 106 107 108 20 21 Euche ma Sớn lông Rong gai E.denticulatum Rong sứ xanh K striatum 112 113 22 VP-15 Bắp sú nâu 114 23 Mơ Mơ 115 116 117 118 119 120 121 122 24 25 Padilas p VP3X2 Rong quạt 123 124 Mơ8 P-1 X21 50 X Nâu xanh, vòng trắng + nâu xanh đồngtâm trắng đục ,tròn nhỏ, lồi Trắng phấn, mặt sau trắng Hổng ,bóng, nhớt 104 X X X X Trắng vôi, xốp, mặt sau trắng Hơi xám ,mặt sau đen X Nâu ánh tím, mặt sau da cam, mịn Tím mịn, mặt sau tím sẫm Trắng xốp, mặt sau trắng Vàng tươi, dẹt, mặt sau đỏ Xanh rêu thẫm, vàng ngồi, Trắng bơng, xốp, thưa Trắng ngà vàng, dày X Trắng vàng, mọc dẹt X Trắng ngà, dẹt X Trắng thưa Nhỏ X X X X X X X bông, xốp, 125 Kaxenova sp 138 X22 X23 X24 Mix1 Mix2 CB3 -1 VP3 -1 VP2 -1 Pra1 Pra2 Pra3 Pra4 Pra5 Ka-1 Kappaphycus striatum Rong sứ nâu 139 SN1 140 SN2 141 SN3 142 SN4 143 SN5 144 SN6 145 SN7 146 SN8 126 127 26 Mix 128 129 27 CB-3 130 VP2 K.striatum Sứ nâu E.denticulatum Sụn Gai Sụn 28 VP3 29 30 Pravia Pravia sp 133 131 132 134 135 136 137 31 32 Kaxeno va SN nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi sợi X X Trắng bơng, xốp, lồi cao, vòng đồng tâm Trắng, lan, thưa, bào tử xanh lơ Trắng tuyết, lốm đốm Trắng ngả nâu, xốp, sợi thưa Trắng tuyết, lan, sợi dày Trắng xốp, mọc thưa X trắng xỉn, X Trắng tuyết, Mặt sau trắng Xanh lơ nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi X X X X X X X X X X xốp Trắng nâu giữa, dẹt Nâu, dẹt Vàng tươi Mặt sau vàng, dẹt Nâu + trắng, to, xốp Trắng vôi, nhỏ, lồi nấm sợi nấm sợi nấm sợi X Trắng đục, bào tử xanh Xanh rêu vàng, dẹt Mặt sau nâu sẫm, viền đen Trắng sữa, chắc, lồi X Trắng bông, mọc lan X nấm sợi nấm sợi X Xanh rêu, viền trắng Mặt sau vàng xanh Xám, nhỏ, mặt sau đen Đen, nhỏ, mặt sau đen 51 X X X 147 NNS NNS NNS NNS NNS NNS nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi 153 SX1 nấm sợi X 154 SX3 X 155 SX4 156 SX5 157 SX6 nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi 158 SX20 SX21 SX25 SX26 SXN S-1 SXN S-2 SXN S-7 nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi nấm sợi 148 149 150 151 152 33 SX Kappaphycus striatum Sứ xanh 159 160 161 162 163 164 52 X Trắng/nâu, xốp X X Xanh lơ, nhỏ, Mặt sau trắng Trắng, bào tử đen, thưa Mặt sau trắng Bào tử xanh rêu tối, dày Mặt sau trắng Bào tử xanh rêu tươi, dày Mặt sau trắng Vàng sáng, Bào tử nâu Mặt sau vàng tươi Trắng mờ, xốp, to mọc lan Mặt sau trắng Xanh rêu, viền trắng, mặt sau xanh/vàng Nâu nhạt, lồi X Trắng kem, vàng X X Sợi trắng, btử xanh rêu Mặt sau trắng Trắng X Trắng, già ngả vàng X Xanh vàng Mặt sau vàng Xanh rêu xỉn, mặt sau vàng Sợi trắng, bào tử xanh Mặt sau trắng Trắng, bào tử đen, thưa Mặt sau trắng Trắng xốp, mọc lan Mặt sau đen X X X X X X X X Hình 6.1 Xử lý trình tự 18S rDNA nấm HN37 HN22 phần mềm Bioedit Hình 6.2 Hình ảnh sử dụng Mega7 để so sánh (Alignment)các trình tự HN37 với trình tự 18S rDNA lựa chọn, sử dụng phần mềm ClustalX 53 ... nhóm Bacillus, Vibrio, Microbacterium Psychrobacter [15] Trong nghiên cứu khác tác giả Mahadevan cs (2 013) tìm thấy 10 lồi vi khuẩn phân lập từ rong Ulva reticulata Trong số đó, lồi Bacillus sp... nghiệp (agar, carrageenan) hay alginate, fucoidan (một loại polysaccharide dùng điều trị ung thư) [13] Ở Việt Nam giới, nhiều loài rong biển ứng dụng y dược để chữa bệnh với vai trò kháng khuẩn,... Rhodobacteraceae, Thalassomonas, Parvularcula Số lượng OTU vi khuẩn rong bệnh 364, nhiều so với rong khỏe 133 Có tới 19 họ/chi phát với hàng trăm OTU khác nhau, chứng tỏ đa dạng vi sinh vật rong cao Rong