Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đốn Việt Nam Phạm Hùng Vân Phó phòng thí nghiệm Y Sinh ĐHYD Chủ nhiệm BM Kỹ Thuật Y Học Viện VSYT Công Cộng Trưởng Khoa Vi Sinh BV Nguyễn Tri Phương Thành Viên ANSORP (Asian Network for Surveillance of Resistant Pathogens) Từ yêu cầu thực tế • Phải có xét nghiệm hữu dụng lâm sàng chẩn đoán, giúp định điều trị, theo dõi điều trị nhiều bệnh lý nhiễm trùng • Tiến đặc biệt điều trị ung thư điều trị đích cần phải có xét nghiệm pharmacogenetic • Cần phải có xét nghiệm xác định bệnh lý di truyền đưa vào chẩn đoán tiền sanh, tham vấn tiền hôn nhân để nâng cao chât lượng dân số, tránh gánh nặng xã hội • Nhu cầu xét nghiệm dấu vân tay di truyền pháp y, y học thể thao Thực tế đòi hỏi phải có thêm tiếp cận mới, có tiếp cận sinh học phân tử Sinh học phân tử áp dụng chẩn đoán phát tác nhân VSV gây nhiễm trùng NHIỄM VIÊM GAN SIÊU VI C (HCV) Schering-Plough Giải pháp toàn diện cho xét nghiệm sinh học phân tử cho viêm gan C RT-qPCR định lượng HCV-RNA Định lượng HCV genotype Định genotype HCV Tuần 12 (4) Định lượng RT-qPCR định lượng HCV-RNA Giảm log10 hay âm tính HCV-RNA Khơng giảm log10 Cân nhắc ngưng điều trị Genotype - Điều trị 48 tuần Genotype non-1 Điều trị 24 tuần (2002 NIH Consensus Conference) RT-PCR phát HCV-RNA Cuối điều trị HCV-RNA Theo dõi sau tháng HCV-RNA HCV RNA (+) Không đáp ứng HCV RNA (+) Tái phát HCV RNA (-) Đáp ứng NA đích dành cho chẩn đốn sinh học phân tử lựa chọn 5’-NC nhờ có trình tự bảo tồn, dễ cho thiết kế xét nghiệm độ nhạy cao Giải pháp gói xét nghiệm định lượng xác định genotype HCV độc đáo mặt kỹ thuật , hữu dụng lâm sàng, giá thành rẽ nên đưa vào áp dụng dễ dàng Phân bố genotype HCV 2000 mẫu huyết bệnh nhân nhiễm HCV gửi đến xét nghiệm phòng thí nghiệm NK-Biotek năm 2008 Cơng ty Nam Khoa triển khai giải trình tự vùng NS5B để tránh nhầm lẫn số genotype thành genotype Very high prevalence of HCV genotype variants in Southern Vietnam : large scale survey based on sequence determination Van Hung Pham, An Duc Xuyen Vo Dien Vu Banh, Ling Lu and Kenji Abe Emerging Infectious Diseases (submitted) IL28B SNP rs12979860: INTERFERON switch  Chromosome 19  Điều biến đáp ứng interferon  CC haplotype (CC-ON): o o o CC-ON Đáp ứng với interferon 60-80% Khả đáp ứng thuốc tiến triển mạn tính thấp 1/2 so voi kiểu CT (Ge et al., Thomas et al.) Gặp nhiều bn nhiễm genotype  CT haplotype (CC-OFF): o o Đáp ứng với interferon 30-40% Khả kháng thuốc tiến triển mạn tính thấp cao gấp đơi kiểu CC (Ge et al., Thomas et al.) CC-OFF Ưu điểm xét nghiệm STR Nhờ dựa kỹ thuật PCR, xét nghiệm STR có ưu điểm không cần phải có lượng mẫu thử nhiều, cần mẫu thử tế bào, hay chí dấu vết DNA làm xét nghiệm Ứng dụng xét nghiệm dấu ấn DNA Phát quan hệ huyết thống (RFLP, STR) Truy tầm thủ phạm qua dấu vết DNA để lại trường (STR) Truy tầm tung tích nạn nhân qua dấu vết DNA để lại trêbn di thể (xác chết phân huỷ tìm thấy được, xác chết tai nạn máy bay-hoả hoạn ) (STR) Phân tích kết kiểu hình 12 STR loci LOCUS D2 D3 D4 Máu toàn phần H (nam) Mảnh vải quần bé X D18S51 286-336 311.06; 314.80 311.06; 314.80 TH001 159-199 170.81; 178.85 170.81; 178.85 Amelogemin 104-111 104.89; 110.74 104.89; 110.74 D7S820 214-250 237.62; 241.64 237.62; 241.64 D13S137 173-213 185.27; 193.34 185.27; 193.34 D16S539 264-309 284.12; 292.22 284.12; 292.22 Penta E 337-481 418.84; 424.06 418.84; 424.06 D3S1358 112-152 128.46; 140.97 128.46; 140.97 D8S1179 206-266 237.81 237.81 CSF1PO 316-356 336.10; 348.17 336.10; 348.17 TPOX 260-292 271.78; 283.86 271.78; 283.86 Penta D 369-449 404.93; 414.64 404.93; 414.64 DVT DNA tinh trùng / mảnh vải quần bé X # DVT DNA /máu H : ~ 99.99999157% Vào tháng năm 1991, Vancouver, British Columbia, Canada; người đàn bà 29 tuổi tìm thấy bò giết chết xác bò đốt cháy đen gần thành than mà nhận diện DNA thi thể thu thập từ tro xác chết Tuy nhiên nhờ chút kiện may mắn có nhờ làm việc tốt cảnh sát, người ta tìm người đàn ông bò nghi ngờ thủ phạm Khám nhà người này, phát thấy có dấu máu khô dính xe quần áo ta can xăng trống rỗng Xét nghiệm dấu ấn DNA từ vệt máu, người ta xác đònh từ máu ta Vấn đề để có DNA trích từ di thể nạn nhân Sau xem xét phần hàm di thể, người ta tìm thấy vài khôn không bò cháy nhờ hàm bảo vệ Chính từ mẫu khôn này, nhà khoa học hình trích DNA, nhờ làm xét nghiệm phát dấu ấn DNA nạn nhân Kết cho thấy dấu ấn DNA hoàn toàn trùng khớp với dấu ấn DNA từ mẫu máu tìm xe thủ Cuối thủ phải nhận tội giết người TY THỂ Xét nghiệm giải trình tự vòng D DNA ty thể Ty thể nằm tế bào chất, DNA ty thể di truyền qua hệ qua mẹ DNA ty thể có vò trí vòng D, có trình tự thay đổi qua hệ Do dựa vào trình tự DNA vòng D này, tìm mối quan hệ huyết thống Đối chiếu kết giải trình tự Ưu điểm xét nghiệm DNA ty thể Xét nghiệm DNA ty thể dùng nhận diện hài cốt lâu năm DNA ty thể diện nhiều tuỷ hài cốt phần chúng bảo vệ, phần tế bào có nhiều ty thể, số lượng DNA ty thể tế bào có nhiều nên khó thể bò phân huỷ hết Tìm hài cốt Nga Hoàng Nicolas đệ nhò bò giết chết sau cách mạng tháng 10 Nga nhờ phát trình tự vòng D ty thể hài cốt chôn bìa rừng nơi cho hành gia đình nhà vua, trình tự trùng với trình tự vòng D ty thể người thân thuộc, hài cốt hoàng hậu có thân thuộc với nữ hoàng Victoria bên Anh quốc Nhận diện hài cốt lính Mỹ chết trận Việt Nam Nhận diện hài cốt liệt só Việt Nam Xét nghiệm xác định hài cốt cần mẫu người thân ai? Xét nghiệm giúp xác định hai người dòng mẹ? Xét nghiệm giúp xác định hai người dòng cha? Kết luận • Sinh học phân tử ngày có nhiều ứng dụng thực tiễn chẩn đóan điều trị • Các phương pháp tiếp cân khơng phải q khó trang thiết bị khơng phải q đắt tiền • Vấn đề yếu là: (1) phải có người có khả xây dựng kỹ thuật tổ chức phòng thí nghiệm, (2) nhà lâm sàng phải có đầy đủ tri thức để ứng dụng ... xét nghiệm dấu vân tay di truyền pháp y, y học thể thao Thực tế đòi hỏi phải có thêm tiếp cận mới, có tiếp cận sinh học phân tử Sinh học phân tử áp dụng chẩn đoán phát tác nhân VSV gây nhiễm... nghiệm với phương pháp vi sinh truyền thống phòng xét nghiệm lâm sàng chưa có an toàn cấp độ (H5N1, H1N1, SARS, tác nhân khủng bố sinh học)  Xét nghiệm sinh học phân tử áp dụng ung thư NSCLC (Non... SNP: o Nếu CC đáp ứng tốt, CT đáp ứng có nguy khơng tốt o Mẫu thử cần quệt niêm mạc má NHIỄM VIÊM GAN SIÊU VI B (HBV) WHO 2001 Giải pháp toàn diện cho xét nghiệm sinh học phân tử cho viêm gan B